마우스 유방암 모델에서 5-Aza-2'-deoxycytidine의 암줄기세포 유지 억제 효과 5-Aza-2'-deoxycytidine Inhibits the Maintenance of Cancer Stem Cell in a Mouse Model of Breast Cancer원문보기
비정상적 DNA메칠화는 암 발생에 있어 중요한 역할을 한다. 최근 연구에 의하면 암줄기세포 유지에 있어 DNA과메칠화가 연관되어 있다고 보고하고 있다. 따라서 본 연구는 4T1 유방암 실험모델에서 demethylating agent인 AZA 처리에 따른 후성유전적 변화가 암줄기세포의 유지 및 증식에 있어 어떠한 영향을 미치는지 조사 하였다. 4T1 세포에서 AZA 처리에 따른 tumorsphere 형성이 감소 하는 것을 in vitro 실험을 통해 관찰 하였고, in vivo 실험에서는 줄기세포 조절 유전자들 (Oct-4, Nanog. Sox2)의 발현이 감소 되는 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 볼 때 4T1 유방암 실험모델에서 AZA에 의한 후성유전적 변화는 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현을 조절하면서 암줄기세포 특성을 변화시켜 암줄기세포의 증식 및 유지를 억제 할 것으로 사료된다. 향후 이러한 DNA 메칠화 억제를 항암치료에 응용하면, 암줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
비정상적 DNA메칠화는 암 발생에 있어 중요한 역할을 한다. 최근 연구에 의하면 암줄기세포 유지에 있어 DNA과메칠화가 연관되어 있다고 보고하고 있다. 따라서 본 연구는 4T1 유방암 실험모델에서 demethylating agent인 AZA 처리에 따른 후성유전적 변화가 암줄기세포의 유지 및 증식에 있어 어떠한 영향을 미치는지 조사 하였다. 4T1 세포에서 AZA 처리에 따른 tumorsphere 형성이 감소 하는 것을 in vitro 실험을 통해 관찰 하였고, in vivo 실험에서는 줄기세포 조절 유전자들 (Oct-4, Nanog. Sox2)의 발현이 감소 되는 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 볼 때 4T1 유방암 실험모델에서 AZA에 의한 후성유전적 변화는 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현을 조절하면서 암줄기세포 특성을 변화시켜 암줄기세포의 증식 및 유지를 억제 할 것으로 사료된다. 향후 이러한 DNA 메칠화 억제를 항암치료에 응용하면, 암줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
Aberrant DNA methylation plays an important role in the development of cancer. It has been reported recently that DNA hypermethylation is involved in the maintenance of cancer stem cells. The present study was designed to test the hypothesis that the demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA)...
Aberrant DNA methylation plays an important role in the development of cancer. It has been reported recently that DNA hypermethylation is involved in the maintenance of cancer stem cells. The present study was designed to test the hypothesis that the demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA), can inhibit the potential for maintenance of cancer stem cells. To validate this hypothesis, we used 4T1 syngeneic mouse models of breast cancer. The AZA pre-treated 4T1 cells showed a dramatic inhibition of tumorsphere formation, compared to their counterparts in vitro. In addition, the AZA treatment significantly suppressed the expression of stem regulator genes, such as oct-4, nanog and sox2, compared to counterparts in vivo. Therefore, selective inhibition of DNA methylation may be useful for stem-specific cancer therapy.
Aberrant DNA methylation plays an important role in the development of cancer. It has been reported recently that DNA hypermethylation is involved in the maintenance of cancer stem cells. The present study was designed to test the hypothesis that the demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA), can inhibit the potential for maintenance of cancer stem cells. To validate this hypothesis, we used 4T1 syngeneic mouse models of breast cancer. The AZA pre-treated 4T1 cells showed a dramatic inhibition of tumorsphere formation, compared to their counterparts in vitro. In addition, the AZA treatment significantly suppressed the expression of stem regulator genes, such as oct-4, nanog and sox2, compared to counterparts in vivo. Therefore, selective inhibition of DNA methylation may be useful for stem-specific cancer therapy.
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문제 정의
AZA에 의한 DNA 메칠화 억제 현상이 줄기세포 조절 전사인자들의 발현에 어떠한 영향을 주는 지 살펴보았다. BALB/c 마우스에 유방암 세포주를 주입하고 3주간 시험물질(AZA: 0.
최근 연구에 의하면 암줄기세포 유지에 있어 DNA과메칠화가 연관되 어 있다고 보고하고 있다. 따라서 본 연구는 4T1 유방암 실험모델에서 demethylating agent인 AZA 처리에 따른 후성유전적 변화가 암줄기세포의 유지 및 증식에 있어 어떠한 영향을 미치는지 조사 하였다. 4T1 세포에서 AZA 처 리에 따른 tumorsphere 형성이 감소 하는 것을 in vitro 실험을통해 관찰 하였고, in vitro실험에서는 줄기세포 조절 유전자들 (Oct-4, Nanog.
이러한 Poycomb의 대표적인 유전자인 Bmi-1 은 세포 성장과 분화에 관련된 유전자들을 조절하는 전사 억제 유발인자로서 여 러 종양 조직에서 과발현 되어 있는데, INK4A와 ARF의 발현을 억제 하면서 줄기세포의 자가재생능이나 유지에 관여한다고 알려져 있다[17]. 따라서 우리는 Polycomb 유전자(Bmi-1, ARF, INK4A)들의 과메 칠화가 줄기세포 조절 유전자(SRG)의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. 그러나, 본 연구에서 AZA는 Bmi-1, ARF, INK4A의 메칠 화나 발현에 유의적 인 변화를 초래하지 않았다(Data not shown).
우리는 이미 AZA가 종양억제 유전자인 E-cadherin 발현이 저해된 유방암 세포에서 E-cadherin 발현을 복원시켜 암의 성장을 억제하고, 암의 전이를 감소시키는 것을 보고 하였다[19]. 이러한 논문을 바탕으로 본 연구에서는 암줄기세포 유지에서의 AZA의 영향을 조사 하였다. 본 실험에서는 먼저 유방암 세포에서 AZA가 tumorsphere 형성에 미치는 영향을 살펴 본 결과, AZA가 암줄기 세포의 특성인 자가재생 (self-re newal) 능력을 감소시켜 tumorsphere 형성을 억제 한 것을관찰 하였다.
12, 13, 20, 24, 30]. 후성유전적 변이 현상인 DNA메칠화는 암 발생 초기에 일어나는 특이적 현상으로 인식되고 있을 뿐만 아니라, 암이 발생하는 해당조직에 따라 특이적인 유전자군의 메칠화 패턴을 나타내고 있어, 이러한 특이성은 암 발생에 대한 대표적인 비유전적 소인이라 할 수 있다[10, 21, 25, 28, 29], 따라서 우리는 DNA 메칠화의 억제가 암줄기세포 유지에 있어 어떠한 영향을 미치는지 연구를 수행 하기 위해서, 유방암 마우스 모델을 이용하여 demethylating agent인 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA)에 의한 후성유전적 변화가 암줄기세포 유지와 증식을 억제할 수 있는지를 연구하였다.
제안 방법
전체 RNA 농도는 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Tech nologies, Rockland, DE)를 이용하여 정제도를 확인하고 정량하였다. 1 ㎍의 total RNA로부터 random hexamer와 200 unit 의 Superscrip Reverse Transcriptase (Invitrogen corporation, Carlsbad, CA)를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를역전사 합성하였다. Oct-4, Nanog, Sox2, c-Myc, Klf4의 발현정도를 정량 하기 위해 RTQ-PCR 분석은 SYBR green dye (ABI Biosystems, Foster City, CA)와 함께 ABI 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)을 이 용하여 평 가하였다.
따라서 본 연구는 4T1 유방암 실험모델에서 demethylating agent인 AZA 처리에 따른 후성유전적 변화가 암줄기세포의 유지 및 증식에 있어 어떠한 영향을 미치는지 조사 하였다. 4T1 세포에서 AZA 처 리에 따른 tumorsphere 형성이 감소 하는 것을 in vitro 실험을통해 관찰 하였고, in vitro실험에서는 줄기세포 조절 유전자들 (Oct-4, Nanog. Sox2)의 발현이 감소 되는 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 볼 때 4T1 유방암 실험모델에서 AZA에 의한후성유전적 변화는 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현을조절하면서 암줄기세포 특성을 변화시켜 암줄기세포의 증식및 유지를 억제 할 것으로 사료된다.
측정하였다. 4Tl-luc cell 각 5xl03 개를 96-well plate에 seeding하고 24시간 전배 양(pre-incubation)을 하였다. 그 후 AZA를 여 러 농도별로 처 리하고 72시간 배 양한 다음 CCK-8 용액(10 ㎕/100 ㎕ cell culture medium)을 각 well에 첨가 시켜 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
Louis, MO), B27 (1:50 dilution, Invitrogen, Grand Island, NY) 이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양하였다. 7일후 tumorsphere 형성을 inverted microscope를 이 용하여 50X 배율로 촬영하였다. sphere의 수와 크기는 Image-Pro Plus program (MediaCybernetics, Silver Spring, MD)으로 측정 하였다.
). Animals were imaged weekly for 3 weeks using an in vivo imaging system (IVIS, Caliper, Alameda, CA). (A) Tumor growth was monitored and quantified weekly by BLI and measurements.
BALB/c 마우스에 유방암 세포주를 주입하고 3주간 시험물질(AZA: 0.1 mg/kg B.W.)을 처리한 후 종양조직을 얻어 RTQ-PCR을수행하였다. 그 결과 AZA를 처리한 군에서 Oct-4, Nanog, Sox2의 mRNA 발현이 대조군 보다 1.
1 ㎍의 total RNA로부터 random hexamer와 200 unit 의 Superscrip Reverse Transcriptase (Invitrogen corporation, Carlsbad, CA)를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를역전사 합성하였다. Oct-4, Nanog, Sox2, c-Myc, Klf4의 발현정도를 정량 하기 위해 RTQ-PCR 분석은 SYBR green dye (ABI Biosystems, Foster City, CA)와 함께 ABI 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)을 이 용하여 평 가하였다. 내 재 대조(endogenous control) 유전자는 mouse HPRT를 사용하였다.
Tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보기 위해 at tachment plates 에 4Tl-luc cell을 seeding 하고 1 μM의 AZA를처리하였다. 3일 후 Trypsin-EDTA를 처리해 single cell을 얻어 ultra-low attachment plates (Coming, NY, USA) 에 bl/ 개를 seeding 한 후 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml bFGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), 4 ㎍/ml heparin (Sigma, St.
3일 내지 4일 간격으로 계대배양 하였다. 배양액으로는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY) 이 첨가된 DMEM (Invitrogen) 을 이용 하였으며 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양 하였다. 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA)는 Sigma (St.
사육 상자는 시험시간, 시험번호, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다. 사육실에반입되는 사료와 깔집, 물(상수도)은 121℃에서 15분간 고압멸균 하였고, 사료와 음수는 자유섭취 시켰다. 체중계 및 실험도구 등은 알코올 소독 후 자외선 멸균 뒤 반입하였다.
2). 세포생존율 실험을 통해 AZA가 4T1-1UC 유방암세포의 IC50 (The half maximal inhibitory concentration) 1 μM 내외 라는 것을 알 수 있었고, 이 농도를 이용하여 암줄기세포 배양 특성 중 하나인 tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보았다.
시험기간 중 모든 동물에 대하여 매일 1회 일정한 시간에 일반증상의 변화, 빈사 및 사망유무를 관찰하였으며, 체중은 실험 시작 후 3주까지 매주 1회 측정 하였다. 시험 중 폐사 동물은 없었다.
4Tl-luc 세포를 mouse 주입하고 3주 뒤에 종양조직을 절제하여 신선 조직을 액체질소에 보관 하였다. 액체질소에 냉동 보관된 조직 30 mg을 조직분쇄기로 분쇄한 뒤 Rneasy Plus mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA가배제된 RNA (total RNA)만을 추출하였다. 전체 RNA 농도는 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Tech nologies, Rockland, DE)를 이용하여 정제도를 확인하고 정량하였다.
연쇄반응 시 최종 부피는 50 ㎕가 되도록 하였으며, cDNA의 경우 각 시료의 RNA 1 ㎍에서 역전사 되도록 하였다. 연쇄반응 수행절차는 처음 95℃에서 5분간 변성하고, 94°C에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초를 주기로 40회 반복 수행 한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 신장(extension) 하였다. 각 시료의 발현결과 비교분석은 제조사에서 권고한 표준 곡선 분석법 (standard curve method)을 사용하였다.
내 재 대조(endogenous control) 유전자는 mouse HPRT를 사용하였다. 연쇄반응 시 최종 부피는 50 ㎕가 되도록 하였으며, cDNA의 경우 각 시료의 RNA 1 ㎍에서 역전사 되도록 하였다. 연쇄반응 수행절차는 처음 95℃에서 5분간 변성하고, 94°C에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초를 주기로 40회 반복 수행 한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 신장(extension) 하였다.
본 실험에서는 먼저 유방암 세포에서 AZA가 tumorsphere 형성에 미치는 영향을 살펴 본 결과, AZA가 암줄기 세포의 특성인 자가재생 (self-re newal) 능력을 감소시켜 tumorsphere 형성을 억제 한 것을관찰 하였다. 이러한 결과를 미루어 우리는 줄기세포 조절 유전자(stem regulator gene, SRG)들의 발현에서 비정상적인 DNA 메 칠화가 영 향을 줄 것으로 예상하고/ in vivo 연구에서 AZA를 이용하여 메칠화 현상을 억제 한 뒤 전사인자들의 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 0ct4, Nanog, Sox2의 발현이감소되는 것을 최초로 증명하였다.
같은 배양 조건에서 암세포를 키우게 되면, 분화된 암세포는 제거되고 암줄기세포들만 살아남아서 tumorsphere를 형성하게 된다[22]. 이런 암줄기세포 배양특성 중 하나인 tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보기 위해 tumor sphere 배 양실험을 수행하였다. Attachment plates에 4Tl-luc cell을 seeding 하고 1 μM 의 AZA를 처리하고, 3일 후 Trypsin-EDTA를 처 리해 single cell을 얻 어 ultra-low attach ment plates (Coming) 에 배 양하였다.
입수된 동물은 케이지에 5마리씩 분류한 후 온도 20~22℃, 상대습도 40-60%, 조명시간 12시간(07:00 점등〜19:00 소등), 환기횟수 50회/시간, 조도는 150〜300 lux로 제어된 환경 조건에서 사육되었다. 동물실의 온도와 습도는 자동온습도측정기에 의하여 매시간 마다 측정되었으며, 동물실의 환경측정결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다.
, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA가배제된 RNA (total RNA)만을 추출하였다. 전체 RNA 농도는 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Tech nologies, Rockland, DE)를 이용하여 정제도를 확인하고 정량하였다. 1 ㎍의 total RNA로부터 random hexamer와 200 unit 의 Superscrip Reverse Transcriptase (Invitrogen corporation, Carlsbad, CA)를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를역전사 합성하였다.
종양 세포 주입 3주 후 모든 그룹의 마우스를 CO2 가스를이용하여 안락사하고, 멸균된 수술용 가위와 핀셋을 이용하여실험동물의 유방지방체(m.f.p.)에서 종양조직을 절제하여 분자생물학적 검사를 수행하기 위해 액체질소에 보관 하였다.
1과 같이 3개 실험군으로 나누어 실험 하였으며, 실험군은 그룹 당 10마리씩 설정하였다. 즉 모든 그룹의 BALB/c 암컷 마우스에 4Tl-luc 종양세포를 5x1/ 수집하여 50 ㎕씩 유방지방체(m.f.p.)에 접종하고, 대조군 1군에는 0.2% DMSO를 일주일에 5회 3주간 복강투여 하였고, 투여군 2군과 3군에는 AZA (2군: 0.05 mg/kg B.W., 3군: 0.1 mg/kg B.W.)를 투여 하였다. 본 연구에서의 모든 동물실험은 가천의과학대 학교 이길여 암·당뇨연구원 동물실험윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 의 동물실험 표준작업지침서(Standard Operation Procedures,0SOP)에 따라 수행되었다.
시험기간 중 1주 1회 실시하였다. 측정방법은 firefly lucifer- ase의 기질인 D-luciferin (Caliper, Alameda, CA)을 150 mg/ kg B.W. 복강 주입한 뒤 5분 후 IVIS (Caliper)를 이용하여 photon/sec로 크기를 측정하였다. Bioluminescence 결과는 Living Image 3.
대상 데이터
배양액으로는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY) 이 첨가된 DMEM (Invitrogen) 을 이용 하였으며 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양 하였다. 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였고, DMSO에 녹여서 5 mg/ml로 소분하여 냉동상태로(-80℃) 보존하였다. 사용 시 생리식염수에 희석하여사용하였다.
5주령의 BALB/c 마우스 암컷은 (주)오리엔트에서 구입하였다. 모든 동물은 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) 동물로 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
Oct-4, Nanog, Sox2, c-Myc, Klf4의 발현정도를 정량 하기 위해 RTQ-PCR 분석은 SYBR green dye (ABI Biosystems, Foster City, CA)와 함께 ABI 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)을 이 용하여 평 가하였다. 내 재 대조(endogenous control) 유전자는 mouse HPRT를 사용하였다. 연쇄반응 시 최종 부피는 50 ㎕가 되도록 하였으며, cDNA의 경우 각 시료의 RNA 1 ㎍에서 역전사 되도록 하였다.
모든 동물은 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) 동물로 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 30마리를 Fig. 1과 같이 3개 실험군으로 나누어 실험 하였으며, 실험군은 그룹 당 10마리씩 설정하였다. 즉 모든 그룹의 BALB/c 암컷 마우스에 4Tl-luc 종양세포를 5x1/ 수집하여 50 ㎕씩 유방지방체(m.
마우스 유방암 세포주 4TLhic은 Caliper life science (Alameda, CA)로부터 분양 받아 100 mm 세포배양접시에 배양하였으며 3일 내지 4일 간격으로 계대배양 하였다. 배양액으로는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY) 이 첨가된 DMEM (Invitrogen) 을 이용 하였으며 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양 하였다.
모든 동물은 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) 동물로 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 30마리를 Fig.
발광물질이 표지된 4Tl-luc 유방암 종양세포를 수집 해 BALB/c female mice의 유방지방체(m.f.p.)에 접종 한 후 IVIS를 이용해 실험동물에서 영상을 획득하였다. 영상분석 결과에서, 종양세포 주입 일주일 후 모든 그룹에서 종양이 형성되었다.
본 연구에서는 DNA 메 칠화를 억제하는 약물로 AZA를 사용하였다. AZA는 cytidine과 유사한 물질로 작용기전은 주로 DNMT에 비가역적인 공유결합을 통하여 DNMT의 활성을 방해하며 메칠화 수위를 낮춰 유전자의 표현을 조절하는 기능을한다.
각 시료의 발현결과 비교분석은 제조사에서 권고한 표준 곡선 분석법 (standard curve method)을 사용하였다. 사용된 primer는 0ct4: 5'-GCA TTC AAA CTG AGG CAC CA3 (F), 5'-AGC TTC TTT CCC CAT CCC A3 (R); Nanog: 5'-GCC TTA CGT ACA GTT GCA GCA A3 (F), 5'-TCA CCT GGT GGA GTC ACA GAG T3 (R); Sox2: 5'-GAG TGG AAA CTT TTG TCC GAG A3 (F), 5Z-GAA GCG TGT ACT TAT CCT TCT TCA T3 (R); c-Myc: S-CGG ACA CAC AAC CGT CTT GGA A3 (F), 5'-AGG ATG TAG GCG GTG GCT TTT-3' (R); K1F4: 5'-GGT GCA GCT TGC AGC AGT AA-3' (F), 5'-AAA GTC TAG GTC CAG GAG GTC GTT3 (R); HPRT: 5'-GCC TAA GAT GAG CGC AAG TTG3 (F), 5'-TAC TAG GCA GAT GGC CAC AGG3 (R)이며, 유전자의 발현양을 측정하기 위해 동일시료 cDNA를 사용하여 mouse HPRT 발현양을 측정하여 정량하였다.
데이터처리
복강 주입한 뒤 5분 후 IVIS (Caliper)를 이용하여 photon/sec로 크기를 측정하였다. Bioluminescence 결과는 Living Image 3.0 software (Caliper)를 이용해 분석하였다.
모든 실험결과는 평균치와 표준오차를 사용하여 나타내고각 군간 비교는 Prism 5 program (GraphPad, San Diego, USA)을 이용하여 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 실시하였다. 대조군과 비교하여 P 값이 0.
이론/모형
AZA에 의한 세포 독성을 알아보기 위하여 CCK-8 assay (Dojindo Molecular Technologies, Inc)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 4Tl-luc cell 각 5xl03 개를 96-well plate에 seeding하고 24시간 전배 양(pre-incubation)을 하였다.
연쇄반응 수행절차는 처음 95℃에서 5분간 변성하고, 94°C에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초를 주기로 40회 반복 수행 한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 신장(extension) 하였다. 각 시료의 발현결과 비교분석은 제조사에서 권고한 표준 곡선 분석법 (standard curve method)을 사용하였다. 사용된 primer는 0ct4: 5'-GCA TTC AAA CTG AGG CAC CA3 (F), 5'-AGC TTC TTT CCC CAT CCC A3 (R); Nanog: 5'-GCC TTA CGT ACA GTT GCA GCA A3 (F), 5'-TCA CCT GGT GGA GTC ACA GAG T3 (R); Sox2: 5'-GAG TGG AAA CTT TTG TCC GAG A3 (F), 5Z-GAA GCG TGT ACT TAT CCT TCT TCA T3 (R); c-Myc: S-CGG ACA CAC AAC CGT CTT GGA A3 (F), 5'-AGG ATG TAG GCG GTG GCT TTT-3' (R); K1F4: 5'-GGT GCA GCT TGC AGC AGT AA-3' (F), 5'-AAA GTC TAG GTC CAG GAG GTC GTT3 (R); HPRT: 5'-GCC TAA GAT GAG CGC AAG TTG3 (F), 5'-TAC TAG GCA GAT GGC CAC AGG3 (R)이며, 유전자의 발현양을 측정하기 위해 동일시료 cDNA를 사용하여 mouse HPRT 발현양을 측정하여 정량하였다.
동물실의 온도와 습도는 자동온습도측정기에 의하여 매시간 마다 측정되었으며, 동물실의 환경측정결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다. 동물의 개체식별은 ear-punching법을 사용하였으며, tag 표시법에의해서 사육 상자를 구분하였다. 사육 상자는 시험시간, 시험번호, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다.
)를 투여 하였다. 본 연구에서의 모든 동물실험은 가천의과학대 학교 이길여 암·당뇨연구원 동물실험윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 의 동물실험 표준작업지침서(Standard Operation Procedures,0SOP)에 따라 수행되었다.
종양조직에서 줄기세포조절유전자(SRG)의 mRNA 발현을정량적으로 분석하기 위해 RTQ-PCR 방법을 사용하였다. 4Tl-luc 세포를 mouse 주입하고 3주 뒤에 종양조직을 절제하여 신선 조직을 액체질소에 보관 하였다.
성능/효과
0.1 μM〜50 μM 농도의 AZA를 4Tl-luc 세포에 처리한 후 72시간 후에 4Tl-luc 생존율을 CCK-8 assay로 측정한 결과처리하지 않은 대조군과 비교하여 실험군의 세포가 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 관찰하였다(Fig. 2). 세포생존율 실험을 통해 AZA가 4T1-1UC 유방암세포의 IC50 (The half maximal inhibitory concentration) 1 μM 내외 라는 것을 알 수 있었고, 이 농도를 이용하여 암줄기세포 배양 특성 중 하나인 tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보았다.
Attachment plates에 4Tl-luc cell을 seeding 하고 1 μM 의 AZA를 처리하고, 3일 후 Trypsin-EDTA를 처 리해 single cell을 얻 어 ultra-low attach ment plates (Coming) 에 배 양하였다. 7일 후 tumorsphere 형성을 inverted microscope를 이용하여 촬영한 결과 실험 대조군에 비해 약물 처 리군의 tumorsphere의 크기와 수가 현저하게 감소하였다(Fig. 3). 이러한 결과로 AZA에 의한 메칠화 억제현상이 암줄기세포의 유지와 생성을 억제 할 수 있음을 알수 있었다.
이러한 결과를 미루어 우리는 줄기세포 조절 유전자(stem regulator gene, SRG)들의 발현에서 비정상적인 DNA 메 칠화가 영 향을 줄 것으로 예상하고/ in vivo 연구에서 AZA를 이용하여 메칠화 현상을 억제 한 뒤 전사인자들의 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 0ct4, Nanog, Sox2의 발현이감소되는 것을 최초로 증명하였다. 이 유전자들은 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 전사 인자 중에서 특히 만능성 유지에 중요한 역할을 하는 인자들로 알려져 있에4], AZA에 의한 DNA 메칠화의 억제는 암줄기세포의 증식 억제에 있어 중요한 역할을 할 것으로 사료 된다.
)을 처리한 후 종양조직을 얻어 RTQ-PCR을수행하였다. 그 결과 AZA를 처리한 군에서 Oct-4, Nanog, Sox2의 mRNA 발현이 대조군 보다 1.5배 이상 감소하였지만 c-Myc, Klf4의 발현에는 변화가 없었다(Fig. 5).
영상분석 결과에서, 종양세포 주입 일주일 후 모든 그룹에서 종양이 형성되었다. 그러나 시간이 지날수록 종양 발광 신호가 시험물질을 처리한 군(Group 2, AZA: 0.05 mg/kg B.W., Group 3, AZA: 0.1 mg/kg B.W.) 이 용매 대조군(Group 1: 0.2% DMSO)보다낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 수치화한 데이터를 보면 전체적으로 실험군의 photon 평균값이 대조군보다 2주차부터 4배 감소하였다(Fig.
이러한 논문을 바탕으로 본 연구에서는 암줄기세포 유지에서의 AZA의 영향을 조사 하였다. 본 실험에서는 먼저 유방암 세포에서 AZA가 tumorsphere 형성에 미치는 영향을 살펴 본 결과, AZA가 암줄기 세포의 특성인 자가재생 (self-re newal) 능력을 감소시켜 tumorsphere 형성을 억제 한 것을관찰 하였다. 이러한 결과를 미루어 우리는 줄기세포 조절 유전자(stem regulator gene, SRG)들의 발현에서 비정상적인 DNA 메 칠화가 영 향을 줄 것으로 예상하고/ in vivo 연구에서 AZA를 이용하여 메칠화 현상을 억제 한 뒤 전사인자들의 발현 양상을 조사하였다.
Sox2)의 발현이 감소 되는 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 볼 때 4T1 유방암 실험모델에서 AZA에 의한후성유전적 변화는 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현을조절하면서 암줄기세포 특성을 변화시켜 암줄기세포의 증식및 유지를 억제 할 것으로 사료된다. 향후 이러한 DNA 메칠화억제를 항암치료에 응용하면, 암줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서demethylating agent인 AZA는 줄기세포 조절 유전자들(0ct4 Nanog, Sox2)의 발현을 감소시켜 암 줄기세포의 증식을 억제 시킨 것으로 사료된다. 그러므로, 선택적인 DNA 메칠화의 억제를 항암치료에 응용하면, 암 줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
)에 접종 한 후 IVIS를 이용해 실험동물에서 영상을 획득하였다. 영상분석 결과에서, 종양세포 주입 일주일 후 모든 그룹에서 종양이 형성되었다. 그러나 시간이 지날수록 종양 발광 신호가 시험물질을 처리한 군(Group 2, AZA: 0.
3). 이러한 결과로 AZA에 의한 메칠화 억제현상이 암줄기세포의 유지와 생성을 억제 할 수 있음을 알수 있었다.
4B). 이러한 결과를 바탕으로 4** 종양세포의 성장을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
2% DMSO)보다낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 수치화한 데이터를 보면 전체적으로 실험군의 photon 평균값이 대조군보다 2주차부터 4배 감소하였다(Fig. 4A). 이는 시험물질을 처리 한 뒤, 3주후에 측정 한 BLI (bioluminescent imaging) 결과에서도 실험군의 종양 덩어리가 유의적으로 감소한 것을 관찰 할 수 있었다(Fig.
후속연구
본 연구에서demethylating agent인 AZA는 줄기세포 조절 유전자들(0ct4 Nanog, Sox2)의 발현을 감소시켜 암 줄기세포의 증식을 억제 시킨 것으로 사료된다. 그러므로, 선택적인 DNA 메칠화의 억제를 항암치료에 응용하면, 암 줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
종양 조직에서 나타나는 비정상적 DNA메칠화 패턴은 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현에 있어서 매우 중요하며 [20, 23], 이러한 유전자의 발현 기전을 연구하는 것은 줄기세포 표적 치료에 있어 매우 중요한 연구 분야가 될 것으로 사료된다. 본 연구에서demethylating agent인 AZA는 줄기세포 조절 유전자들(0ct4 Nanog, Sox2)의 발현을 감소시켜 암 줄기세포의 증식을 억제 시킨 것으로 사료된다.
본 연구 결과로 볼 때 4T1 유방암 실험모델에서 AZA에 의한후성유전적 변화는 줄기세포 조절 유전자(SRG)들의 발현을조절하면서 암줄기세포 특성을 변화시켜 암줄기세포의 증식및 유지를 억제 할 것으로 사료된다. 향후 이러한 DNA 메칠화억제를 항암치료에 응용하면, 암줄기세포를 파괴함으로써 암의 재발 및 악성화를 효과적으로 제어 할 수 있을 것으로 사료된다.
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