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문제 정의
- . 이에 후속 연구로서 반복적으로 복용하는 태음조위탕에 대한 치사율 및 독성증상 등의 안전성 자료를 확보하기 위하여, 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험기준 및 비임상시험 관리기준에 따라 4주간 흰쥐에 반복 투여하는 아급성 경구 독성시험을 실시하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 태음조위탕의 투여경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였으며 경구투여용 존데(zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 용액으로 조제한 태음 조위탕을 강제 경구투여 하였다. 4주간 태음조위탕을 1일 1회 28일간 연속으로 투여하여 4주 아급성독성시험을 수행하였다.
- 우선, 순화 기간 중건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다. 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다.
- 혈액은 희생 시에 heart puncture방법으로 5 mL을 채취하였고, 1 mL은 ethylene-diamine tetraacetic acid(EDTA) 처리된 blood collection tube(BD vacutainer, USA)에 균등질이 되도록잘 흔들어 4℃에 보관해 48시간이내에 complete blood count(CBC) 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을 위하여 EDTA free tube에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific, Korea) 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet, reticulocyte 및 protein, albumin, blood urea nitrogen(BUN), creatinine, glucose, total bilirubin, aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase (ALT), lactate dehydronase(LDH), alkaline Phospatase(ALP), total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정하였다.
- 모든 시험동물에 대하여 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 그리고 매일 1회 이상씩 일정 시간에 관찰하여 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망유무 및 시험물질 투여 후 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 대조군과 비교 관찰하였다. 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다14).
- 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다. 본 시험물질은 한약재로서 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험기준에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line12)과 Principles and Methods of Toxicology13)를 참조하였으며, 예비실험 결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 최대용량을 2,000 mg/kg으로 정하였고, 태음조위탕 투여군을 투여 용량에 따라 2,000 mg/kg, 1,000 mg/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg, 125 mg/kg으로 모두 5개군으로 나누었다.
- 본 연구팀은 태음조위탕의 경구투여 최대 용량인 5,000 mg/kg에서 급성 독성을 나타내지 않았음을 보고한 바 있으며7), 태음조위탕의 후속 연구로서 장기간 복용하는 한약의 특성을 고려하여 경구 아급성 독성 시험을 수행하였다. 경구 아급성 독성시험을 평가하기 위한 투여 용량의 선정 기준으로서, 본 시험물질인 태음조위탕은 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험 기준에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line12)과 Principles and Methods of Toxicology13) 를 참조하였다.
- 1주일간의 순화사육기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다11).
- 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여 당일을 0일로 하여 투여 후 2일 간격으로 4주일간 체중을 측정하였다. 모든 실험동물의 식이는 자유섭취방법으로 공급하였다.
- 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20 min)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다11).
- 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다. 식이 효율(food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일 부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다15).
- 모든 실험동물의 식이는 자유섭취방법으로 공급하였다. 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다. 식이 효율(food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일 부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다15).
- 실험실 환경에서 1주간 적응시킨 실험동물을 대조군과 태음 조위탕 투여군으로 나누었으며, 각 군은 수컷 10마리로 하였다. 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다.
- 동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 우선, 순화 기간 중건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 구분시켜 두었다. 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다.
- 모든 시험동물에 대하여 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 그리고 매일 1회 이상씩 일정 시간에 관찰하여 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망유무 및 시험물질 투여 후 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 대조군과 비교 관찰하였다. 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다14).
- 식품의약품안전청고시 제2005-60호 의약품등의 독성시험기준에 의거하면, 차후의 독성 시험 연구로서 다음 사항에 대한 단계별 후속 연구를 수행할 것이 규정되어 있다. 즉, 설치류에 대한 3개월 이상 반복 투여 독성 시험으로서 3단계 이상의 용량 단계로 나누어 군당 암수 각 10마리 이상으로 시행한다. 토끼를 제외한 비설치류에 대한 3개월 이상 반복 투여 독성 시험으로서 3단계 이상의 용량 단계로 나누어 군당 암수 각 3마리 이상으로 시행한다.
- 경구 아급성 독성시험을 평가하기 위한 투여 용량의 선정 기준으로서, 본 시험물질인 태음조위탕은 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험 기준에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line12)과 Principles and Methods of Toxicology13) 를 참조하였다. 태음조위탕에 대한 급성 경구 독성 실험 결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 태음조위탕 투여군은 2,000 mg/kg을 최고용량으로 설정한 후, 투여 용량을 1,000 mg/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg, 125 mg/kg으로 반감시켜 설정 하였다.
- 대조군(vehicle control)의 동물에는 증류수만을 투여하였다. 태음조위탕의 투여경로는 임상예정 경로로서 경구투여를 선택하였으며 경구투여용 존데(zonde)를 장착한 주사기를 이용하여 용액으로 조제한 태음 조위탕을 강제 경구투여 하였다. 4주간 태음조위탕을 1일 1회 28일간 연속으로 투여하여 4주 아급성독성시험을 수행하였다.
- 즉, 설치류에 대한 3개월 이상 반복 투여 독성 시험으로서 3단계 이상의 용량 단계로 나누어 군당 암수 각 10마리 이상으로 시행한다. 토끼를 제외한 비설치류에 대한 3개월 이상 반복 투여 독성 시험으로서 3단계 이상의 용량 단계로 나누어 군당 암수 각 3마리 이상으로 시행한다.
- 투여 개시 일로부터 4주 후에 모든 생존 동물을 ether로 흡입 마취하여 개복 및 복대동맥 절단법으로 방혈 치사시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무에 대한 해부소견을 육안적으로 관찰하고, 장기 중량을 절대무게와 상대무게에 따라 측정하였다. Absolute organ weight = each organ weight(g) Relative organ weight(%) = organ weight/body weight × 100
- 투여 직전에 증류수를 용매로 하여 태음조위탕을 125, 250, 500, 1,000, 2,000 mg/10 mL/kg으로 조제하였다. 대조군(vehicle control)의 동물에는 증류수만을 투여하였다.
- 혈액은 희생 시에 heart puncture방법으로 5 mL을 채취하였고, 1 mL은 ethylene-diamine tetraacetic acid(EDTA) 처리된 blood collection tube(BD vacutainer, USA)에 균등질이 되도록잘 흔들어 4℃에 보관해 48시간이내에 complete blood count(CBC) 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을 위하여 EDTA free tube에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n(Vision scientific, Korea) 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet, reticulocyte 및 protein, albumin, blood urea nitrogen(BUN), creatinine, glucose, total bilirubin, aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase (ALT), lactate dehydronase(LDH), alkaline Phospatase(ALP), total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정하였다.
대상 데이터
- 시험구역은 경희대학교 한의과대학의 청정 동물실험실에서 실시하였으며, 본 연구에 사용된 동물은 특정병원체부재(specific pathogen free: SPF)로서 Sprague-Dawley계의 5주령 된 수컷 흰쥐를 중앙실험동물(Japan)로부터 분양받아 온도 23 ± 3℃, 습도 55 ± 5%, 배기 10-18 회/h, light/dark 12 h, 조도 150-300 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자(280W × 420L ×170Hmm)에 각각 5마리씩 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육기간 동안에 증상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Samyang, Korea)를 자유롭게 먹도록 하였으며, 물은 멸균 수도물을 자유롭게 섭취시켰다.
- 본 연구의 시험물질인 태음조위탕은 (주)옴니허브(Seoul, Korea)를 통하여 구입한 薏苡仁 乾栗 各 72 g 蘿葍子 48 g 五味子 麥門冬 石菖蒲 桔梗 麻黃 各 24 g(총 312 g)을 혼합하여 round flask에 넣고 증류수 6,000 mL를 가한 다음 냉각기를 부착하여 2시간동안 가열한 다음 여과지로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan)를 사용하여 감압농축한 후 농축액을 동결 건조하여 시험에 사용하였으며10), 수율은 29.8%로 나타났다(Table 1).
- 시험구역은 경희대학교 한의과대학의 청정 동물실험실에서 실시하였으며, 본 연구에 사용된 동물은 특정병원체부재(specific pathogen free: SPF)로서 Sprague-Dawley계의 5주령 된 수컷 흰쥐를 중앙실험동물(Japan)로부터 분양받아 온도 23 ± 3℃, 습도 55 ± 5%, 배기 10-18 회/h, light/dark 12 h, 조도 150-300 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자(280W × 420L ×170Hmm)에 각각 5마리씩 넣어 사육하였다.
데이터처리
- 체중의 변화에 대한 통계학적 분석은 one-way analysis of variance test(ANOVA) 검정에 의해 대조군과 시험물질 투여군을 비교하였고, ANOVA 검정에서 유의성이 인정된 경우에 Student's t-test 검정법에 의해 p < 0.05 수준에서 결정하였다.
이론/모형
- , 태음조위탕의 후속 연구로서 장기간 복용하는 한약의 특성을 고려하여 경구 아급성 독성 시험을 수행하였다. 경구 아급성 독성시험을 평가하기 위한 투여 용량의 선정 기준으로서, 본 시험물질인 태음조위탕은 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험 기준에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line12)과 Principles and Methods of Toxicology13) 를 참조하였다. 태음조위탕에 대한 급성 경구 독성 실험 결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 태음조위탕 투여군은 2,000 mg/kg을 최고용량으로 설정한 후, 투여 용량을 1,000 mg/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg, 125 mg/kg으로 반감시켜 설정 하였다.
- 그리고 평균체중에 가까운 개체를 각 군에 10마리씩 균등히 들어가도록 체중을 이용한 무작위법을 이용하여 분배하였다. 동물의 개체식별은 피모색소마킹법 및 개체식별카드 표시법으로 실시하였다. 본 시험물질은 한약재로서 식품의약품안전청고시 의약품 등의 독성시험기준에는 한계용량에 대한 기준이 없기 때문에, 시험물질의 투여용량은 OECD Guide Line12)과 Principles and Methods of Toxicology13)를 참조하였으며, 예비실험 결과와 시험물질의 용해도 등을 고려하여 최대용량을 2,000 mg/kg으로 정하였고, 태음조위탕 투여군을 투여 용량에 따라 2,000 mg/kg, 1,000 mg/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg, 125 mg/kg으로 모두 5개군으로 나누었다.
- 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여 당일을 0일로 하여 투여 후 2일 간격으로 4주일간 체중을 측정하였다. 모든 실험동물의 식이는 자유섭취방법으로 공급하였다. 실험기간 동안 섭취량은 매일 측정하였다.
성능/효과
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대무게와 상대무게를 측정한 결과, 신장을 제외한 모든 장기에서 태음조위탕 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 2,000 mg/kg 투여군에서 체중에 비례한 좌측 신장의 상대 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, 우측 신장에서는 태음조위탕 투여에 의한 신장 무게의 이상이 관찰되지 않았다. 다만, 이미 보고된 급성 경구 독성 실험 결과에서 태음조위탕 5,000 mg/kg 암수 투여군 중 수컷 투여군의 신장 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가한 것7)과 관련하여 고용량 노출시 태음조위탕의 신장 무게 증가에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 경구 아급성 독성시험에서 시험기간 동안 대조군을 포함한 태음조위탕 투여군 모두에서 사망한 동물은 없었다(Table 2). 또한 모든 동물에서 태음조위탕 투여 후 자발적인 운동 및 호흡율의 증가 등과 같은 특이할 만한 임상증상은 관찰되지 않았으며 최종 투여일에 실시한 안구검사에서도 특이한 안구부위의 이상 소견은 관찰되지 않았다(Table 3)
- 위의 결과를 종합하여 볼 때 시험물질인 태음조위탕을 흰쥐에 4주간 경구 투여한 아급성 독성시험에서 무해 효과 관찰 수준의 투여 용량은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 밝혀졌다.
- 이상과 같이 태음조위탕에 대한 반복 투여 독성 시험에서 체중, 일반증상, 사료섭취량, 음수량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 육안적 소견, 병리조직학적 검사 등에서 특이한 독성병변은 관찰되지 않았다.
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 최종 체중을 비교한 결과, 시간이 경과함에 따라 모두 체중증가가 관찰되었다. 최종 체중은 2,000 mg/kg 투여군에서 평균체중 331.7 g으로 대조군의 평균체중 335.0 g에 비해 감소하였으나 유의한 차이를 보이지 않았다. 이와 같은 결과는 비만 치료에 활용되는 태음조위탕의 정상적인 약리작용에 의한 효과를 반영한 것으로 판단된다2).
- 태음조위탕 투여에 의한 육안 소견상 이상이 있는 개체는 관찰되지 않았다. 태음조위탕 반복 투여 4 경과 후 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대무게와 상대무게에 대한 장기 중량 측정결과에서 대체로 대조군과 태음조위탕 투여군 간의 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 다만, 태음조위탕 2,000 mg/kg 투여군에서 좌측 신장의 상대 무게가 유의하게 증가하였다(p <0.
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 WBC, RBC, HB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, reticulocyte 수치를 측정한 결과, 모든 혈액학적 지표 수치에서 태음조위탕 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 혈액생화학적 지표로서 protein, albumin, BUN, creatinine, glucose, total bilirubin, AST, ALT, LDH, ALP, total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정한 결과, 모든 혈액생화학적 지표 수치에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다.
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 심장, 폐, 비장, 간, 신장 및 고환의 절대무게와 상대무게를 측정한 결과, 신장을 제외한 모든 장기에서 태음조위탕 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 2,000 mg/kg 투여군에서 체중에 비례한 좌측 신장의 상대 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, 우측 신장에서는 태음조위탕 투여에 의한 신장 무게의 이상이 관찰되지 않았다.
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 WBC, RBC, HB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, reticulocyte 수치를 측정한 결과, 모든 혈액학적 지표 수치에서 태음조위탕 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 대조군과 실험군의 혈액생화학적 지표로서 protein, albumin, BUN, creatinine, glucose, total bilirubin, AST, ALT, LDH, ALP, total cholesterol, trigliceryde, Na, K, Cl 수치를 측정한 결과, 모든 혈액생화학적 지표 수치에서 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다.
- 태음조위탕 반복 투여 4주 경과 후 최종 체중을 비교한 결과, 시간이 경과함에 따라 모두 체중증가가 관찰되었다. 최종 체중은 2,000 mg/kg 투여군에서 평균체중 331.
- 태음조위탕 반복 투여 경과 동안 태음조위탕 투여에 의한 사망동물은 없었으며, 자발운동 저하, 호흡수 감소, 유루 및 복와위 등의 일반증상은 관찰되지 않았다. 관찰 기간 동안 모든 생존동물에 대한 해부병리 소견에서 태음조위탕의 투여에 따른 이상 변화는 관찰되지 않았다.
- 태음조위탕을 투여하며 4주 동안 체중 변화를 관찰하였을때, 대조군 및 태음조위탕 투여군에서 시간이 경과함에 따라 모두 체중증가가 관찰되었다. 체중증가율과 식이효율에서 모두 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 4).
- 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사에 대한 측정 결과 모든 태음조위탕 투여군에서 대조군에 비해 태음조위탕 투여에 의한 유의성 있는 변화는 인정되지 않았다(Table 6, 7).
후속연구
- 2,000 mg/kg 투여군에서 체중에 비례한 좌측 신장의 상대 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, 우측 신장에서는 태음조위탕 투여에 의한 신장 무게의 이상이 관찰되지 않았다. 다만, 이미 보고된 급성 경구 독성 실험 결과에서 태음조위탕 5,000 mg/kg 암수 투여군 중 수컷 투여군의 신장 무게가 대조군에 비해 유의하게 증가한 것7)과 관련하여 고용량 노출시 태음조위탕의 신장 무게 증가에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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