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문제 정의
- DPPH 라디칼에 대한 소거능력이 일반적인 항산화 특성을 보여주는 것에 반하여 티로시나아제의 활성억제는 피부의 미백효과와 밀접한 연관성을 갖는다. 따라서 효소에 의하여 가수분해된 세리신이 실제 이와 같은 미백 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 티로시나아제의 활성 억제 효과를 살펴보았다(Figure 6). 당초 저분자 세리신에서 보다 우수한 티로시나아제 활성 억제효과를 기대하였으나 실제로는 원래 세리신(HS)의 활성 억제 효과가 더 우수하게 나타났다.
- 본 연구는 열수추출법에 의하여 추출한 세리신을 1종의 효소 또는 2종의 효소를 복합적으로 사용하여 가수분해하고 그 가수분해물의 항산화능을 검토하고자 한다. 또한 분자량 대역별 분획을 통하여 항산화능이 보다 우수한 세리신을 동정하고자 한다.
- 본 연구는 열수추출법에 의하여 추출한 세리신을 1종의 효소 또는 2종의 효소를 복합적으로 사용하여 가수분해하고 그 가수분해물의 항산화능을 검토하고자 한다. 또한 분자량 대역별 분획을 통하여 항산화능이 보다 우수한 세리신을 동정하고자 한다.
제안 방법
- 초기 효소의 선별과정에서는 효소를 세리신 대비 1 %의 양을 첨가하여 가수분해를 시행하였다. Alcalase, flavourzyme 및 protamex를 이용한 실험에서는 azocasein 분해 시 15 min 동안 흡광도를 1 증가시키는데 필요한 효소의 양을 기준으로 하여 효소의 첨가량을 조절하였다. 그 결과 세리신 1 g당 alcalase는 10 µL, flavourzyme은 80 mg, 그리고 protamax는 10 mg를 첨가하였다.
- 그 결과 세리신 1 g당 alcalase는 10 µL, flavourzyme은 80 mg, 그리고 protamax는 10 mg를 첨가하였다.
- 누에고치 2 g과 증류수만 이용하여 욕비 1 : 20으로 고온고압(120 ℃, 98 kPa)상태에서 1 h 동안 처리하여 세리신 수용액을 얻었으며, 세리신 수용액의 농도가 최종 1 %가 되도록 증류수를 첨가하였다. 초기 효소의 선별과정에서는 효소를 세리신 대비 1 %의 양을 첨가하여 가수분해를 시행하였다.
- 단독 또는 2종의 효소를 이용하여 가수분해한 세리신의 항산화능을 DPPH 라디칼에 대한 소거능으로 평가하였다. Figure 5에서 보듯이 단독의 경우 protamex로 분해된 세리신의 항산화능이 더 우수한 것으로 나타났다.
- 비록 세리신 가수분해물의 티로시나아제에 대한 활성 효과가 낮게 나타났지만, 세리신 가수분해물에 존재하는 다양한 단백질 중 보다 효과적인 단백질을 찾기 위하여 각 가수분해물의 분획을 Figure 7과 같이 실시하였다. 단백질이 검출되는 시점부터 4 mL씩 각각 3분획하여 항산화능을 살펴보았다. 각 분획의 분자량은 분획 1이 33 ~59 kDa, 분획 2는 18 ~ 33 kDa, 그리고 분획 3은 10 ~18 kDa이였다.
- Figure 1에서 보는 바와 같이 열수추출 세리신(HS)는 약 66 kDa 정도의 분자량을 갖는데 반하여 효소로 가수분해한 세리신의 경우 상당히 저분자화 되었음을 알 수 있다. 사용한 효소 중에는 alcalase, flavourzyme 그리고 protamex가 neutrase나 bromelain에 비하여 가수 분해 정도가 더 많이 일어났음을 알 수 있었으며, 향후 실험에서는 alcalase, flavourzyme, 그리고 protamex의 3종의 효소만을 이용하였다.
- 세 효소의 세리신에 대한 가수분해능력을 평가하기 위하여 효소의 첨가량을 azocazein을 분해하는 능력을 기준으로 통일하였다. Figure 2에서 보듯이 flavourzyme이 가수분해능력이 가장 우수하고 protamex가 가장 떨어졌다.
- 세리신 및 그 가수분해물의 분자량은 각각의 세리신 수용액을 8 M urea 수용액과 1 : 1로 혼합하여 최종 4 M urea 수용액을 이동상으로 하여 겔여과 측정법으로 측정하였다. 컬럼은 Superdex 75 (GE Healthcare, USA)를 이용하였으며 유속은 0.
- 세리신의 가수분해에 적합한 효소를 선별하기 위하여 총 5종의 효소에 대하여 가수분해를 실시하고 분자량을 측정하였다. Figure 1에서 보는 바와 같이 열수추출 세리신(HS)는 약 66 kDa 정도의 분자량을 갖는데 반하여 효소로 가수분해한 세리신의 경우 상당히 저분자화 되었음을 알 수 있다.
- 세리신의 항산화능은 DPPH 라디칼의 소거능으로 판단하였다. DPPH를 에탄올에 녹여 농도가 0.
- 세리신이 가수분해된 정도를 알아보기 위하여 10배 희석시킨 200 µL의 세리신 수용액과 200 µL의 ninhydrin reagent를 혼합하고 15 min 동안 100 ℃에서 반응시킨 후, 15 min 동안 ice water에서 냉각시켰다.
- 은 세리신이 첨가되지 않았을 때의 흡광도이다. 한편 세리신 수용액 자체의 흡광도를 고려하여 517 nm에서의 세리신 수용액 흡광도를 측정하여 각각의 시료별로 그 값을 보정해주었다. 기존 항산화제와 비교를 위하여 알부틴(arbutin) 10 mg/mL을 이용하였다.
대상 데이터
- 누에고치는 월드웨이(주)(Korea)에서 제공받았으며 사용된 효소는 모두 Novozyme (Denmark)에서 구입하였다. 3,4-Dihydroxy-L-phenyl-alanine (DPPH), ninhydrin solution, tyrosinase, arbutin, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DOPA) 및 그 외 시약들은 모두 Sigma Aldrich (USA)에서 구매하였다.
- 한편 세리신 수용액 자체의 흡광도를 고려하여 517 nm에서의 세리신 수용액 흡광도를 측정하여 각각의 시료별로 그 값을 보정해주었다. 기존 항산화제와 비교를 위하여 알부틴(arbutin) 10 mg/mL을 이용하였다.
- 누에고치는 월드웨이(주)(Korea)에서 제공받았으며 사용된 효소는 모두 Novozyme (Denmark)에서 구입하였다. 3,4-Dihydroxy-L-phenyl-alanine (DPPH), ninhydrin solution, tyrosinase, arbutin, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DOPA) 및 그 외 시약들은 모두 Sigma Aldrich (USA)에서 구매하였다.
성능/효과
- 단일 효소를 이용한 경우에 있어서는 분획전과 유사하게 protamex와 flavourzyme으로 분해한 세리신이 보다 나은 억제효과를 가졌으며 alcalase로 분해한 경우가 가장 좋지 않았다. Flavourzyme으로 분해한 세리신의 분획 중에서는 상대적으로 고분자량인 F1이 가장 우수한 억제효과를 보였으며, alcalase와 protamex 의 경우에 있어서는 저분자량이 우수한 억제효과를 보였다. 그러나 각 분획별 존재하는 단백질의 양이 상이하므로 단백질 함량에 따른 억제효과를 살펴본 결과 F2와 P3이 다른 분획에 비하여 우수한 억제효과를 나타내었다.
- 2종의 효소를 이용하여 분해하는 경우에는 각 효소의 특징이 복합적으로 나타났다. Flavourzyme이 포함되는 경우에는 약 11 kDa에 해당하는 피크가 관찰되었으며 protamex가 포함된 경우에서는 33 ~ 41 kDa에 해당하는 특이적 피크가 나타났다. Alcalase가 포함된 경우에 있어서는 20 ~ 27 kDa에 해당하는 alcalase에 의해 가수분해된 세리신의 특징이 나타났다.
- Flavourzyme으로 분해한 세리신의 분획 중에서는 상대적으로 고분자량인 F1이 가장 우수한 억제효과를 보였으며, alcalase와 protamex 의 경우에 있어서는 저분자량이 우수한 억제효과를 보였다. 그러나 각 분획별 존재하는 단백질의 양이 상이하므로 단백질 함량에 따른 억제효과를 살펴본 결과 F2와 P3이 다른 분획에 비하여 우수한 억제효과를 나타내었다. 특히 F2의 경우에 있어서는 월등히 좋은 억제효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- Flavourzyme의 경우 다른 효소와 달리 상당히 넓은 분자량 분포를 나타내었으며 11 kDa에서의 피크가 높은 것이 특징이다. 또한 앞서 언급한 것처럼 flavourzyme내에 포함된 exopeptidase에 의하여 분해된 유리 아미노산으로 추정되는 물질의 피크가 컬럼의 분해능을 초과하는 약 23 mL에서 나타났다. Protamex에 의한 가수분해의 경우에는 분자량이 13 ~66 kDa이지만 41, 37 그리고 33 kDa의 세리신 분자가 강하게 나타나는 것으로 보아 저하 효과가 크지 않은 것으로 판단되는데 이는 앞선 N말단 분석 결과와 일치한다.
- 효소를 이용한 세리신의 가수분해를 시도한 결과 사용한 5가지 효소 중에 alcalase, flavourzyme, 그리고 protamex가 우수한 분해능력을 나타내었다. 이들 효소를 이용하여 단독 또는 2종의 효소를 같이 사용하여 세리신을 분해한 결과 분자량이 약 20 ~ 30 kDa으로 감소함을 확인하였다. 가수분해된 세리신의 DPPH 라디칼 소거능은 가수분해 전세리신에 비하여 향상되었으며 이는 항산화능이 우수한 아미노산이 단백질의 표면으로 도출된 결과라고 생각된다.
- 특히 F2의 경우에 있어서는 월등히 좋은 억제효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 한편 2종의 효소를 이용하여 분해한 세리신의 경우 분획간 유의성 있는 차이점이 나타나지는 않았으나 대체로 저분자량인 AF3, AP3그리고 FP3의 억제효과가 좋게 나타났다. 단백질 함량을 고려한 경우에는 AF2, AP3, FP2가 우수한 억제효과를 보였는데 이는 단독 효소의 경우에서 우수한 효과를 나타낸 F2와 P3의 분획이 함유되어 있기 때문인 것으로 판단된다.
- 가수분해된 세리신의 DPPH 라디칼 소거능은 가수분해 전세리신에 비하여 향상되었으며 이는 항산화능이 우수한 아미노산이 단백질의 표면으로 도출된 결과라고 생각된다. 한편 티로시나아제의 활성 억제 평가에서는 오히려 가수분해된 세리신이 낮은 억제효과를 나타내었는데 이는 단백질의 표면으로 노출된 티로신이 산화되어 더 이상 DOPA와의 경쟁관계를 유지하지 못하여 나타난 결과라고 판단된다. 그러나 세리신 가수분해물을 분획하여 실험한 결과 F2와 P3 분획이 상대적으로 우수한 억제효과를 나타내어 이들 분획에 대한 추가적인 연구가 진행된다면 미백효과가 우수한 단백질을 찾아낼 수 있을 것이라고 판단된다.
- 당초 저분자 세리신에서 보다 우수한 티로시나아제 활성 억제효과를 기대하였으나 실제로는 원래 세리신(HS)의 활성 억제 효과가 더 우수하게 나타났다. 효소 가수분해한 세리신 중에서는 단독의 경우 flavourzyme이 상대적으로 좋은 억제 효과를 나타내었으며 2종의 효소를 처리한 경우에는 flavourzyme과 protamex로 분해한 세리신이 보다 좋은 효과를 나타내었다. 최근 Kang 등과 Anghileri 등은 티로시나아제가 피브로인과 세리신에 존재하는 티로신 잔기를 산화시킬 수 있음을 보고하였다[15,16].
- 효소를 이용한 세리신의 가수분해를 시도한 결과 사용한 5가지 효소 중에 alcalase, flavourzyme, 그리고 protamex가 우수한 분해능력을 나타내었다. 이들 효소를 이용하여 단독 또는 2종의 효소를 같이 사용하여 세리신을 분해한 결과 분자량이 약 20 ~ 30 kDa으로 감소함을 확인하였다.
후속연구
- 한편 티로시나아제의 활성 억제 평가에서는 오히려 가수분해된 세리신이 낮은 억제효과를 나타내었는데 이는 단백질의 표면으로 노출된 티로신이 산화되어 더 이상 DOPA와의 경쟁관계를 유지하지 못하여 나타난 결과라고 판단된다. 그러나 세리신 가수분해물을 분획하여 실험한 결과 F2와 P3 분획이 상대적으로 우수한 억제효과를 나타내어 이들 분획에 대한 추가적인 연구가 진행된다면 미백효과가 우수한 단백질을 찾아낼 수 있을 것이라고 판단된다.
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