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문제 정의
- 본 연구에서는 유통 및 보관 과정에서 선별작업을 통해 버려지는 농산물 중 특히 배추에서 무름병 유발 세균을 순수분리 및 동정하여 분류학상의 다양한 특징 및 병원성에 대해 조사하고, 세균성 식물병원균의 연구에 있어서 유용한 in vitro 실험모델을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 1차 선정된 RB 1~8 균주를 형성된 집락의 크기, 색깔 및 풍기는 냄새에 따라 3개의 그룹으로 나눌 수 있었으며, 연구의 편의를 위하여 각 그룹의 대표균으로 RBI, RB2 및 RB6를 선정하여 이후 계속되는 연구에 사용하였다. RB1 균주는 노란색의 작고 둥근 집락으로 단내가 가미된 썩은 냄새가 났으며, RB2 와 RB6 균주는 노란빛의 투명한 둥근 집락으로 형태상으로는 유사하였으나 RB2는 시큼하면서 매우 불쾌한 냄새가 났으며 RB6는 다른 균주에 비해 부패한 냄새가 약했다.
- RBI, RB2 및 RB6 균주들이 비록 배추의 무름병을 유발한다는 것이 실험을 통해 증명되었지만 이들이 다른 과일 또는 채소에도 비슷한 병변을 유발하는지를 알아보기 위하여 농산물거래소에서 주로 거래되는 과일 및 채소류를 확보하여 병변 형성을 관찰하였다(Table 3). 특이하게도 이들 균주들은 가지와 파프리카를 선택적으로 무르게 하였다.
- LB 평판배지에서 자라나온 세균 집락의 크기, 모양, 가장자리, 두께, 투명도, 색깔, 점도 둥 형태적 특성이 다른 80개 집락을 순수 분리하였다. 각 집락을 2 ml의 LB 액체배지에서 배양 후 배양액 1 ml을 취하여 원심분리법으로 균체를 얻은 후 멸균 생리식염수로 2 회 세척한 다음 1 ml의 멸균 생리식염수에 재현탁시켰다. 분리균의 무름병 유발 여부를 확인하기 위해 싱싱한 배추 잎의 표면을 멸균증류수로 세척하고 잎의 주맥 부위를 약 20 mmx20 mm의 일정한 크기로 자른 다음 습기가 유지된 페트리 접시에 넣어 배추 잎의 표면에 상처유무 조건을 달리하여 균액 10 ㎕를 각각 떨어뜨린 후 30°C에서 24 -48 시간 배양하면서 무름병 병변을 관찰하였다.
- 실시하였다. 공시균주를 LB agar에 접종하여 30°C에서 24 시간 배양한 후 단일집락을 취하여 멸균된 0.45% Nad 수용액 3 ml에 현탁시켜 MacFarland NO. 0.5가 되도록 탁도를 맞춘 후 GN 카드를 장착하여 VITEK 2 COMPACT카드 set up 절차를 진행하였다.
- 배양된 균을 그람염색법으로 염색한 후 광학현미경으로 각 균주의 형태학적 특징을 관찰하였다. 투과전자현미경(TEM) 으로 관찰할 재료는 일반적인 방법인 2.
- 배추 무름병을 대상으로 식물병원균 감염모델을 확립하기 위하여 무름병변을 가진 배추조직으로부터 80개의 독립된 세균 집락을 순수 분리하였다. 이들 균을 감염되지 않은 배추 잎의 주맥부위에 접종하여 24 -48 시간 만에 무름병변을 나타내는 8개의 균주를 1차 선별하였다.
- 배추 표면 상처 유무에 따른 무름병 유발정도 조사 및 원인균의 접종량에 따른 무름병 유발정도를 관찰하였다. RBI, RB2및 RB6 모두 배추에 상처를 내지 않은 상태에서도 무름병을 유발하였으며, 배추에 상처를 낸 상태에서 접종한 경우에는 그렇지 않은 경우 보다 병변을 나타내는 지름의 크기가 증가하였다.
- 무름병변의 크기는 초기 접종량에 비례하여 증가하는 현상을 보이는 것으로 보아 병변은 이들 균주들의 생육과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 추정된다. 병변의 크기대조구로 PBS,Salmondla typhimuium Escherichia coli 를 사용하였는데 이들모두는 배추 무름병변을 나타내지 않았다. 상기 결과는 RB1, RB2 및 RB6 모두 일정량의 균체가 있으면 배추의 상처 유무와 상관없이 감염이 가능하다는 것을 암시하며, 그 피해를 줄이기 위해서는 배추의 경작, 저장, 운반 과정에서 상처가 나지 않도록 관리하는 것이 중요함을 암시한다.
- 각 집락을 2 ml의 LB 액체배지에서 배양 후 배양액 1 ml을 취하여 원심분리법으로 균체를 얻은 후 멸균 생리식염수로 2 회 세척한 다음 1 ml의 멸균 생리식염수에 재현탁시켰다. 분리균의 무름병 유발 여부를 확인하기 위해 싱싱한 배추 잎의 표면을 멸균증류수로 세척하고 잎의 주맥 부위를 약 20 mmx20 mm의 일정한 크기로 자른 다음 습기가 유지된 페트리 접시에 넣어 배추 잎의 표면에 상처유무 조건을 달리하여 균액 10 ㎕를 각각 떨어뜨린 후 30°C에서 24 -48 시간 배양하면서 무름병 병변을 관찰하였다.
- 분리균의 분자생물학적인 동정을 위하여 각 균의 rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 일반적인 방법으로 각 균의 염색체 DNA를 추출한 후 세균의 rDNA 증폭에 흔히 활용되는primer인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 와 1512R (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR법으로 rDNA를 증폭하였다.
- 생화학적 특성을 알아보기 위해 1차 실험균주의 Gram 염색 결과를 바탕으로 Gram 음성 세균 동정용 API 20E strip (Biomerieux)과 API 매뉴얼을 이용하였다. 동정을 위한 데이터분석은 인터넷 사이트 https://apiweb.
- 선택배지 선정을 위한 기초자료를 마련하기 위해 식품공전에 규정되어있는 식중독균 9종에 대한 선택배지에 균주를 3분도 말한 다음 호기적, 미호기적 및 혐기적 조건을 만들어 30°C 에서 24 -48 시간 배양하여 집락의 생장 여부와 양상을 관찰하였다.
- 크기, 모양, 형태, 냄새, 색깔의 특성이 다르다고 판단되는 집락을 순수 분리하였다. 시료채취 및 순수 분리의 반복과정을 통해 80개의 균주를 선정하여 다음 실험에 사용하였다.
- 염기서열 해석의 정확성을 높이기 위하여 증폭된 DNA의 양 가닥서 열을 읽어 비교하였다. 공시균주의 16S rDNA 염기서 열을NCBI blast search를 통해 분석한 결과 RB1 은 Erwinia car- otovcnun subsp.
- 용혈성 확인 시험은 Blood agar plate에 도말하여 30°C에서 24 시간 호기 배양하여 접종선 부위의 투명한 용혈대 형성유무를 관찰하였으며, 운동성 시험은 Motility Gelatin-heart Infusion Medium (Difco)에 접종한 후 30°C에서 24 시간 호기배양하여 접종선 주위에 퍼져 자라는지 유무를 확인하였다.
- 순수 분리하였다. 이들 균을 감염되지 않은 배추 잎의 주맥부위에 접종하여 24 -48 시간 만에 무름병변을 나타내는 8개의 균주를 1차 선별하였다. 다양한 미생물학적, 생화학적, 형태학적인 시험을 통하여 분석한 결과 서로 다른 특성을 나타내는 균이라고 여겨지는 3개의 균을 최종 선정하였고 이들은 모두 그람 음성균으로 판명되었고 RBI, RB2 및 RB6로 명명하였다.
- 일반적으로 흔히 이용되는 rDNA 염기서열 분석을 통한 균의 동정을 위하여 RBI, RB2 및 RB6 염색체 DNA로부터 16S rDNA를 PCR법으로 증폭하여 염기서열을 확보하였다. 염기서열 해석의 정확성을 높이기 위하여 증폭된 DNA의 양 가닥서 열을 읽어 비교하였다.
- 일반적인 방법으로 각 균의 염색체 DNA를 추출한 후 세균의 rDNA 증폭에 흔히 활용되는primer인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 와 1512R (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR법으로 rDNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA의 염기서열은 (주)Genotech에 의뢰하여 해독하였다. 해독되어진 염기서열은 NCBI Blast search를 통해서 검색된 결과로 분석하였다.
- 채취한 배추의 병변 조직을 멸균가위로 10 mm xlO mm 크기로 잘라낸 다음 멸균된 증류수로 표면을 씻고 5 ml의 생리식염수에 넣어 멸균된 면봉으로 조직을 마쇄한 후, Vortex로 10 분간 미생물을 탈리시켜 이를 검 액으로 하였다. 검액을 10 분 동안 실온에 정치한 후 멸균식염수로 희석한희석액 200 ㎕를 영양배지인 Luria-Bertani agar (LB agar) 에 도말한 다음 30°C에서 24 -48 시간 배양하였다[2].
- 5% glutaraldehyde 및 1% osmium tetroxide (OsOQ로 고정시킨 후 에탄올 처리를 통한 탈수과정을 거쳐 Epon 812에 포매하였다. 포매된 검체는 ultrathin section 후 uranyl acetate와 lead citrate 용액으로 이중 염색하여 투과전자현미경(JEM-1200EXU, JEOL)으로 관 찰하였다.
- 증폭된 DNA의 염기서열은 (주)Genotech에 의뢰하여 해독하였다. 해독되어진 염기서열은 NCBI Blast search를 통해서 검색된 결과로 분석하였다.
대상 데이터
- 표준균주는 한국농업 미생물자원센타로 부터 분양받아 생화학실험에 사용하였다(Table 1). LB 평판배지에서 자라나온 세균 집락의 크기, 모양, 가장자리, 두께, 투명도, 색깔, 점도 둥 형태적 특성이 다른 80개 집락을 순수 분리하였다. 각 집락을 2 ml의 LB 액체배지에서 배양 후 배양액 1 ml을 취하여 원심분리법으로 균체를 얻은 후 멸균 생리식염수로 2 회 세척한 다음 1 ml의 멸균 생리식염수에 재현탁시켰다.
- Sliced fresh napa cabbage parts (20 mm×20 mm) were placed moisturized petridish. The volume of 10 ㎕ of RB1 (A), RB2 (B) and RB6 (C) with indicated CFU were loaded on the top of cabbage surface. Disease symptom(depicted as rotten area, mm2) was assayed after 24 hr incubation at 30℃.
- API 매뉴얼을 이용하였다. 동정을 위한 데이터분석은 인터넷 사이트 https://apiweb.biomerieux.com/ servlet/Identify를 이용하였다.
- 배추를 무르게 하는 원인 세균을 분리하기위해 2007년 4 월 〜6월까지 부산광역 시 반여농산물도매시 장의 선별과정 에서 버려진 배추의 병변 조직을 무균적으로 채취하여 시료로 이용하였다. 채취한 배추의 병변 조직을 멸균가위로 10 mm xlO mm 크기로 잘라낸 다음 멸균된 증류수로 표면을 씻고 5 ml의 생리식염수에 넣어 멸균된 면봉으로 조직을 마쇄한 후, Vortex로 10 분간 미생물을 탈리시켜 이를 검 액으로 하였다.
- 순수 분리된 80개의 균주 각각을 일정한 크기로 자른 싱싱한 배추의 주맥 표면에 상처유무의 조건을 달리하여 접종한 결과 상처를 내지 않은 경우 보다 상처를 낸 배추 조직의 무름 면적이 더 넓게 관찰되었으며, 80개의 실험균주 중 배추 무름증상이 뛰어난 8개의 균주를 Sot Rot Bacteria (RB) 1 〜8이라 명명하고 1차 실험 균주로 선정하였다(Fig. 1).
- 배양된 균을 그람염색법으로 염색한 후 광학현미경으로 각 균주의 형태학적 특징을 관찰하였다. 투과전자현미경(TEM) 으로 관찰할 재료는 일반적인 방법인 2.5% glutaraldehyde 및 1% osmium tetroxide (OsOQ로 고정시킨 후 에탄올 처리를 통한 탈수과정을 거쳐 Epon 812에 포매하였다. 포매된 검체는 ultrathin section 후 uranyl acetate와 lead citrate 용액으로 이중 염색하여 투과전자현미경(JEM-1200EXU, JEOL)으로 관 찰하였다.
- of Determinative Bacteriology를 참고하였다[3,5]. 표준균주는 한국농업 미생물자원센타로 부터 분양받아 생화학실험에 사용하였다(Table 1). LB 평판배지에서 자라나온 세균 집락의 크기, 모양, 가장자리, 두께, 투명도, 색깔, 점도 둥 형태적 특성이 다른 80개 집락을 순수 분리하였다.
이론/모형
- 공시 균주의 분류학상 위치를 검토하기위한 실험은Manual of Methods for General Bacteriology 와 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology를 참고하였다[3,5]. 표준균주는 한국농업 미생물자원센타로 부터 분양받아 생화학실험에 사용하였다(Table 1).
- 미생물 동정검사의 정확도를 높이기 위하여 전자동 미생물검사장비인 VITEK 2 COMPACT (Biomerieux)를 활용하여 동정을 실시하였다. 공시균주를 LB agar에 접종하여 30°C에서 24 시간 배양한 후 단일집락을 취하여 멸균된 0.
성능/효과
- API20E 시험에 사용한 방법보다 더욱 더 다양한 생화학적 반응을 알아보기 위해 미생물자동동정분석기 인 VITEK 2COMPACT (Biomerieux) Gram Negative card를 분석한 결과에 의 하면 공시 균주 RBI, RB2, RB6 모두 Pantoea 속과 94% 이상의 상동성을 나타내었다(data not shown).
- 이후 계속되는 연구에 사용하였다. RB1 균주는 노란색의 작고 둥근 집락으로 단내가 가미된 썩은 냄새가 났으며, RB2 와 RB6 균주는 노란빛의 투명한 둥근 집락으로 형태상으로는 유사하였으나 RB2는 시큼하면서 매우 불쾌한 냄새가 났으며 RB6는 다른 균주에 비해 부패한 냄새가 약했다.
- 접종량에 따른 무름병 유발정도를 관찰하였다. RBI, RB2및 RB6 모두 배추에 상처를 내지 않은 상태에서도 무름병을 유발하였으며, 배추에 상처를 낸 상태에서 접종한 경우에는 그렇지 않은 경우 보다 병변을 나타내는 지름의 크기가 증가하였다. 초기 접종량에 따른 무름병 발병 범위를 조사한 결과RB1 의 경우 8.
- odcrifenum, strain LMG 17566-T 16S rRNA gene과 99%의 상동성을, RB6는 Erwinia carotovmon subsp. carotovawn 16S rRNA gene과 99% 상동성을 나타내었다 (data not shown).
- carotovumm subsp. odcriferun^\ 유사한 특성을 가진 균주이고 RB6는 Erwinia caivtovawn 아종으로 이들은 실험실에서 설정한 인위적인 배추 감염모델에서 병변을 잘 나타내었고 배추, 가지 및 피망에 감염하는 숙주 특이성을 나타내었다. 이 연구에서 분리된 균주 및 이 연구에서 확립한 배추 무름병 유발 모델은 향후 식물병원균의 감염기작 해석에 큰 기여를 할 것으로 예상된다.
- odcrifentm 아종으로, RB6는 Erwinia car- otuvmrm subsp. tazufowram 아종으로 추정되었다. 이들 균들은 30°C, 생리적 pH인 중성 pH에서 최적생육을 하였다.
- 공시 균주의 LB 액체 배지에서 온도조건을 0, 20, 30, 37, 40, 60°C로 다르게 하여 호기 배양한 결과 공시균주 모두 20~ 40°C에서 생장하였으며 RB2는 40°C에서 최대 생육을 나타내었고 RB1 과 RB6는 30℃에서 최대생육을 나타내었다(Fig. 2A). 특징적으로 RB1 은 RB2와 RB6에 비해 훨씬 왕성한 생육 도를 나타내었다.
- 특이하게도 이들 균주들은 가지와 파프리카를 선택적으로 무르게 하였다. 공시균주 모두 상처를 낸 가지와 파프리카에서 식물조직이 물러지면서 부피가 줄어 들어가는 병증을 확인하였으며 상처 내지 않은 경우에는 뚜렷한 변화가 없었다.
- 그람 음성 세균 동정용 API 20E strip (Biomerieux)을 이용한 각 균의 생화학적인 특성을 비교해 본 결과 배추에서 분리된 RBI, RB2 및 RB3는 Pantoea 속과 각각 68%, 75% 및 69% 의상 동성을 나타내 었다(data not shown). 동정 된 Pantoea 속의 표준 균주들의 특성과 비교해보니 RB6는 Erwinia carotovomm subsp.
- 그람염색 후 광학 현미경(X1, 000) 상에서 8개의 균주 모두그람 음성 짧은 간균으로 관찰되 었다. 투과전자현미경(JEM- 1200EXH, JEOL, Japan)으로 관찰한 결과 8개의 균주 모두가 0.
- 이들 균을 감염되지 않은 배추 잎의 주맥부위에 접종하여 24 -48 시간 만에 무름병변을 나타내는 8개의 균주를 1차 선별하였다. 다양한 미생물학적, 생화학적, 형태학적인 시험을 통하여 분석한 결과 서로 다른 특성을 나타내는 균이라고 여겨지는 3개의 균을 최종 선정하였고 이들은 모두 그람 음성균으로 판명되었고 RBI, RB2 및 RB6로 명명하였다. API 20E시험, VITEK 2 COMPACT 분석, 16S rRNA 염기서열 분석 둥을 종합할 때 RB1 및 RB2는 Erwinia carotovumm subsp.
- 배지의 pH 변화에 따른 공시균주의 생육도를 조사하기 위하여 pH 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 배양 조건에서 30°C, 24 시간호기 배양한 결과는 공시균주 모두 pH 5〜8범위에서 생장하였으며 RB2와 RB6는 RB1 에 비해 좁은 생육 pH spectrum을 나타내었다(Fig. 2B).
- 배추 무름병 세균을 분리하기위해 선별과정에서 버려진 배추의 무른 조직을 넣고 골고루 부유한 검액을 단계별로 희석하여 LB 평판배지에 도말한 후 30°C에서 24 -48 시간 배양한 결과 희거나 투명한 노란빛을 띠며 썩은 냄새를 풍기는 균의 집락이 무수히 자라났다. 크기, 모양, 형태, 냄새, 색깔의 특성이 다르다고 판단되는 집락을 순수 분리하였다.
- 산소공급 조건에 따른 공시균주의 생육 결과는 호기와 미 호기 조건인 경우 24 시간 만에 공시균주 모두 LB 평판배지에 작고 둥근 형태의 집락으로 자랐으며, 혐기 조건인 경우 48 시간 이상 배양하였을 때 RB6 균주만이 작은 집락을 형성하였다(Table 2).
- 용혈성을 알아보기 위하여 Blood Agar Plate에 접종한 결과 공시균주 모두 β-hemolysin을 형성하지 않았다. 이들 결과를 종합하면 RB2와 RB6은 확연히 다른 균주임을 알 수 있었다.
- 용혈성을 알아보기 위하여 Blood Agar Plate에 접종한 결과 공시균주 모두 β-hemolysin을 형성하지 않았다. 이들 결과를 종합하면 RB2와 RB6은 확연히 다른 균주임을 알 수 있었다.
- 7xl06 CFU/ml에서 최초로 무름 증상을 나타냈다. 이들 균의 숙주 특이성을 관찰하기 위하여 14종의 야채에 접종한 결과 배추, 가지 파프리카에서만 무름병변을 유발하는 숙주 특이성을 나타내었다. 이 연구에서 사용된 실험재료들 및 감염모델은 향후 식물 병원균의 감염기작해석에 크게 기여할 것으로 예상된다.
- 종합하면 이 연구에서 배추에 무름병을 유발하는 3 종류의 균(RBI, RB2 및 RB5)을 분리 하여 동정한 결과 RB1 및 RB2는 Erwinia carotovumm subsp. odcriferun^\ 유사한 특성을 가진 균주이고 RB6는 Erwinia caivtovawn 아종으로 이들은 실험실에서 설정한 인위적인 배추 감염모델에서 병변을 잘 나타내었고 배추, 가지 및 피망에 감염하는 숙주 특이성을 나타내었다.
- 투과전자현미경(JEM- 1200EXH, JEOL, Japan)으로 관찰한 결과 8개의 균주 모두가 0.5-0.8 ㎛ X 1.0〜 1.8 ㎛의 단간균 형태이며 편모가 있음을 확인할 수 있었다(data not shown).
후속연구
- odcriferun^\ 유사한 특성을 가진 균주이고 RB6는 Erwinia caivtovawn 아종으로 이들은 실험실에서 설정한 인위적인 배추 감염모델에서 병변을 잘 나타내었고 배추, 가지 및 피망에 감염하는 숙주 특이성을 나타내었다. 이 연구에서 분리된 균주 및 이 연구에서 확립한 배추 무름병 유발 모델은 향후 식물병원균의 감염기작 해석에 큰 기여를 할 것으로 예상된다.
- 이들 균의 숙주 특이성을 관찰하기 위하여 14종의 야채에 접종한 결과 배추, 가지 파프리카에서만 무름병변을 유발하는 숙주 특이성을 나타내었다. 이 연구에서 사용된 실험재료들 및 감염모델은 향후 식물 병원균의 감염기작해석에 크게 기여할 것으로 예상된다.
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