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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 프로폴리스의 인체에 대한 항산화 생리활성을 DNA 손상 개선정도를 중심으로 평가하려는 목적을 가지고 이중 맹검 (double-blind)에 의한 교차 실험 (cross-over design) 디자인으로 인체 중재연구를 시도하였다. 즉 건강한 남성 흡연자를 두 군으로 나누어 프로폴리스를 4주 섭취시킨 후 wash out period를 가진 뒤에 다시 군을 바꾸어 cross-over 방식으로 4주간 프로폴리스를 섭취시키었으며 중재실험이 끝난 후에 comet assay에 의한 임파구 DNA 손상도 및 적혈구 항산화 효소 수준, 혈장 총 항산화력 및 항산화 비타민 상태를 분석하여 프로폴리스의 항산화 효과를 평가하였다.
- 본 연구는 인체에서의 프로폴리스 항산화 활성을 측정하기 위해 흡연자를 대상으로 일정기간 프로폴리스 또는 placebo를 섭취하게 한 뒤에 comet assay에 의한 DNA 손상 정도 및 항산화 영양 상태를 double-blind cross-over 인체적용시험 디자인으로 수행한 in vivo 연구이다. 프로폴리스를 4주 동안 매일 섭취할 때 적혈구 항산화 효소인 catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) 활성도, 그리고 혈장의 vitamin C와 tocopherol 수준을 측정하여 항산화 지표들의 변화를 보았으며, 궁극적으로 임파구의 DNA 손상정도가 회복되는 지를 comet assay로 평가하였다.
- 중재연구에 있어서 가장 중요한 제한점 중의 하나는 대상자 수가 제한되어 있다는 점과 관찰 기간이 짧다는 점이다. 본 연구에서 프로폴리스의 DNA 손상 개선 및 항산화 효과가 거의 나타나지 않은 것도 대상자 개인 간의 변이가 컸다는 것에 부분적으로 기인했을 것이다. 개인 간 변이로 인해 대상자수가 많지 않은 인체 중재연구를 수행할 때 그 중재효과를 관찰하기가 어려워지며,41) 개인 간의 변이로 인해 genotoxicity가 나타나지 않음은 다른 여러 연구자들에 의해서도 보고된 바 있다.
- 프로폴리스는 꿀벌이 자신의 생존과 번식을 유지하기 위하여 여러 식물에서 뽑아낸 수지에 꿀벌 자신의 침과 효소 등을 혼합하여 만든 천연 물질이다. 본 연구에서는 프로폴리스가 산화 스트레스로 인해 나타난 흡연자의 DNA 손상을 회복시키어 항산화 영양 상태를 개선시키는지를 보고자 하여 placebo를 사용하는 double-blind cross-over 인체시험을 수행하였다. 흡연자에게 800 mg의 프로폴리스와 placebo를 4주 섭취시킨 후 2주 washout period를 가진 뒤 다시 군을 바꾸어 교차시험으로 4주간 섭취시킨 후, comet assay에 의한 DNA 손상도 및 신체 내 항산화 효소 수준, 총 항산화력 및 항산화 비타민 상태를 분석하였다.
- 산화 스트레스에 노출되기 쉬운 흡연자에게 있어 프로폴리스의 섭취가 혈장 내 항산화 비타민 수준에 변화를 가져오는지 살펴보았다. 4주간의 프로폴리스 및 위약 섭취 후에 혈장 비타민 C, α-tocopherol 및 γ-tocopherol 수준은 군 간의 유의적인 차이가 보이지 않았다 (Table 5).
제안 방법
- 20 μL/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 형광 염색하고 cover glass로 덮은 뒤 형광현미경 (Leica, Germany)으로 관찰하면서 CCD camera (Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 image를 Komet 4.0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다.
- 고갈식이 기간이 끝나고 실험 시작하는 날 1차 채혈을 하였으며, 실험대상자를 위약군과 프로폴리스군의 두 군으로 무작위로 나눈 후 4주 동안 프로폴리스 정제 및 위약 정제를 섭취하도록 하였다. 4주가 끝나는 날 2차 채혈을 하였으며, 2주간 washout 기간 후에 cross-over 방식으로 군을 바꾸어 프로폴리스 섭취하였던 군은 위약을, 위약을 섭취하였던 군은 프로폴리스를 역시 4주 동안 섭취하도록 하였다. 이 교차실험 시작할 때 3차 채혈을 하였으며, 섭취 기간 중에 과일과 채소 섭취는 일정량으로 제한하였고 식이습관도 평상시처럼 유지토록 지도하였다.
- Alkali lysis buffer를 사용하여 DNA의 double strand를 풀어주었으며 lysis가 끝난 slide를 전기영동 buffer로 40분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300 ± 3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다.
- Alkaline comet assay는 선행연구에서와 같이 Singh의 방법을 수정, 보완하여 실시하였다.21) 임파구는 신선한 전혈 70 μL을 1 mL의 PBS에 섞은 후 Histopaque 1077를 이용하여 분리해 내었다.
- DNA 손상을 보기 위한 Comet assay를 위해서는 100 μL heparinated sterile tube에 전혈 (whole blood)을 담고, 나머지 혈액은 lithium-heparinic polystyrene에 담아 1,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 얻어진 platelet-rich-plasma는 ascorbic acid 측정을 위해 분리하였다.
- 위 생성물에 황산을 가한 후 45℃에 60분간 반응시켜서 생성된 물질을 586 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 농도는 1, 1, 3, 3-tetramethoxypropane (TMPO)을 45℃에서 반응시켜 MDA를 생성하는 것을 이용하여 얻은 검량선에 대입하여 구하였다.
- 특히 MDA는 자동산화과정의 최종단계 생성물로 알려져 있다. MDA는 CALBIOCHEM (사)의 지질과산화 kit를 사용하여 분석하였다. 혈장 200 μL에 철과 n-methyl-2-phenylindole을 1 : 3으로 혼합한 용액 650 μL을 취하여 반응 시킨다.
- 본 인체 연구는 위약군을 둔 무작위적인 double-blind, cross-over design으로 처음 2주간 flavonoid류 식품에 대한 고갈식이 기간을 두었으며 두 번의 4주 중재 기간 사이에 2주 동안의 washout 기간을 두었다. 고갈식이 기간이 끝나고 실험 시작하는 날 1차 채혈을 하였으며, 실험대상자를 위약군과 프로폴리스군의 두 군으로 무작위로 나눈 후 4주 동안 프로폴리스 정제 및 위약 정제를 섭취하도록 하였다. 4주가 끝나는 날 2차 채혈을 하였으며, 2주간 washout 기간 후에 cross-over 방식으로 군을 바꾸어 프로폴리스 섭취하였던 군은 위약을, 위약을 섭취하였던 군은 프로폴리스를 역시 4주 동안 섭취하도록 하였다.
- 대상자들에게 실험기간 동안 식생활을 급격하게 바꾸지 않도록 부탁하였으며 연구기간이 과일과 채소가 흔한 계절임을 감안하여 실험 시작 2주 전부터 과일과 채소의 섭취량을 제한하는 고갈식이 기간을 두었으며, 하루에 먹어야 할 최대한의 과일과 채소의 양에 대한 정보를 제공하면서 고갈식이에 대해 지도하였다. 본 연구계획서는 실험 시작 전에 한남대 식품영양건강연구소 인체시험심의위원회 (한남대 IRB)를 통과하였다.
- 총 29명의 흡연자로부터 본인의 동의를 얻어 프로폴리스섭취 전후와 위약섭취전후에 4번에 걸쳐서 채혈하였다. 대상자들은 채혈하기 전 8시간 이상 음식물을 먹지 않도록 지도하였으며 대상자들의 혈액은 아침식사 전에 12 mL 정도 채혈 후 2개의 서로 다른 시험관에 분주하였다. DNA 손상을 보기 위한 Comet assay를 위해서는 100 μL heparinated sterile tube에 전혈 (whole blood)을 담고, 나머지 혈액은 lithium-heparinic polystyrene에 담아 1,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 얻어진 platelet-rich-plasma는 ascorbic acid 측정을 위해 분리하였다.
- 식이섭취 조사는 24시간 회상법을 1대 1 면담법으로 실시하였다. 대상자들의 분량을 회상하는데 도움을 주기 위해 food model 및 사진으로 보는 음식의 눈 대중량을 제시하여 섭취한 모든 음식의 종류와 섭취량이 가능한 정확하게 조사하도록 하였다. 영양소 섭취량은 한국영양학회에서 제작한 CAN program 2.
- 체내 임파구 DNA 손상은 알칼리 환경의 전기영동을 이용한 Comet assay를 한 후 DNA 손상정도를 세포의 파괴된 파편의 길이로 측정하였다. 대상자의 임파구 자체의 산화적 손상으로 혜성처럼 끌려 나간 DNA 파편의 %를 DNA in tail %, DNA 파편이 끌려 나간 tail의 길이를 tail length, 그리고 이 두 값을 함께 반영한 값을 tail moment로 표시하였다 (endogenous Comet). 또한 대상자들의 DNA 손상이 산화적 요인에 의한 것인지 명확하게 보기위해 분리해 낸 임파구에 H2O2를 처리하여 Comet assay를 실시하였고, 위에서 나타낸 DNA in tail %, tail length 및 tail moment를 관찰하였다 (H2O2 Comet).
- 대상자의 임파구 자체의 산화적 손상으로 혜성처럼 끌려 나간 DNA 파편의 %를 DNA in tail %, DNA 파편이 끌려 나간 tail의 길이를 tail length, 그리고 이 두 값을 함께 반영한 값을 tail moment로 표시하였다 (endogenous Comet). 또한 대상자들의 DNA 손상이 산화적 요인에 의한 것인지 명확하게 보기위해 분리해 낸 임파구에 H2O2를 처리하여 Comet assay를 실시하였고, 위에서 나타낸 DNA in tail %, tail length 및 tail moment를 관찰하였다 (H2O2 Comet). Endogenous Comet에서 프로폴리스군과 위약군의 tail length와 tail moment 값이 baseline에 비해 감소하는 경향은 보였으나 유의적인 차이는 아니었다.
- 조사자의 일반사항으로 조사대상자의 나이, 흡연량, 흡연력, 알코올 섭취 여부, 알코올의 종류와 섭취량에 대한 내용을 설문지를 통해 조사하였다. 매 채혈일에 24시간 회상법을 이용한 식이섭취 조사와 신체계측조사를 수행하였다. 식이섭취 조사는 24시간 회상법을 1대 1 면담법으로 실시하였다.
- 채혈하는 날 식이섭취조사와 신체계측조사도 병행하여 실시되었다. 본 영양중재 실험은 실험대상자 본인이 위약을 투여 받는지 혹은 프로폴리스 캡슐을 투여받는지 모르게 진행되었으며, 연구자도 영양중재 실험이 진행되는 동안, 혹은 각 항목의 분석실험이 진행되는 동안 위약군과 프로폴리스군을 알 수 없도록 double-blind 방식으로 진행되었다. 본 연구의 실험 디자인은 Fig.
- 본 인체 연구는 위약군을 둔 무작위적인 double-blind, cross-over design으로 처음 2주간 flavonoid류 식품에 대한 고갈식이 기간을 두었으며 두 번의 4주 중재 기간 사이에 2주 동안의 washout 기간을 두었다.
- 매 채혈일에 24시간 회상법을 이용한 식이섭취 조사와 신체계측조사를 수행하였다. 식이섭취 조사는 24시간 회상법을 1대 1 면담법으로 실시하였다. 대상자들의 분량을 회상하는데 도움을 주기 위해 food model 및 사진으로 보는 음식의 눈 대중량을 제시하여 섭취한 모든 음식의 종류와 섭취량이 가능한 정확하게 조사하도록 하였다.
- 채혈 첫 주에 식이섭취 빈도조사를 통해 대상자의 지난 한달 동안 섭취한 flavonoids 및 carotenoids 함량을 조사하였다. 식품의 flavonoids 및 carotenoids 함량 database는 본 조사를 위해 대상자에게 반정량적 식품섭취빈도 조사지를 분배하여 간단한 주의사항을 안내한 후, 자가 작성하도록 하였다. 조사 대상자의 1일 평균 flavonoids 및 carotenoids 섭취량은 조사대상자별로 각 식품의 1회 섭취량과 섭취빈도 값을 곱하여 개인의 1일 평균 식품 섭취량을 계산한 다음, 식품별 flavonoids 함량 database를 이용하여 계산하였다.
- 신장계와 줄자를 이용하여 신장 및 WHR (wasit-hip ratio)을 측정하였으며, 체중, BMI (body mass index), 체지방량 등의 신체계측조사는 생체임피던스 측정기 (Biospace Co, Ltd. Inbody 2.0)를 이용하여 측정하였다.
- 4주가 끝나는 날 2차 채혈을 하였으며, 2주간 washout 기간 후에 cross-over 방식으로 군을 바꾸어 프로폴리스 섭취하였던 군은 위약을, 위약을 섭취하였던 군은 프로폴리스를 역시 4주 동안 섭취하도록 하였다. 이 교차실험 시작할 때 3차 채혈을 하였으며, 섭취 기간 중에 과일과 채소 섭취는 일정량으로 제한하였고 식이습관도 평상시처럼 유지토록 지도하였다. 교차실험 4주가 끝난 후에 4차 채혈을 하였다.
- Ascorbic acid는 copper-sulfate로 처리하면 dehydroascorbic acid로 산화된 뒤 diketogluconic acid로 가수분해된다. 이를 2, 4-dinitrophenylhydrazine으로 처리하면 안정한 적갈색물의 osazone이 형성되는데 이것을 520 nm에서 측정하여 혈장 ascorbic acid의 농도를 분석하였다.
- 이 때 산화된 glutathione은 glutathione reductase와 NADPH의 존재하에 다시 glutathione으로 환원되고 NADPH는 NADP로 산화된다. 이를 이용해 용혈된 적혈구에 glutathione, glutathione reductase, NADPH를 첨가하고 37℃, 10분간 배양한 뒤 t-butylhydroperoxide를 넣어 반응시켰으며 이 때 감소된 NADPH농도를 340 nm에서 90초간 측정함으로써 GSH-Px의 항산화 정도를 측정하였다.20) Catalase의 활성은 용혈된 적혈구에 50 mM phosphate buffer (pH 7)와 hydrogen peroxide를 첨가한 후 hydrogen peroxide의 감소량을 240 nm에서 30초간 측정하였다.
- 0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 임파구의 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리 (tail length, TL) 또는 tail length에 tail내 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment (TM) 값을 측정하여 나타내었으며 각 대상자 당 2개의 slide를 만들어 각각 50개씩 총 100개의 임파구에서 DNA 손상정도를 측정하였다.
- 적혈구내 superoxide dismutase (SOD), glutathion peroxidase (GSH-Px), catalase 등의 항산화효소의 분석은 UV/VIS spectrometer에 의해 측정하였다.20) SOD는 적혈구 현탁액을 증류수로 용혈시킨 후 ethanol과 chloroform을 가하고 이를 3,000 U/min, 2분간 원심 분리하였다.
- 식품의 flavonoids 및 carotenoids 함량 database는 본 조사를 위해 대상자에게 반정량적 식품섭취빈도 조사지를 분배하여 간단한 주의사항을 안내한 후, 자가 작성하도록 하였다. 조사 대상자의 1일 평균 flavonoids 및 carotenoids 섭취량은 조사대상자별로 각 식품의 1회 섭취량과 섭취빈도 값을 곱하여 개인의 1일 평균 식품 섭취량을 계산한 다음, 식품별 flavonoids 함량 database를 이용하여 계산하였다.
-
대상자 일반현황 및 식이섭취 조사
조사자의 일반사항으로 조사대상자의 나이, 흡연량, 흡연력, 알코올 섭취 여부, 알코올의 종류와 섭취량에 대한 내용을 설문지를 통해 조사하였다. 매 채혈일에 24시간 회상법을 이용한 식이섭취 조사와 신체계측조사를 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 프로폴리스의 인체에 대한 항산화 생리활성을 DNA 손상 개선정도를 중심으로 평가하려는 목적을 가지고 이중 맹검 (double-blind)에 의한 교차 실험 (cross-over design) 디자인으로 인체 중재연구를 시도하였다. 즉 건강한 남성 흡연자를 두 군으로 나누어 프로폴리스를 4주 섭취시킨 후 wash out period를 가진 뒤에 다시 군을 바꾸어 cross-over 방식으로 4주간 프로폴리스를 섭취시키었으며 중재실험이 끝난 후에 comet assay에 의한 임파구 DNA 손상도 및 적혈구 항산화 효소 수준, 혈장 총 항산화력 및 항산화 비타민 상태를 분석하여 프로폴리스의 항산화 효과를 평가하였다.
- 0 version을 이용하여 구하였다. 채혈 첫 주에 식이섭취 빈도조사를 통해 대상자의 지난 한달 동안 섭취한 flavonoids 및 carotenoids 함량을 조사하였다. 식품의 flavonoids 및 carotenoids 함량 database는 본 조사를 위해 대상자에게 반정량적 식품섭취빈도 조사지를 분배하여 간단한 주의사항을 안내한 후, 자가 작성하도록 하였다.
- 처음 2주 동안의 고갈기간 후에 흡연자 29명 (평균나이: 34.38 ± 1.73세)을 프로폴리스군과 위약군의 두 군으로 나누어 하루에 프로폴리스 또는 위약을 4주 동안 공급하였고 2주 동안의 washout 기간을 가진 후에 교차실험을 위해 대상자의 군을 바꾸어 다시 4주 동안 프로폴리스와 위약을 공급하였다.
- 체내 임파구 DNA 손상은 알칼리 환경의 전기영동을 이용한 Comet assay를 한 후 DNA 손상정도를 세포의 파괴된 파편의 길이로 측정하였다. 대상자의 임파구 자체의 산화적 손상으로 혜성처럼 끌려 나간 DNA 파편의 %를 DNA in tail %, DNA 파편이 끌려 나간 tail의 길이를 tail length, 그리고 이 두 값을 함께 반영한 값을 tail moment로 표시하였다 (endogenous Comet).
- 총 29명의 흡연자로부터 본인의 동의를 얻어 프로폴리스섭취 전후와 위약섭취전후에 4번에 걸쳐서 채혈하였다. 대상자들은 채혈하기 전 8시간 이상 음식물을 먹지 않도록 지도하였으며 대상자들의 혈액은 아침식사 전에 12 mL 정도 채혈 후 2개의 서로 다른 시험관에 분주하였다.
- 본 연구는 인체에서의 프로폴리스 항산화 활성을 측정하기 위해 흡연자를 대상으로 일정기간 프로폴리스 또는 placebo를 섭취하게 한 뒤에 comet assay에 의한 DNA 손상 정도 및 항산화 영양 상태를 double-blind cross-over 인체적용시험 디자인으로 수행한 in vivo 연구이다. 프로폴리스를 4주 동안 매일 섭취할 때 적혈구 항산화 효소인 catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) 활성도, 그리고 혈장의 vitamin C와 tocopherol 수준을 측정하여 항산화 지표들의 변화를 보았으며, 궁극적으로 임파구의 DNA 손상정도가 회복되는 지를 comet assay로 평가하였다.
- 프로폴리스를 섭취하였을 때 혈장 내 항산화력 증가와 지질과산화 방지효과가 있는지를 알아보기 위하여 혈장 내 총 항산화력을 보는 지표인 TRAP 수준, TAS 및 지질과산화 최종산물인 MDA 수준을 분석하여 본 결과는 Table 7과 같다.
- 혈장 α-tocopherol, γ-tocopherol은 ethanol로 단백질을 제거하고 n-hexane으로 지방을 추출한 후 rotary evaporator로 hexane을 증발시키고, mobile phase (metanol : dichloromethane = 85 : 15)에 녹여 HPLC로 측정하였다.
- Sample을 6분 동안 30℃에서 배양한 후 UV/VIS spectrometer로 740 nm의 파장에서 absorbance를 측정하였다. 혈장의 TRAP 농도는 trolox의 calibration curve를 이용하여 계산하였으며 TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, mM)으로 표현하였다.
- 본 연구에서는 프로폴리스가 산화 스트레스로 인해 나타난 흡연자의 DNA 손상을 회복시키어 항산화 영양 상태를 개선시키는지를 보고자 하여 placebo를 사용하는 double-blind cross-over 인체시험을 수행하였다. 흡연자에게 800 mg의 프로폴리스와 placebo를 4주 섭취시킨 후 2주 washout period를 가진 뒤 다시 군을 바꾸어 교차시험으로 4주간 섭취시킨 후, comet assay에 의한 DNA 손상도 및 신체 내 항산화 효소 수준, 총 항산화력 및 항산화 비타민 상태를 분석하였다. 처음 2주 동안의 고갈기간 후에 흡연자 29명 (평균나이: 34.
대상 데이터
- 실험 자원자 35명에 대한 설문조사를 실시하였고, 설문조사 결과 영양제나 식이보충제를 섭취하는 사람 및 질병이 있는 사람은 제외한 후, 실험을 시작한 사람은 모두 29명이었다. 10주간의 실험이 진행되는 동안 알레르기 반응 등으로 인해 중도 포기한 사람을 제외하고 실험을 마지막까지 수행한 대상자는 25명이었다.
- 현재 항산화 기능성을 평가해야 할 7종의 고시형 식품 중에서 비타민 C, E, β-carotene은 외국에서 수행된 인체연구가 많으므로 항산화 기능성을 다시 인체시험으로 평가할 필요가 없을 것으로 판단하였다. 나머지 4종의 고시형 식품 중에서 밀배아, 포도씨유, 레시틴은 동물실험 결과, 항산화 기능성이 있을 가능성이 적고, 프로폴리스는 항산화 물질인 총 flavonoids 함량이 6~7% 정도로 높고 또 in vitro 실험과 동물실험을 통해 항산화 기능성이 있는 것으로 알려져 있으므로 본 연구에서 인체시험을 위한 고시형 항산화 식품으로 프로폴리스를 선택하였다.
- 본 연구는 대전 소재 한남대학교에 재직 중인 교직원 및 한국화학연구원 소속 연구원 중 흡연을 하고 있는 남자 성인 자원자를 대상으로 본인의 자발적인 동의하에 2004년 6월부터 9월까지 수행되었다. 실험 자원자들은 실험의 내용을 설명들은 후 서면 동의서에 자필 서명을 하였다.
- 실험 자원자들은 실험의 내용을 설명들은 후 서면 동의서에 자필 서명을 하였다. 실험 자원자 35명에 대한 설문조사를 실시하였고, 설문조사 결과 영양제나 식이보충제를 섭취하는 사람 및 질병이 있는 사람은 제외한 후, 실험을 시작한 사람은 모두 29명이었다. 10주간의 실험이 진행되는 동안 알레르기 반응 등으로 인해 중도 포기한 사람을 제외하고 실험을 마지막까지 수행한 대상자는 25명이었다.
- 인체시험을 위한 고시형 항산화 식품으로는 프로폴리스를 선정하였다. 현재 항산화 기능성을 평가해야 할 7종의 고시형 식품 중에서 비타민 C, E, β-carotene은 외국에서 수행된 인체연구가 많으므로 항산화 기능성을 다시 인체시험으로 평가할 필요가 없을 것으로 판단하였다.
- 임파구 DNA에 산화적 스트레스를 가하기 위해 200 μM H2O2를 사용하였다.
- 프로폴리스는 (주)서울프로폴리스로부터 제공 받았으며 프로폴리스 캡슐을 하루에 6정을 먹도록 하였다. 하루 섭취량인 프로폴리스 캡슐 6정에 들어있는 프로폴리스 총량은 800 mg/day이었다.
- 4 gm이었다. 하루에 30분 이상 운동한다고 답한 대상자는 14명이었다. 대상자들의 24시간 회상법으로 본 영양소 섭취 상태는 실험기간동안 차이가 없었다 (Table 4).
데이터처리
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 평균오차 (SE)를 구하였으며 baseline data와 프로폴리스군 및 위약군의 평균치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)로 분석한 후, 사후 검증은 Bonferroni 법으로 수행하였다.
이론/모형
- 대상자들의 혈장 ascorbic acid는 선행연구에서와 같이 2, 4-dinitrophenylhydrazine method에 의해 UV/VIS spectrometer로 분석하였다.18) 혈장을 metaphosphoric acid로 처리하여 단백질을 침전시키고 ascorbic acid를 안정화시켰다.
- 대상자들의 분량을 회상하는데 도움을 주기 위해 food model 및 사진으로 보는 음식의 눈 대중량을 제시하여 섭취한 모든 음식의 종류와 섭취량이 가능한 정확하게 조사하도록 하였다. 영양소 섭취량은 한국영양학회에서 제작한 CAN program 2.0 version을 이용하여 구하였다. 채혈 첫 주에 식이섭취 빈도조사를 통해 대상자의 지난 한달 동안 섭취한 flavonoids 및 carotenoids 함량을 조사하였다.
- 최근에 개발된 혈장 총 유리기포집 항산화능 (TRAP, total radical-trapping antioxidant potential) 측정법은 혈장 내 α-tocopherol, ascorbate, urate, protein sulfhydryl groups 등의 항산화제들의 복합된 활성을 측정하여 혈장의 총 유리기 포집 항산화능을 나타내므로 시간과 노력을 절약할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 혈장 중 TRAP은 Rice-Evans와 Miller의 inhibition assay에 따라 분석하였다.19) 이 방법은 ABTS [2, 2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline 6-sulfo nate), 150 μM]와 metmyoglobin (2.
성능/효과
- 2) 프로폴리스는 또 유전자 expression 및 cell signaling cascades에도 영향을 미친다.27) 그러나 flavonoids와 phenolic acid들은 in vitro의 어떤 상황에서는 pro-oxidant로 작용할 수도 있으며 특정 농도에서 자유 라디칼을 제거하는 대신에 인체에 독성효과를 가져오기도 한다.
- 국내에서 인체시험에 적용할 수 있는 항산화 지표의 신뢰도에 대한 연구가 수행되었는데, Pubmed를 대상으로 문헌조사를 하여 지표들을 선별한 후 2차에 걸친 전문가 델파이 조사에 의해 항산화 관련 biomarker의 타당성을 검토한 결과, 인체시험에 있어서 가장 신뢰성 있는 biomarker로는 임파구 DNA 손상도가 꼽혔으며 그 다음으로는 혈장 TRAP 및 TAS, 적혈구 SOD, GSH-Px, Catalase의 순서였다.30) 혈장 항산화 비타민인 vitamin C와 E 그리고 지질과산화 지표인 MDA 등은 신뢰도 순위가 그 다음으로 나타났다.
- 36,37) 본 연구에서 Comet assay로 분석한 대상자의 임파구 DNA 손상정도는 항산화 biomarker에서처럼 프로폴리스를 섭취한 군이나 위약을 섭취한 군 간에 차이를 보이지 않았으며 baseline에 비해 개선되는 효과도 보이지 않았다 (p > 0.05).
- 4주간의 프로폴리스 및 위약 섭취 후에 혈장 비타민 C, α-tocopherol 및 γ-tocopherol 수준은 군 간의 유의적인 차이가 보이지 않았다 (Table 5).
- Catalase와 SOD 활성도는 4주간의 영양중재 실험 후, 프로폴리스 섭취군과 위약군 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았으나, glutathione peroxidase 활성도는 baseline 값에 비해 프로폴리스 섭취군과 위약군에서 모두 감소하였으며 프로폴리스군의 경우 baseline에 비해 유의적으로 감소하였다 (p < 0.05).
- 73세)을 프로폴리스군과 위약군의 두 군으로 나누어 하루에 프로폴리스 또는 위약을 4주 동안 공급하였고 2주 동안의 washout 기간을 가진 후에 교차실험을 위해 대상자의 군을 바꾸어 다시 4주 동안 프로폴리스와 위약을 공급하였다. Comet assay로 분석한 대상자의 임파구 DNA 손상정도는 프로폴리스를 섭취한 군이나 위약을 섭취한 군 간에 차이를 보이지 않았으며 총 항산화 영양상태도 두 군 간에 차이가 나타나지 않았다. 적혈구 항산화 효소인 catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) 활성도, 그리고 혈장 vitamin C와 tocopherol 수준도 프로폴리스군과 위약군 사이에 차이를 보이지 않았다.
- 또한 대상자들의 DNA 손상이 산화적 요인에 의한 것인지 명확하게 보기위해 분리해 낸 임파구에 H2O2를 처리하여 Comet assay를 실시하였고, 위에서 나타낸 DNA in tail %, tail length 및 tail moment를 관찰하였다 (H2O2 Comet). Endogenous Comet에서 프로폴리스군과 위약군의 tail length와 tail moment 값이 baseline에 비해 감소하는 경향은 보였으나 유의적인 차이는 아니었다. H2O2 Comet에서도 baseline에 비해 프로폴리스 섭취군과 위약군의 DNA 손상 정도를 나타내는 세 가지 지표에 유의적인 차이를 보이지 않았다 (Table 8).
- 대상자들이 open diet 상태에 있었다는 점, 프로폴리스의 투여량이 비교적 적었다는 점, 개인간 변이가 컸다는 점 등이 본 연구에서 프로폴리스의 섭취효과가 유의적으로 나타나지 않았던 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 결론적으로 하루에 800 mg의 프로폴리스 섭취는 건강한 흡연자의 내재적인 임파구 DNA 손상을 개선시키고 대상자의 항산화 상태를 향상시키는데 충분하지 않았다. 따라서 앞으로 프로폴리스의 DNA 손상 개선 및 항산화 효과를 측정하기 위한 더 광범위하고 정밀하게 디자인된 인체 중재연구가 필요할 것이다.
- 대상자들이 open diet 상태에 있었다는 점, 프로폴리스의 투여량이 비교적 적었다는 점, 개인간 변이가 컸다는 점 등이 본 연구에서 프로폴리스의 섭취효과가 유의적으로 나타나지 않았던 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 결론적으로 하루에 800 mg의 프로폴리스 섭취는 건강한 흡연자의 내재적인 임파구 DNA 손상을 개선시키고 대상자의 항산화 상태를 향상시키는데 충분하지 않았다.
- 앞에서의 지표와 마찬가지로 위약군과 프로폴리스 섭취군의 혈장 TRAP과 TAS 수준은 차이를 보이지 않았다. 또 위약군과 프로폴리스를 섭취한 대상자들의 혈장 MDA 수준은 baseline에 비해 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의적인 변화는 아니었다 (Table 6).
- 본 연구에서 4주간 대상자에게 프로폴리스를 교차실험 방식으로 섭취시킨 결과, 프로폴리스 섭취군의 지질 과산화 정도 (MDA 수준)가 위약군 및 실험시작 시점에 비해 감소되는 경향을 보였으며 총 항산화능인 혈장 TRAP 및 TAS 수준도 프로폴리스 섭취군에서 위약군이나 실험시작 시점에 비해 높아지는 경향을 보였으나 모두 통계적으로 유의적인 차이는 아니었다. 이러한 결과는 같은 프로폴리스 시료를 사용한 동물실험 결과, 프로폴리스의 투여가 고지방으로 DNA 손상을 유도한 흰쥐의 항산화력을 개선시키지 않았다는 결과와 같은 것이다.
- 05). 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 정도의 프로폴리스 투여로는 DNA 손상에 대해 보호하는 효과를 보이지 않을 수 있다는 것을 제시한다. 프로폴리스 섭취 시 DNA 손상 개선효과에 대한 in vivo 인체 중재연구는 현재까지 보고된 바 없으므로 앞으로 이에 대한 좀 더 깊은 연구가 필요할 것이다.
- Comet assay로 분석한 대상자의 임파구 DNA 손상정도는 프로폴리스를 섭취한 군이나 위약을 섭취한 군 간에 차이를 보이지 않았으며 총 항산화 영양상태도 두 군 간에 차이가 나타나지 않았다. 적혈구 항산화 효소인 catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) 활성도, 그리고 혈장 vitamin C와 tocopherol 수준도 프로폴리스군과 위약군 사이에 차이를 보이지 않았다. 따라서 흡연자에 있어서 프로폴리스의 항산화 효과를 평가하기 위해서는 앞으로 더 다양한 연구가 필요하리라고 생각된다.
후속연구
- 나아가서 프로폴리스가 가지고 있는 폴리페놀 화합물들 간에 상승적 (synergistic) 상화작용 혹은 길항적 (antagonistic) 상호작용도 가능할 것이다.38) 본 연구에서는 인체시험에 사용한 프로폴리스의 polyphenolic compounds이나 flavonoids 양을 분석하지 않았다는 제한점이 있으므로 앞으로는 프로폴리스 사용량 외에 프로폴리스에 함유되어 있는 polyphenolic compounds의 양을 분석한 후에 비교하는 작업이 필요할 것이다.
- 41-43) 따라서 프로폴리스의 항산화 효과에 대한 전반적인 그림을 얻기 위해서는 앞으로는 항산화 기능성을 측정하기 위한 타당한 biomarker를 사용하여 좀 더 많은 수의 대상자, 더 오랜 실험기간 그리고 건강한 사람보다는 반건강인, 즉 질병의 위험요인을 가지고 있는 사람들 (high risk group)을 대상으로 randomized clinical trail을 수행할 필요가 있을 것이다.
- 프로폴리스의 종류 맟 산지에 따라 polyphenolic compounds 혹은 flavonoids 함량이 다르고 이에 따라 DNA 손상 회복능 및 항산화력이 달라질 수 있으므로 단순히 프로폴리스의 양만 비교하여 결과를 해석하는 데에는 한계가 있다. 나아가서 프로폴리스가 가지고 있는 폴리페놀 화합물들 간에 상승적 (synergistic) 상화작용 혹은 길항적 (antagonistic) 상호작용도 가능할 것이다.38) 본 연구에서는 인체시험에 사용한 프로폴리스의 polyphenolic compounds이나 flavonoids 양을 분석하지 않았다는 제한점이 있으므로 앞으로는 프로폴리스 사용량 외에 프로폴리스에 함유되어 있는 polyphenolic compounds의 양을 분석한 후에 비교하는 작업이 필요할 것이다.
- 결론적으로 하루에 800 mg의 프로폴리스 섭취는 건강한 흡연자의 내재적인 임파구 DNA 손상을 개선시키고 대상자의 항산화 상태를 향상시키는데 충분하지 않았다. 따라서 앞으로 프로폴리스의 DNA 손상 개선 및 항산화 효과를 측정하기 위한 더 광범위하고 정밀하게 디자인된 인체 중재연구가 필요할 것이다.
- 적혈구 항산화 효소인 catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) 활성도, 그리고 혈장 vitamin C와 tocopherol 수준도 프로폴리스군과 위약군 사이에 차이를 보이지 않았다. 따라서 흡연자에 있어서 프로폴리스의 항산화 효과를 평가하기 위해서는 앞으로 더 다양한 연구가 필요하리라고 생각된다.
- 이 연구와는 달리 본 연구에서 프로폴리스 섭취 후에 적혈구 GSH-Px 활성도가 유의적으로 낮아진 이유는 설명하기 어려웠으며 앞으로 프로폴리스의 투여와 항산화 효소 활성도와의 관계에 대한 in vivo 연구가 활발히 이루어져야 할 것이다.
- 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 정도의 프로폴리스 투여로는 DNA 손상에 대해 보호하는 효과를 보이지 않을 수 있다는 것을 제시한다. 프로폴리스 섭취 시 DNA 손상 개선효과에 대한 in vivo 인체 중재연구는 현재까지 보고된 바 없으므로 앞으로 이에 대한 좀 더 깊은 연구가 필요할 것이다.
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