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문제 정의
- 본 연구에서는 효소분해법으로 직접 제조한 저분자량 키토산 올리고당의 정상세포에 대한 세포 독성, 종양세포에 대한 in vitro 항종양성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 02%되도록 하였다. 20 ㎕씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 well당 각각 1,200, 600, 300, 150 및 75 ㎕/㎖가 되도록 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1컬럼(8 wells)을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지 한 컬럼에는 약물 대신 PBS(0.
- 배양 종료시 plate를 450×g에서 5분간 원심분리한 후 배지를 30 ㎕ 정도만 남기고 제거하였다(이 때 각 well의 바닥에 형성된 formazan 결정이 흐트러지지 않도록 주의하였다). 배지가 제거된 각 well에 DMSO를 150 ㎕씩 가한 후에 formazan 결정이 녹을 때까지 약 10분간 가볍게 진탕해주고 바로 microplate reader(scanning multiwell spectrophotometer)로 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해 formazan으로 분해된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 살아있는 세포(viable cell)의 수와 비례한다.
- 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼중 10개의 컬럼에 접종하였다. 시료는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)의 배지내 최종농도가 0.02%되도록 하였다. 20 ㎕씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 well당 각각 1,200, 600, 300, 150 및 75 ㎕/㎖가 되도록 하였다.
- 정상 세포주인 Vero E6 세포에 대한 세포 독성 실험도 상기와 같이 MTT법으로 검색하였으나, 시료의 농도를 3,000 ㎕/㎖부터 2배수 희석하여 사용하였다. 시험군에서 8개 well의 OD540값으로부터 한 컬럼의 평균 OD540값을 구하여 대조군(100% 생존군)의 평균 OD540값에 대한 백분율을 산출하였다. 이 백분율은 대조군과 비교한 시험군의 세포 생존율에 해당하는 값이다.
- 7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼중 10개의 컬럼에 접종하였다. 시료는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)의 배지내 최종농도가 0.
- 20 ㎕씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 well당 각각 1,200, 600, 300, 150 및 75 ㎕/㎖가 되도록 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1컬럼(8 wells)을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지 한 컬럼에는 약물 대신 PBS(0.2% DMSO)만을 20 ㎕ 첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 삼았다. 흡광도 측정시 사용할 blank에는 세포 없는 배지만을 180 ㎕ 가하고 PBS 또는 약물을 20 ㎕ 첨가하였다.
- 항종양성 실험에 사용한 암세포주의 적정세포수는 약물처리하지 않은 대조군에서 세포 접종 당시로부터 4일 후 MTT 실험 종료시에 모두 세포가 지수 함수적으로 활발히 증식하면서 MTT 처리 후의 OD540값이 0.6～0.7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼중 10개의 컬럼에 접종하였다.
- 2% DMSO)만을 20 ㎕ 첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 삼았다. 흡광도 측정시 사용할 blank에는 세포 없는 배지만을 180 ㎕ 가하고 PBS 또는 약물을 20 ㎕ 첨가하였다. 암세포와 약물이 접종된 plate를 37℃, 5% CO2 하에서 4일간 배양한 후 0.
대상 데이터
-
2. 세포 독성과 항종양성의 측정
정상 세포주로는 Vero E6(Africa green monkey kidney cell)를 사용하였고, 종양 세포주로는 간암 세포주인 A549, 방광암 세포주인 J82, 대장암 세포주인 SNU-C4, 위암 세포주인 SNU-1, 유방암 세포주인 ZR75-1을 사용하였다. 정상 세포주와 암 세포주에 대한 세포 독성 실험은 MTT(3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 검색법에 의해 수행하였다.
이론/모형
- 저분자량 키토산 올리고당은 전보의 방법(Park HK 1999)에 따라서 제조하였다. 0.
- 정상 세포주로는 Vero E6(Africa green monkey kidney cell)를 사용하였고, 종양 세포주로는 간암 세포주인 A549, 방광암 세포주인 J82, 대장암 세포주인 SNU-C4, 위암 세포주인 SNU-1, 유방암 세포주인 ZR75-1을 사용하였다. 정상 세포주와 암 세포주에 대한 세포 독성 실험은 MTT(3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 검색법에 의해 수행하였다.
성능/효과
- 28 ㎍/㎖로 정상세포주에 대한 세포 독성은 거의 없었다. 따라서 키토산 올리고당의 항균성, 면역 부활 기능, 항종양성 등 다양한 생리활성기능을 활용한 기능성 식품첨가물로 이용함에 있어서 안전성이 높은 물질이라고 판단된다.
- 생산된 저분자량 키토산 올리고당을 전보의 방법(Park HK 1999)에 따라서 HPLC 분석한 결과, 2량체가 8.69%, 3량체가 19.66%, 4량체가 23.98%, 5량체가 20.65%, 6량체가 12.46%, 7량체가 8.77%, 8량체 이상이 5.8%로 3～5량체가 전체 올리고당 중 64.3%에 달하는 비교적 저분자 화합물로 구성된 키토산 올리고당이었다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 저분자량 키토산 올리고당은 독성이 없는 안전한 물질로 생각되며, in vitro 항종양성을 가지고 있을 뿐만 아니라 세포의 면역기능을 활성화시키는 등의 우수한 생리적 기능을 갖는 새로운 개념의 기능성 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이와 같은 결과는 Ryu(1992)가 새우 껍질로부터 추출한 키토산을 가지고 종양 세포주에 대한 in vitro 항종양성을 측정한 결과 항종양성을 나타내지 않았으며, 이는 키토산의 항종양성이 직접적인 세포 독성에 의하지 않고 면역기능의 활성화에 기인한다고 보고한 것과는 상이한 결과였다. 이와 같은 연구결과의 차이는 키토산의 경우는 거대분자이므로 세포 내로의 이동이 불가능하나 키토산 올리고당의 경우는 세포내로의 이동이 가능하다는 차이점에 의한 것으로 판단되나, 이를 밝히기 위해서는 보다 자세한 연구가 필요하다고 생각된다.
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