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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 복분자 딸기의 생리활성을 탐색하고 새로운 천연 기능성 소재로의 이용 가능성을 살펴보기 위하여 복분자 딸기의 항돌연변이 활성과 항암 활성을 분석하였다.
가설 설정
- 4) Data were expressed as mean±SD of triplicate determinations.
제안 방법
- 15 µg/plate)를 사용하였다. 돌연변이원의 사용량은 예비실험을 통하여 결정하였다.
- 배양액을 모두 제거하고 각 well당 DMSO:ethanol (1:1, v/v)용액 150 µL를 첨가하여 진탕배양기에서 30분간 교반한 후 ELISA reader(Versamax, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 복분자 딸기는 2006년 전라남도 고창에서 재배하여 수확한 것을 구입하여 -20℃에서 냉동보관하면서 시료로 사용하였다. 에탄올추출물은 복분자 딸기 100 g에 70% 에탄올 20배를 가하여 진탕배양기(25℃, 108 rpm)에서 12시간 동안 진탕한 후 여과지(Toyo No. 2, Advantec)로 여과하고 회전감압농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 40℃에서 감압농축하여 제조하였다. 복분자 딸기 열수추출물은 복분자 딸기 100 g에 10배의 증류수를 넣어 95℃ 항온수조에서 4시간 동안 환류냉각하여 추출한 후, 여과지로 여과하여 농축하였다.
- 항돌연변이 활성 측정에 앞서 돌연변이원과 시료의 돌연변이 활성을 검증하였다. 그 결과, 세포내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발하는 직접돌연변이원인 4-NQO와 sodium azide는 실험농도에서 대조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켰으나 시료는 사용된 농도에서 돌연변이를 유발하지 않아 항돌연변이 실험에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 2).
대상 데이터
- 세포 배양액으로는 10% FBS, 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포가 plate의 70～80% 가량 자라나는 3～4일 간격으로 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- 돌연변이 유발물질로는 직접돌연변이 물질인 sodium azide(1.5 µg/plate)와 4-NQO(0.15 µg/plate)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 암세포는 인체 간암세포(Hep3B)와 자궁암세포(HeLa)이며, 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양액으로는 10% FBS, 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 복분자 딸기는 2006년 전라남도 고창에서 재배하여 수확한 것을 구입하여 -20℃에서 냉동보관하면서 시료로 사용하였다. 에탄올추출물은 복분자 딸기 100 g에 70% 에탄올 20배를 가하여 진탕배양기(25℃, 108 rpm)에서 12시간 동안 진탕한 후 여과지(Toyo No.
- 본 실험에 사용된 암세포는 인체 간암세포(Hep3B)와 자궁암세포(HeLa)이며, 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양액으로는 10% FBS, 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포가 plate의 70～80% 가량 자라나는 3～4일 간격으로 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- 염기쌍 치환 변이주인 Salmonella typhimurium TA100(KTCT 2054, hisG46, rfa, △uvrB, R+) 균주를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 돌연변이 및 항돌연변이 활성을 측정하였다. 균주는 액체질소에 보관하며 정기적으로 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이와 R-factor의 유전형질을 확인하였다.
데이터처리
- 2) The different superscript in the same column indicates significant difference among 5 different amounts by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
- 2) The different superscript in the same column indicates significant difference among different samples by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
- 4) *: The value is significantly different from the control group at p<0.05 by Student’s t-test.
- The different upper case letters (A～C) and lower case letters (w～z) indicate significant difference (p<0.05) among different concentrations of each extract by Duncan's multiple range test.
- 각 실험군 사이의 유의성은 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
- 또한 돌연변이능 측정에서 시료와 양성대조군 간의 평균 차이를 검정하기 위해 Student's t-test를 사용하였다.
이론/모형
- MTT assay는 Carmichael J 등(1987)의 방법에 따라 암세포를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되도록 180 µL 씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
- Maron DM과 Ames BN(1983)의 방법에 따라 pre-incubation법으로 복분자 딸기추출물의 돌연변이 및 항돌연변이 활성을 측정하였고, 실험 전 시료에 대한 돌연변이 유발실험을 실시하여 돌연변이를 일으키지 않는 범위 내에서 시료의 농도를 결정하였다. 멸균된 cap tube에 변이원 50 µL와 시료 50 µL, 배양된 균액 100 µL를 넣고 0.
- SRB assay는 Doll R과 Peto R(1981)의 방법에 따라, 암세포를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되도록 희석한균 배양액을 100 µL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- HeLa 세포에 대한 복분자 딸기 에탄올추출물의 항암 활성은 700 µg/assay의 농도에서 59.5%, 열수추출물의 항암 활성은 63.6%로 열수추출물의 항암 활성이 더 높게 나타났으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- HeLa 세포에 대한 암세포 증식억제는 700 µg/assay의 농도에서 복분자 딸기 에탄올추출물이 68.5%, 열수추출물이 66.4%로 수치상으로 에탄올추출물의 항암활성이더 큰 것으로 나타났으나 통계적으로 유의적인 차이는 없었다.
- Hep3B 세포에 대한 복분자 딸기 에탄올추출물과 열수추출물의 항암 활성은 700 µg/assay의 농도에서 각각 67.2%와 65.8%를 나타내어 복분자 딸기 에탄올과 열수추출물 모두 50%가 넘는 항암 활성을 나타내었다.
- 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물의 Salmonella typhimurium TA100에 대한 항돌연변이 활성을 측정한 결과두 종류의 추출물 모두 농도의존적으로 항돌연변이활성을 나타내었다. Sodium azide에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 5 mg/plate의 추출물 농도에서 열수추출물이 에탄올추출물에 비해 높았고, 4-NQO에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 1 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물이 더 높게 나타났다. 또한 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성은 5 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물이 95.
- ) 균주를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 돌연변이 및 항돌연변이 활성을 측정하였다. 균주는 액체질소에 보관하며 정기적으로 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이와 R-factor의 유전형질을 확인하였다. 돌연변이 유발물질로는 직접돌연변이 물질인 sodium azide(1.
- 항돌연변이 활성 측정에 앞서 돌연변이원과 시료의 돌연변이 활성을 검증하였다. 그 결과, 세포내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발하는 직접돌연변이원인 4-NQO와 sodium azide는 실험농도에서 대조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켰으나 시료는 사용된 농도에서 돌연변이를 유발하지 않아 항돌연변이 실험에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 2).
- 복분자 딸기추출물들의 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 두 시료 모두 농도 의존적으로 항돌연변이 활성이 증가하여 5 mg/plate의 농도에서 가장 높은 항돌연변이 활성을 나타내었다. 복분자 딸기의 에탄올 및 열수추출물은 1 mg/plate의 농도에서 열수추출물이 83.
- 두 종류의 직접 변이원에 대한 항돌연변이 활성 측정 결과, 복분자 딸기추출물들은 S. typhimurium TA100에 의해 검출되는 염기쌍 치환 돌연변이를 효과적으로 억제하여 직접 돌연변이원에 대한 항돌연변이 효과가 우수하였다. 이는 SOS chromotest를 통해 복분자의 강한 세포 독성 및 항변이원성을 보고한 Nam SH 등(1999)의 결과와 일치하는 결과이다.
- 또한 두 추출물은 MTT assay와 SRB assay에서 HeLa 세포에 대한 항암활성이 Hep3B에 대한 항암활 성보다 높은 경향을 보였다. 따라서 본 연구에서 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO에 대한 강한 항돌연변이 활성을 나타내었고 HeLa 세포에 대한 성장 억제 효과도 높게 나타나 복분자 딸기가 항돌연변이와 항암 활성을 가진 천연 기능성 소재로서 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- Sodium azide에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 5 mg/plate의 추출물 농도에서 열수추출물이 에탄올추출물에 비해 높았고, 4-NQO에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 1 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물이 더 높게 나타났다. 또한 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성은 5 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물이 95.0%, 열수추출물이 93.6%로 매우 높게 나타났다. 항암실험에서는 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물의 인체 자궁암세포(HeLa)와 간암세포(Hep3B)에 대한 항암 활성이 700 µg/assay의 농도에서 모두 65% 이상으로 높게 나타났다.
- 4%의 항돌연변이 활성을 나타내어 에탄올추출물이 열수추출물보다 유의적으로 크게 나타났다. 또한 5 mg/plate의 농도에서는 에탄올추출물이 95.0%, 열수추출물이 93.6%의 돌연변이 억제 활성을 나타내어 두 시료 모두 매우 높은 항돌연변이 효과를 보여주었다.
- 항암실험에서는 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물의 인체 자궁암세포(HeLa)와 간암세포(Hep3B)에 대한 항암 활성이 700 µg/assay의 농도에서 모두 65% 이상으로 높게 나타났다. 또한 두 추출물은 MTT assay와 SRB assay에서 HeLa 세포에 대한 항암활성이 Hep3B에 대한 항암활 성보다 높은 경향을 보였다. 따라서 본 연구에서 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO에 대한 강한 항돌연변이 활성을 나타내었고 HeLa 세포에 대한 성장 억제 효과도 높게 나타나 복분자 딸기가 항돌연변이와 항암 활성을 가진 천연 기능성 소재로서 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물의 수율을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 복분자 딸기 100 g에 대한 에탄올 및 열수추출물의 수율은 각각 7.92%와 6.68%로 에탄올추출물의 수율이 열수추출물보다 높았다.
- 복분자 딸기 에탄올 및 열수추출물의 Salmonella typhimurium TA100에 대한 항돌연변이 활성을 측정한 결과두 종류의 추출물 모두 농도의존적으로 항돌연변이활성을 나타내었다. Sodium azide에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 5 mg/plate의 추출물 농도에서 열수추출물이 에탄올추출물에 비해 높았고, 4-NQO에 의해 야기된 돌연변이에 대한 억제 활성은 1 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물이 더 높게 나타났다.
- 2와 같다. 복분자 딸기 에탄올추출물과 열수추출물 모두 Hep3B와 HeLa 세포의 증식을 농도의존적으로 억제하였다. HeLa 세포에 대한 암세포 증식억제는 700 µg/assay의 농도에서 복분자 딸기 에탄올추출물이 68.
- 4에 나타내었다. 복분자 딸기 열수추출물의 SRB assay를 통한 항암 활성 측정 결과는 MTT assay와 마찬가지로 Hep3B와 HeLa 세포의 증식에 대한 억제 활성이 농도의존적으로 나타났다. HeLa 세포에 대한 복분자 딸기 에탄올추출물의 항암 활성은 700 µg/assay의 농도에서 59.
- 두 시료 모두 농도 의존적으로 항돌연변이 활성이 증가하여 5 mg/plate의 농도에서 가장 높은 항돌연변이 활성을 나타내었다. 복분자 딸기의 에탄올 및 열수추출물은 1 mg/plate의 농도에서 열수추출물이 83.2%, 에탄올추출물이 93.4%의 항돌연변이 활성을 나타내어 에탄올추출물이 열수추출물보다 유의적으로 크게 나타났다. 또한 5 mg/plate의 농도에서는 에탄올추출물이 95.
- Sodium azide로 야기된 돌연변이에 대한 복분자 딸기 추출물들의 항돌연변이 활성을 Table 3에 나타내었다. 에탄올 및 열수추출물 모두 농도의존적인 항돌연변이 활성이 나타났다. 복분자 딸기 열수추출물은 5 mg/plate의 농도에서 에탄올추출물의 항돌연변이 활성(27.
후속연구
- 이에 따라 복분자 딸기추출물의 보호 효과를 두 가지로 설명해 볼 수 있는데, 첫 번째는 복분자 딸기추출물이 돌연변이원의 흡수를 방해하는 작용을 하는 것이고 둘째는 복분자 딸기추출물이 DNA-repair system 을 향상시키는 화합물을 함유하고 있어 돌연변이에 대한 회복 기능을 향상시킬 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 복분자 딸기추출물들의 항돌연변이원으로서의 효과에 대한 보다 정확한 기작을 알기 위해서는 복분자 딸기의 돌연변이 억제 작용에 대한 더욱 다양한 연구가 이루어져야 할 것이다.
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