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문제 정의
- 그러므로 과채류 유산균 발효액은 김치 발효액에 비해 연구도 상대적으로 적고 그 효과도 높을 가능성이 있으므로 연구할 필요성이 높다고 판단하였다. 따라서 본 연구에서는 과일과 채소 발효 시 생성되는 유산균의 종류를 확인하고 유기산 농도, 내산성과 항균 효과를 확인하고 산란계의 사료에 첨가하여 공급하였을 때 계란의 품질에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 각각의 처리구에서 시료를 취한 다음 계란의 껍질의 중앙부위를 1 cm 길이로 잘라 plate위에 올려놓고 probe 를 20mm/s의 속도로 표면에 다가갈 때 파괴강도를 측정하였다. 난각 두께는 Haugh unit을 측정한 후 난백 등의 불순물을 제거한 후 50。(2에서 24시간 동안 건조한 후 난각의 깨진 끝부분, 둥근 끝부분(둔단부위) 및 중간 부분 중에서 무작위로 정한 2 지점을 포함한 총 4 지점을 선택하여 두께를 버니어 캘리퍼스로 측정하여 평균값으로 결정하였다[Kim, 2002],
- 5, 3, 6%) 자체를 샘플로 사용하였다. Paper disH sample 5 μL를 넣고, sample이 gel내로 충분히 확산되도록 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후 disk를 중심으로 형성된 clearing zone의 직경을 측정함으로써 샘플의 항균 활성을 비교 확인하였다.
- Kobayashi[1985] 및 Sim 등의[1995] 방법에 따라 과채 발효액에 함유된 개별 유산균의 내산성을 측정하였다. Pepsin이 1000 unit/mL 첨가된 MRS 액체 배지를 pH 2.0, 3.0와 4.0의 산성 조건으로 제조한 후 37℃에서 I시간 동안 각각의 산성 배지에서 과채 발효액에 존재하는 개별 유산균을 배양한 후 각각의 유산균의 생존율을 희석 평판법으로 계수하여 조사하였다.
- ) coli 또는 Salmonella sp.를 희석하여 접종한 후 37。。에서 48시간 동안 배양한 후 균의 증식 유무를 배지의 혼탁 유무로 확인하여 세균이 증식하지 않은 농도를 최저 발육억제 농도로 결정하였다.
- coli 을 사용하였고, 이 선발균주 1%를 Tiyptic soy broth(TSB) 액체배지에서 24시간 배양한 배양액을 사용하여 paper disk methods로 측정하였다. 각각의 유산균을 3일 동안 배양한 배양액과 과채 발효액(산함량 1.5, 3, 6%) 자체를 샘플로 사용하였다. Paper disH sample 5 μL를 넣고, sample이 gel내로 충분히 확산되도록 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후 disk를 중심으로 형성된 clearing zone의 직경을 측정함으로써 샘플의 항균 활성을 비교 확인하였다.
- 난각 강도는 5 mm의 원형 probe가 부착된 물성 측정기 (TA-XT2, England)를 이용하여 단단함(firmness) 을 측정하였다. 각각의 처리구에서 시료를 취한 다음 계란의 껍질의 중앙부위를 1 cm 길이로 잘라 plate위에 올려놓고 probe 를 20mm/s의 속도로 표면에 다가갈 때 파괴강도를 측정하였다. 난각 두께는 Haugh unit을 측정한 후 난백 등의 불순물을 제거한 후 50。(2에서 24시간 동안 건조한 후 난각의 깨진 끝부분, 둥근 끝부분(둔단부위) 및 중간 부분 중에서 무작위로 정한 2 지점을 포함한 총 4 지점을 선택하여 두께를 버니어 캘리퍼스로 측정하여 평균값으로 결정하였다[Kim, 2002],
- 탈취력 측정. 과채발효액 완제품을 400배 희석한 후 희석액의 탈취력을 검증하였다. 악취원은 암모니아, 황화수소를 각각 25, 50ppm으로 하였다.
- 난각 두께 및 강도. 난각 강도는 5 mm의 원형 probe가 부착된 물성 측정기 (TA-XT2, England)를 이용하여 단단함(firmness) 을 측정하였다. 각각의 처리구에서 시료를 취한 다음 계란의 껍질의 중앙부위를 1 cm 길이로 잘라 plate위에 올려놓고 probe 를 20mm/s의 속도로 표면에 다가갈 때 파괴강도를 측정하였다.
- 난황 콜레스테롤 농도 측정. 난황에서 총지방을 Folch 등의 [1956] 방법을 변형시킨 Washbum과 Nix 빙-법으로[1974] 추출한 후 추출한 지방 내에 함유되어 있는 콜레스테롤의 함량을 Zlatkis 방법에 [1953] 의해서 측정하였다.
- 1% 수준으로 첨가한 사료를 공급한 것을 실험군으로 하였다. 대조군은 산란계에게 사료에 과채발효액 대신 물을 0.1% 첨가하여 주었다. 산란계에서 주령별로 계란 품질, 산란율 사료 요구율을 조사하였다.
- 전기영동 gel내 유전자변성 시약의 농도 구배를조절함으로서 전기영동 밴드가 중첩됨이 없이 뚜렷하게 나오도록 변성시약의 최적 농도를 결정하였다. 분리 정제한 16S rDNA는(주)솔젠트(유성, 대전)의 DNA Sequencing Laboratory 에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열 분석하였다.
- 사료 요구율은 사료를 준 후 남은 양을 24시간 후에 사료를 수거하여 잔량을 체크하였다. 사료 요구율은 산란계의 사료 섭취에 따른 산란 효과를 비교하여 사료의 영양적 가치를 검증할 수 있는 방법으로 수당 1일 사료 섭취량(g)을 1일 산란 중량(g)으로 나누어 아래와 같은 공식으로 계산하였다. 산란량은 실험기 간(28일)X 산란율 (%)x 평균계 란중량(g)/실험기 간(28일)로계산하였다.
- 1% 첨가하여 주었다. 산란계에서 주령별로 계란 품질, 산란율 사료 요구율을 조사하였다. 사료 요구율은 사료를 준 후 남은 양을 24시간 후에 사료를 수거하여 잔량을 체크하였다.
- 사료 요구율은 산란계의 사료 섭취에 따른 산란 효과를 비교하여 사료의 영양적 가치를 검증할 수 있는 방법으로 수당 1일 사료 섭취량(g)을 1일 산란 중량(g)으로 나누어 아래와 같은 공식으로 계산하였다. 산란량은 실험기 간(28일)X 산란율 (%)x 평균계 란중량(g)/실험기 간(28일)로계산하였다.
- 1차 발효된 혼합물을 1차 여과(실크 천으로 자연 여과)하여 발효액(수득량 60%)을 분리하였다. 상기 분리된 발효액을 30=2℃(2의 숙성조에 넣어 동안 숙성시킨 후, 숙성된 발효액을 0.22 미크롬 여과지 또는 0.22 미크롬의 filter를 가진 여과장치를 이용하여 2차 여과하여 발효액에서 불순물을 제거하였다. 2차 발효액의 발효시간을 30일 연장하면 유기산의 농도가 1% 정도씩 증가하였고 발효기간을 최대 90일까지 연장시켰다.
- 유기산인 사과산, 시트르산, 푸마릭산(Sigma, St. Louis, MO) 을 MRS 배지에 분주하여 최종 농도가 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1%의 농도가 되도록 만들었다. 여기에 Escherichia (E.
- 과채발효액 및 함유 유산균의 항균력. 유산균과 과채 발효액의 항균 효과를 paper disk 방법으로 위해균(E. coli, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, S. gallinarium)^ 대해서 과채 발효액에 함유된 유산균들과 유기산에 의한 항균효과를 조사였다. 과채발효액에 함유된 유산균 자체에 대해서 조사하였을 때 L.
- 유산균은 분자생물학적인 방법인 polymerase chain reaction(PCR)-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 기법으로 구축하였다. 유산균을 포함한 모든 균은 proteinase/cetyl trimethyammonium bromide(CTAB) 빙법을 이용하여 균의 chromosomal DNA를 순수 분리한 후 계통분류 학적으로 고유한 특성을 갖는 16S rRNA를 PCR로 증폭시켰으며 이때 사용한 primer는 다음과 같았다. bacterial 16S forward primer: S'-CCGAATTCGrCGACAACAGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'; bacterial I6S reverse primer: 5-CCCGGGATCCAA GCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3, 이었다.
- 여러 유산균으로부터 생성되는 PCR 조각의 크기가 거의 유사할 것으로 예상되므로 각각의 균주에서 얻어지는 PCR 조각을 서로 분리해낼 필요가 있으며, 이는 denatured gradient gel electrophoresis (DGGE) 방법을 통해 DNA 조각을 염기서열의 차이에 따라 서로 분리하였다. 전기영동 gel내 유전자변성 시약의 농도 구배를조절함으로서 전기영동 밴드가 중첩됨이 없이 뚜렷하게 나오도록 변성시약의 최적 농도를 결정하였다. 분리 정제한 16S rDNA는(주)솔젠트(유성, 대전)의 DNA Sequencing Laboratory 에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열 분석하였다.
- 과채발효액 제조. 청과시장에서 7종의 과일 또는 채소인 사과 10%(w/w), 파인애플 10%(w/w), 토마토 10%(w/w), 오렌지 7%(w/w), 바나나 10%(w/w), 포도 10%(w/w), 양배추 8%(w/w) 와 양파 2%(w/w)를 구매하여 세척한 후, 일괄 또는 각각 파쇄하였다. 파쇄된 과일에 설탕 20%(w/w) 및 꿀 3%(w/w)을 첨가하여 혼합하였다.
- 악취원은 암모니아, 황화수소를 각각 25, 50ppm으로 하였다. 코르크 마개로 밀봉한 시험관에 악취 원을 각각 주사기로 주입한 뒤 400배 희석된 배양액 10 mL 또는 대조군으로 물을 주입 하고 병을 10분 간격으로 흔들어 주었으며 0, 30, 60, 120, 240분의 암모니아와 황화수소 농도를 GV-100S형 진공식 기체채취기(가스텍, 서울)로 가스를 채취하여 검지센서로 측정하였다.
- 청과시장에서 7종의 과일 또는 채소인 사과 10%(w/w), 파인애플 10%(w/w), 토마토 10%(w/w), 오렌지 7%(w/w), 바나나 10%(w/w), 포도 10%(w/w), 양배추 8%(w/w) 와 양파 2%(w/w)를 구매하여 세척한 후, 일괄 또는 각각 파쇄하였다. 파쇄된 과일에 설탕 20%(w/w) 및 꿀 3%(w/w)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합물은 발효조(100 L 스텐레스 통)를 35℃ 를 유지하도록 장치한 방에 인큐베이터형식으로 절연이 되도록 제작한 곳에 넣고 30 내지 35。(2의 온도로 유지하면서 40일 동안 1차 발효시켰다.
대상 데이터
- 45 pm membrane filter로 여과한 여액 20μL를 HPLC(Waters, Germany)로 분석하였다. Columne μ- Bondapak C18(3.9mmx300mm, Waters)을 사용하였으며 용매는 0.1 M ammonium dihydrogenphosphate과 phosphoric acid (pH 2.5>의 혼합용액, 이동속도는 ImL/min, 오븐 온도는 40℃ 이었고 UV detector로 214nm에서 검출하였다.
- 생균사료를 이용한 산란계 사육 및 계란의 품질. 경기도 화성시 비봉면에 소재한 산란계 농장에서 산란계에게 순수 과채 발효액(산함량 3%; (주)코림 바이오, 화성)을 0.1% 수준으로 첨가한 사료를 공급한 것을 실험군으로 하였다. 대조군은 산란계에게 사료에 과채발효액 대신 물을 0.
- 유산균 및 과채발효액의 항균성 측정. 시험균주로는 위해 균인 Staphylococcus aureus, Salmonella (S.) gallinarium, Listeria monocytogenes, S. typhimurium, E. coli 을 사용하였고, 이 선발균주 1%를 Tiyptic soy broth(TSB) 액체배지에서 24시간 배양한 배양액을 사용하여 paper disk methods로 측정하였다. 각각의 유산균을 3일 동안 배양한 배양액과 과채 발효액(산함량 1.
- 과채발효액 완제품을 400배 희석한 후 희석액의 탈취력을 검증하였다. 악취원은 암모니아, 황화수소를 각각 25, 50ppm으로 하였다. 코르크 마개로 밀봉한 시험관에 악취 원을 각각 주사기로 주입한 뒤 400배 희석된 배양액 10 mL 또는 대조군으로 물을 주입 하고 병을 10분 간격으로 흔들어 주었으며 0, 30, 60, 120, 240분의 암모니아와 황화수소 농도를 GV-100S형 진공식 기체채취기(가스텍, 서울)로 가스를 채취하여 검지센서로 측정하였다.
데이터처리
- 통계처리. 모든 실험은 3회 이상 반복하였고, 그 결과는 SAS program을 이용하여 평균과 표준편차로 표시하였다. 통계적 유의성은 산란계에서 대조군과 과채발효액을 투여한 실험군 사이에 차이만을 two-sample /-test로 검정하였다.
- 모든 실험은 3회 이상 반복하였고, 그 결과는 SAS program을 이용하여 평균과 표준편차로 표시하였다. 통계적 유의성은 산란계에서 대조군과 과채발효액을 투여한 실험군 사이에 차이만을 two-sample /-test로 검정하였다. 통계적 유의수준 p<0.
이론/모형
- pH는 pH meter(Orion mode 420A, Waltham, MA) 로 측정하였다. Kobayashi[1985] 및 Sim 등의[1995] 방법에 따라 과채 발효액에 함유된 개별 유산균의 내산성을 측정하였다. Pepsin이 1000 unit/mL 첨가된 MRS 액체 배지를 pH 2.
- 신선도 측정. 계란의 신선도는 국제적으로 가장 많이 사용하는 하우지수(Haugh Unit)을 사용하였다. 하우지수는 계란의 무게(W)와 농후 난백의 높이(H, mm)를 측정하여 다음 식으로 계산하는데 계란의 하우지수는 높을수록 신선한 것임을 나타낸다.
- 과채발효액의 유기산 농도 및 유기산의 최소발육억제농도 발효액 내에 함유되어 있는 유기산 함량은 Palmer와 List의 방법에 따라 분석하였다[Palmer와 List, 1973], 5mL으] 발효액을 증류수 50mL로 희석하여 30℃ 수욕조에서 30분 동안 진탕한 후 3, 000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 다시 15, 000 rpm에서 30분간 원심분리하고 상등액을 Sepak-C18을 사용하여 정제시킨 후 0.
- 난황 콜레스테롤 농도 측정. 난황에서 총지방을 Folch 등의 [1956] 방법을 변형시킨 Washbum과 Nix 빙-법으로[1974] 추출한 후 추출한 지방 내에 함유되어 있는 콜레스테롤의 함량을 Zlatkis 방법에 [1953] 의해서 측정하였다.
- 유산균의 동정. 유산균은 분자생물학적인 방법인 polymerase chain reaction(PCR)-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 기법으로 구축하였다. 유산균을 포함한 모든 균은 proteinase/cetyl trimethyammonium bromide(CTAB) 빙법을 이용하여 균의 chromosomal DNA를 순수 분리한 후 계통분류 학적으로 고유한 특성을 갖는 16S rRNA를 PCR로 증폭시켰으며 이때 사용한 primer는 다음과 같았다.
성능/효과
- 에 대한 MIC를 측정하였을 때 그 값은 Table 2에 보여주었다. MIC는 두 가지 유해균에 대해 유사한 경향을 나타내었고, MIC 값은 초산, 개미산, 프로피온산, 푸마릭산, 젖산, 시트르산의 순서로 높아서 초산이 유해균을 저해하는 가장 적은 농도가 필요하였다.
- 하우지수는 계란의 무게(W)와 농후 난백의 높이(H, mm)를 측정하여 다음 식으로 계산하는데 계란의 하우지수는 높을수록 신선한 것임을 나타낸다. 검사 결과 하우지수가 80 이상이면, 아주좋음, , 70 이상이면 '우수, , 65 이상이면 '양호, , 60 미만이면, 소비자 거부점, , 50 이하이면 불수용으로 분류하였다. 난백의 높이는 버니아캘리퍼로 난황에서 1cm 떨어진 지점을 측정하였다[Moon 등, 2006],
- 그러나 사료 섭취량 자체는 두군사이에 차이가 없었으나 단위질량의 계란을 생산하는데 필요한 사료 요구율은 과채발효액을 투여한 균이 높았다. 결과적으로 과채 발효액이 산란계의 계란 생산량을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다. 디른 연구에서도 산란계에서 probiotics가 유익한 장내 미생물의 발육을 향상시켜 계란 생산을 향상시켰다는 보고가 있었다[Hong 등, 2002],
- 과채발효액에 함유된 유산균주의 동정. 과채발효액에 함유된 균주를 분리하여 분자생물학적(PCR-DGGE) 기법으로 균주를 동정하였을 때 Table 1에서 보여주듯이 과채발효액에는 Lactobacillus (L.) reuteri, L. plantarum, L. hilgardii, L. nagelii, L. satsumensis, L. acidophilus, L. easel, L. malt, Zygosaccharomyces bisporus 등이 1x10, efu/g 이상 함유되어있었다. 이러한 조성은 김치에 함유되어 있는 유산균인 1.
- gallinarium)^ 대해서 과채 발효액에 함유된 유산균들과 유기산에 의한 항균효과를 조사였다. 과채발효액에 함유된 유산균 자체에 대해서 조사하였을 때 L. satswnensis, L acidophilus, L. easel, L. mail, L. hilgardii, L. reuteri, L. nagelii, L pkmtartune 모두 위해균에종류에 따른 차이는 약간 있었지만 대체적으로 위해균인 E. coli, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, S. gallinariwn 에대해서 항균력을 나타내었다. 특히 그 중에서도 L.
- 계란의 생산량과 마찬가지로 계란의 품질도 과채발효액을 공급하였을 때 계란의 품질을 나타내는 여러 가지 지표가 향상되는 것을 볼 수 있었다. 과채발효액을 첨가한 산란계에서 낳은 계란 노른자의 색도가 대조군에 비해 높아졌다. 또한, 대조군에 비해 과채발효액을 첨가한 사료를 투여한 산란계에서 낳은 계란의 난각의 두께도 두꺼워졌고, 난각 강도도 깅해졌다.
- 또한 발효액을 섭취한 실험군의 산란율이 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높았고, 평균 계란 질량도 더 높았다(Table 6). 그러나 사료 섭취량 자체는 두군사이에 차이가 없었으나 단위질량의 계란을 생산하는데 필요한 사료 요구율은 과채발효액을 투여한 균이 높았다. 결과적으로 과채 발효액이 산란계의 계란 생산량을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 또한, 대조군에 비해 과채발효액을 첨가한 사료를 투여한 산란계에서 낳은 계란의 난각의 두께도 두꺼워졌고, 난각 강도도 깅해졌다. 또한 닌백고도 과채발효액을 첨가한 사료를 투여한 산란계에서 낳은 계란에서 높았고 이것은 신선도가 높은 것이고 Haugh unit도 높았다(Table 7). 괴채발효액을 투여한 산란계에서 낳은 계란의 노른자에 함유된 콜레스테롤 함량이 대조군에 비해 낮았지만 통계적으로 유의적이지는 않았다(p=0.
- 1% 수준으로 사료에 혼합하여 산란계에게 공급하였을 때 계사 내의 냄새가 현저하게 적었다. 또한 발효액을 섭취한 실험군의 산란율이 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높았고, 평균 계란 질량도 더 높았다(Table 6). 그러나 사료 섭취량 자체는 두군사이에 차이가 없었으나 단위질량의 계란을 생산하는데 필요한 사료 요구율은 과채발효액을 투여한 균이 높았다.
- gallinarium에 대한 항균력이 가장 높았다(Table 5). 또한, 과채발효액은 산의 농도가 높아질수록 위해균에 대한 항균 효과가 향상되었고(Table 5), 더욱이 과채발효액은 위해균에 대해서 개별 유산균들에 비해 현저하게 항균력이 증가하였다(Table 5). 그러므로 과채 발효액에 의한 항균 효과는 함유 유산균들과 유기산 모두에 의한 것으로 사료된다.
- 5에서의 생존력은 좋을 것으로 생각하였다. 실험결과는 조사한 균주인 L. satsumensis, L. acidophilus, L. casei, L. reuteri, L. hilgardii, L. mali, L. plantarum, Zygosaccharomyces bispomis들은 모두 pH 4.0까지는 대부분 생존하였고, 이중에서도 L. hilgardii, L. reuteri, L. nagelii, L. plantarum, Zygosaccharomyces bisporus 들은 pH 2.0까지도 생존하였다(Table 4). 특히 이스트인 Zygosaccharomyces bisporus는 pH 2.
- coli와 Salmonella sp.의 MIC보다 높게 함유되어 있었고, 사과산, 시트르산, 푸마릭산 등의 함량은 MIC보다 낮게 함유되어 있었다. 전체적으로 보았을 때 과채발효액은 두 위해균의 성장을 억제하기에 충분한 것으로 사료된다.
- 또한, Cho 등은[2008] 김치에서 분리한 Lactobacillus W-44 균주와 J-124 균주를 양돈용 사료에 첨가하였을 때 일당증체량이 향상되었고, 사료 효율이 향상되었으며 장내 세균총이 개선되는 것을 확인하였다. 이 균주들은 in vitro 에서 내산성, 항균효과를 가진 것으로 보아 이러한 특성을 가진 lactobacilluse 양돈이나 양계의 사료에 첨가하였을 때 항생제 대체 효과가 있을 것으로 사료되었다.
- 의 MIC보다 높게 함유되어 있었고, 사과산, 시트르산, 푸마릭산 등의 함량은 MIC보다 낮게 함유되어 있었다. 전체적으로 보았을 때 과채발효액은 두 위해균의 성장을 억제하기에 충분한 것으로 사료된다. Jang 등의 연구 결과에서도 유기 산별 E.
- gallinariwn 에대해서 항균력을 나타내었다. 특히 그 중에서도 L. migelii과 L. plantarum이 Staphylococcus aureus, S. gallinarium에 대한 항균력이 가장 높았다(Table 5). 또한, 과채발효액은 산의 농도가 높아질수록 위해균에 대한 항균 효과가 향상되었고(Table 5), 더욱이 과채발효액은 위해균에 대해서 개별 유산균들에 비해 현저하게 항균력이 증가하였다(Table 5).
- 과채발효액의 탈취력 측정. 희석한 과채발효액을 25 ppm 암모니아와 50ppm 황화수소의 제거 능력을 측정하였을 때 초기 30분 동안에 처음 농도의 암모니아 68%와 황화수소 48%가 제거되는 빠른 탈취력을 나타내었다. 2시간 후에는 암모니아의 76%, 황화수소의 58% 탈취력을 나타내었다(Fig.
후속연구
- 또한, 배추, 무, 고추 등이 주요 구성 성분인 김치에 비해 과채발효유는 다양한 과일과 채소를 사용하고 소금을 사용하지 않으므로 유산균의 종류에도 차이가 있을 수 있고, 다양한 생리활성 물질이 함유되어 있을 수 있다. 그러므로 과채류 유산균 발효액은 김치 발효액에 비해 연구도 상대적으로 적고 그 효과도 높을 가능성이 있으므로 연구할 필요성이 높다고 판단하였다. 따라서 본 연구에서는 과일과 채소 발효 시 생성되는 유산균의 종류를 확인하고 유기산 농도, 내산성과 항균 효과를 확인하고 산란계의 사료에 첨가하여 공급하였을 때 계란의 품질에 미치는 영향을 조사하였다.
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