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문제 정의
- 등이 금잔화 에탄올 추출물을 in vitro에서 처리시 phytohemagglutinin에 의해 유도된 임파구 증식을 촉진시킨다는 보고 외에 별로 없었다. 따라서 본 실험에서는 금잔화의 면역조절작용을 관찰하고자 금잔화 추출물을 생쥐에 경구투여한 후 임파구 및 대식세포의 활성을 측정하였다.
제안 방법
- 측정용 microplate (white)의 각 well에 준비된 대식세포 부유액 50 ㎕와 lucigenin 용액 50 ㎕ 및 zymosan 용액 30 ㎕를 첨가하여, 최종 volume이 200 ㎕가 되도록한 후, 37℃에서 15분간 전처리한 다음, 5분 간격으로 30분 동안 lucigenin chemiluminescence 양을 측정하였다. In vitro 실험에서는 CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 처리하고 30분 후에 동일한 실험을 실시하였다.
- 1N-HCl에 용해시킨 10%-SDS 100 ㎕를 각 well에 첨가하고, 차광 상태에서 18 시간 더 배양한 후 발색된 각 well의 흡광도를 microplate reader로 570 nm에서 측정하였다. In vitro 실험에서는 분리한 흉선세포 및 비장세포에 CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 48 시간 처리하고 동일한 실험을 실시하였다.
- 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여한 다음 생쥐를 CO2 gas로 질식시켜 사망시킨 후, 적출한 흉선 또는 비장을 DPBS-A를 넣은 petri dish에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless mesh로 여과하여 세포부유액을 얻은 후, DPBS-A로 2회 세척한 다음(1,500 rpm에서 10 분간 원심분리), 흉선세포 및 비장세포 부유액으로 하였다. 대식세포의 분리는 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여 하였다. 약물 투여 4일째 생쥐 복강에 3% thioglycollate 2 ml를 주입하고, 8일째 경추탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 cold PBS 10 ml를 넣어 복강세포를 수집하였다.
- 외부로부터 이물질이 침입하게 되면 생체는 자기방어를 위해 임파구에서 cytokines들을 분비하여 대식세포의 탐식능 등을 증가시키는 것으로 알려져 있어24), 복강 대식세포의 탐식능을 측정하여 보았다. 본 실험에서는 대식세포의 탐식능을 측정하는데 lucigenin chemiluminescence 양을 측정하는 방법을 이용하였다. 이 방법의 원리는 대식세포가 particle을 탐식하는 동안 oxygen radical을 생성하는데, 이때 생성된 oxygen radical과 lucigenin이 반응하여 lucigenin chemiluminescence를 발생하는 것을 측정함으로써, 탐식능이 진행되는 것을 경시적으로 확인하는 방법이다23).
- 분리한 흉선세포 및 비장세포를 각각 RPMI 1640 배지로 3회 세척한 후, T cell의 population은 PE-conjugated anti-CD4 및 FITC-conjugated anti-CD8 monoclonal antibody로, T 및 B cell 의 subpopulation은 PE-conjugated anti-B220 및 FITCconjugated anti-Thy1 monoclonal antibody로 이중 염색하여 4℃에서 30 분간 반응시킨 다음 flow cytometer [excitation; 488 nm, emission; 525 nm(FITC), 575 nm(PE)]로 subpopulation을 측정하였다20).
- 등의 방법을 이용하였다. 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여한 다음 생쥐를 CO2 gas로 질식시켜 사망시킨 후, 적출한 흉선 또는 비장을 DPBS-A를 넣은 petri dish에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless mesh로 여과하여 세포부유액을 얻은 후, DPBS-A로 2회 세척한 다음(1,500 rpm에서 10 분간 원심분리), 흉선세포 및 비장세포 부유액으로 하였다. 대식세포의 분리는 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여 하였다.
- 대식세포의 분리는 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여 하였다. 약물 투여 4일째 생쥐 복강에 3% thioglycollate 2 ml를 주입하고, 8일째 경추탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 cold PBS 10 ml를 넣어 복강세포를 수집하였다. 수집한 세포를 4℃에서 1,300 rpm으로 10 분간 원심분리하고 RPMI 배지로 2회 세척 후, 직경 120 mm petri dish에 분주하여 CO2 incubator에서 배양시키고, 2 시간 후에 부착되지 않은 세포를 제거하였다.
- Chemiluminescence 측정은 Infinite F200를 이용하여 37℃에서 측정하였다21,22). 측정용 microplate (white)의 각 well에 준비된 대식세포 부유액 50 ㎕와 lucigenin 용액 50 ㎕ 및 zymosan 용액 30 ㎕를 첨가하여, 최종 volume이 200 ㎕가 되도록한 후, 37℃에서 15분간 전처리한 다음, 5분 간격으로 30분 동안 lucigenin chemiluminescence 양을 측정하였다. In vitro 실험에서는 CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 처리하고 30분 후에 동일한 실험을 실시하였다.
대상 데이터
- 수집한 세포를 4℃에서 1,300 rpm으로 10 분간 원심분리하고 RPMI 배지로 2회 세척 후, 직경 120 mm petri dish에 분주하여 CO2 incubator에서 배양시키고, 2 시간 후에 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 배지는 RPMI1640 배지를 사용하였으며, 배지에 10% FBS와 penicillin-streptomycin (100 units/ml, 100 ㎍/ml)을 첨가하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 생쥐는 ICR계 수컷 20 ± 2 g을 대한실험동물(주)에서 구입하여, 온도 20 ± 3℃, 습도 50 ± 5%, dark/light 12시간의 조건하에서 1 주일 이상 실험실에 적응시킨 후 사용하였으며, 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였다.
- 에서 구입하여 사용하였고, 기타 시약은 cell culture용 및 1급 시약을 사용하였다. 사용기구는 multi-well plate (96-well, 24-well, Costar), white multi-well plate (96-well, Nunc), microplate-reader (Molecular Devices, SoftMax Pro5), Infinite F200 (TECAN, Austria), CO2 incubator (Vision scientific Co.), inverted fluoromicroscope (Zeiss Co.), flow cytometer (Coulter EPICS-XL) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용한 금잔화 (Calendula officinalis) 추출물은 미국 HANSSON Corp.사에서 제조한 마리골드 에탄올 추출물 (Lot.
데이터처리
- 모든 실험 결과들은 mean ± S.E.로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 분리한 대식세포를 24 well plate에 well당 2 × 106 cells을 분주한 후 생성되는 nitric oxide (NO)의 양을 Griess법23)으로 측정하였다.
- 생쥐의 흉선세포 및 비장세포의 분리는 Wysocki16) 및 Mizel17) 등의 방법을 이용하였다. 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 CE 500 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여한 다음 생쥐를 CO2 gas로 질식시켜 사망시킨 후, 적출한 흉선 또는 비장을 DPBS-A를 넣은 petri dish에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless mesh로 여과하여 세포부유액을 얻은 후, DPBS-A로 2회 세척한 다음(1,500 rpm에서 10 분간 원심분리), 흉선세포 및 비장세포 부유액으로 하였다.
- 세포생존율 측정은 Mosmann18)이 개발하여 Kotnik19) 등이 변형시킨 MTT 방법으로 측정하였다. 분리한 흉선세포 또는 비장세포를 RPMI 1640 배지로 세포부유액을 1.
성능/효과
- . CE를 투여하고 분리한 대식세포에서 생성되는 lucigenin chemiluminescence 양은 대조군에 비해 현저히 증가하였다(Fig. 1). In vitro 실험에서 CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 각각 처리하였을 때 5 ㎍/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 대조군에 비해 lucigenin chemiluminescence 양이 감소하였다(Fig.
- CE를 투여하였을 때 흉선세포의 thymic CD4+ 세포 및 thymic CD8+ 세포 아군집의 비율은 대조군과 별 차이가 없었으며, 비장세포의 B220+ 세포 및 Thy1+ 세포의 아군집의 비율과 splenic CD4+ 세포 및 splenic CD8+ 세포 아군집의 비율도 대조군과 별 차이가 없었다. 이는 CE가 흉선세포 및 비장세포의 아군집의 비율에는 영향을 주지 않음을 의미하는 것이다.
- In vitro 실험에서 대조군의 대식세포에 LPS와 γ-IFN을 처리하였을 때 nitric oxide (NO) 생성양은 48 시간 후에 13.7 ± 0.4 μM 이었으며, CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 각각 처리하였을 때 13.2 ± 0.8, 11.9 ± 0.7 및 8.9 ± 0.5 μM로 10 ㎍/ml 농도에서 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 4).
- In vitro 실험에서 흉선세포에 Con A를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 148.0± 0.9%로 증가하였으며, CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 각각 처리하였을 때 5 ㎍/ml 이상의 농도에서 세포생존율이 대조군에 비해 증가하였다.
- 이 방법의 원리는 대식세포가 particle을 탐식하는 동안 oxygen radical을 생성하는데, 이때 생성된 oxygen radical과 lucigenin이 반응하여 lucigenin chemiluminescence를 발생하는 것을 측정함으로써, 탐식능이 진행되는 것을 경시적으로 확인하는 방법이다23). 대식세포로부터 생성되는 lucigenin chemiluminescence 양을 측정한 결과, CE를 투여하였을 때는 대조군에 비해 현저히 증가하였으나, in vitro에서 처리하였을 때는 5 ㎍/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 감소하였다. 이 결과는 CE가 대식세포에 간접적으로 작용하여 탐식능을 증가시키고 있음을 시사하는 것이다.
- 대조군의 대식세포에 LPS와 γ-IFN을 처리하지 않았을 때 nitric oxide (NO) 생성양은 48 시간 후에 2.5 ± 0.3 μM 이었으며, CE를 투여하고 분리한 대식세포에서 NO 생성양은 2.3 ± 0.2 μM로 대조군과 별 차이가 없었으나, LPS와 γ-IFN을 처리하였을 때 대조군의 NO 생성양은 11.5 ± 0.4 μM 이었으며, CE를 투여한 군은 9.6 ± 0.3 μM로 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 3).
- 본 실험에서 CE를 투여하고 분리한 대식세포에 LPS와 γ-IFN을 처리하였을 때 대조군에 비해 NO 생성이 감소하였으며, in vitro에서 CE 10 ㎍/ml 농도를 처리하였을 때 대조군에 비해 감소하였다.
- 분리한 비장세포에 B-lymphocyte mitogen인 LPS를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, LPS를 처리하였을 때 세포생존율은 167.8 ± 7.5%로 증가하였으며, CE를 투여하고 분리한 비장세포에 LPS를 처리하지 않았을 때의 세포생존율은 81.5 ± 5.8%로, LPS를 처리하였을 때의 세포생존율은 145.5 ± 4.8%로 대조군에 비해 감소하였다(Table 1).
- 비장세포에 LPS를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, LPS를 처리하였을 때 세포생존율은 139.6 ± 2.1%로 증가하였으며, CE 1, 5 및 10 ㎍/ml를 각각 처리하였을 때 5 ㎍/ml 이상의 농도에서 세포생존율이 대조군에 비해 증가하였다(Table 2).
- 약물을 투여하고 분리한 흉선세포에 T-lymphocyte mitogen인 Con A를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 125.7 ± 2.8%로 증가하였으며, CE를 투여하고 분리한 흉선세포에 Con A를 처리하지 않았을 때의 세포생존율은 149.6 ± 6.2%로, Con A를 처리하였을 때의 세포생존율은 169.4 ± 7.8%로 대조군에 비해 현저히 증가하였다.
- 이러한 결과가 CE의 직접작용에 의한 것인지를 관찰하기 위해 CE를 in vitro에서 처리한 결과 흉선세포 및 비장세포의 생존율이 모두 증가하였다. 이 결과는 CE를 경구투여하였을 때 흉선세포에는 직접적으로 작용하여 세포 생존율을 증가시키며, 비장세포에는 간접적으로 작용하여 세포 생존율을 감소시키고 있음을 시사하는 것이다.
- CE를 투여하였을 때 흉선세포의 생존율은 증가하였으나, 비장세포의 생존율은 감소하였다. 이러한 결과가 CE의 직접작용에 의한 것인지를 관찰하기 위해 CE를 in vitro에서 처리한 결과 흉선세포 및 비장세포의 생존율이 모두 증가하였다. 이 결과는 CE를 경구투여하였을 때 흉선세포에는 직접적으로 작용하여 세포 생존율을 증가시키며, 비장세포에는 간접적으로 작용하여 세포 생존율을 감소시키고 있음을 시사하는 것이다.
후속연구
- 이는 CE가 대식세포에 직접 작용하여 NO 생성을 억제하고 있음을 의미하는 것이다. NO는 활성화된 대식세포의 pseudopodia 형성을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에29), CE가 NO 생성을 억제하여 탐식능을 증가시킨 것이 아닌가 추정되나, 자세한 기전은 추후 연구되어야 할과제이다.
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