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문제 정의
- 대조군과 SAC만을 처치한 군과 비교 시 총 72시간 내의 실험에서는 SAC이 줄기세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다. 72시간 처치한 실험에서는 SAC에 의한 세포의 증식은 유의하지 않았으며, Kang 등(2004)이 보고한 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 증식속도가 느리다는 결과와 일치하는 바이다. 그러나 SAC를 2～4주 동안 지속적으로 처치했을 때 세포 증식 효과의 유무는 향후 추구되어야 할 과제이다.
- 본 연구는 SAC가 중간엽 줄기세포의 증식을 유도하는지 여부와 시험관내 배양으로 인한 산화적 스트레스에 의한 세포 손상 즉 H2O2에 의한 산화 스트레스를 억제하는 세포 수준의 메카니즘을 규명하였다. 대조군과 SAC만을 처치한 군과 비교 시 총 72시간 내의 실험에서는 SAC이 줄기세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다.
- 본 연구는 세포배양 시 일반적으로 이용되는 20% 산소가 점차적으로 세포 내 산화 스트레스를 유발함으로써 줄기세포의 증식과 고사에 영향을 미칠 가능성이 높다는 점에 착안하여, 항산화 효과가 알려진 SAC 첨가가 세포 손상 유발 물질인 과산화수소 등의 라디칼 제거 능력과 줄기세포의 증식 능력과 세포 사멸(apoptosis)의 초기 및 만기에 미치는 영향, 그리고 항산화 효소인 catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase 의 증가 여부를 단백질 발현을 통하여 연구하였다.
- 본 연구는 위의 연구를 통해서 SAC이 중간엽 줄기세포의 계속된 배양으로 유발될 수 있는 산화 스트레스에 세포 보호효과가 있음을 증명하였고, 이 SAC의 효과가 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포 증식에 미치는 영향을 연구하였다. 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limit dilution을 통해 단일세포로 분리한 후 4주간 배양 후 세포를 관찰하였다.
- 본 연구에서 이용한 제대혈 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포인지를 확인하기 위해서 중간엽 중기세포 면역표식자를 이용하여 분석하였다. 조혈 줄기세포 표식자인 CD14, CD34, CD45 및 CD117은 발현하지 않았으며, 중간엽 줄기세포 표식자인 CD29, CD44, CD90, CD105 및 CD166은 발현하였다(Fig.
- 본 연구에서는 산화적 스트레스에 의한 세포 손상으로 중간엽 줄기세포의 증식과 SAC의 영향을 관찰하기 위해서 H2O2를 이용하여 산화 스트레스를 유도하였다(Fig. 2). 대조군과 SAC만을 처치한 군과 비교 시, 총 72시간 내의 실험에서는 SAC이 줄기세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다.
제안 방법
- 전기영동한 단백질을 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 transfer한 후 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GpX)에 대한 1차 항체를 이용하여 표지하였다. 1차에 항체에 대한 2차 항체를 표지한 후 ECL solution을 이용하여 단백질 발현 변화를 관찰하였다.
- 7일 간격으로 배지를 교체하였으며, 4주 후에 증식된 세포를 Diff-Quick stain을 이용하여 세포를 관찰하였다.
- H2O2에 대한 SAC의 세포 보호 효과가 항산화 효소와 연관성이 있는지를 분석하기 위해서 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 단백질 발현을 조사하였다. 대조군과 비교 시 SAC이 세포 내의 항산화 효소 CAT, SOD, Gpx의 단백질 발현 자체에는 영향을 미치지 않았다.
- 산화적 스트레스 요인 중 과산화수소(H2O2)에 의해 유도되는 세포 스트레스가 줄기세포 증식 및 SAC의 영향을 관찰하기 위해서 SAC 전 처치 군과 후 처치 군으로 나누어 실험을 진행하였다. SAC 전 처치 군은 SAC을 포함한 배지에 줄기세포 46시간 배양한 후 2시간 동안 H2O2(0.05 mmol/ℓ)를 처치하였으며, 이에 대조군으로 SAC을 제외한 일반세포 배양배지에 줄기세포를 46시간 배양한 후 2시간 동안 H2O2(0.05 mmol/ℓ)를 처치하였다. 각 군의 해당하는 세포의 총 배양시간은 72시간이었다.
- 그러나 10,000의 세포중에는 줄기세포, 분화된 세포, 변성 또는 세포 사멸에 빠진 세포들도 함께 존재하고 있으므로 단일세포 수준으로 세포를 96 well 배양판의 각 well 에 분주한 다음 SAC를 처치하고, 4주간 배양한 후 도립현미경으로 세포 증식의 colony를 검경하였다. 관찰의 편이를 위하여 Diff-Quick 염색을 시행하였다.
- SAC 처치가 세포 증식에 미치는 영향을 10,000 이상의 세포를 사용하는 배양용기내에서 분석한 결과, 대조군과 세포증식에서는 차이가 없었음을 위의 중간엽 줄기세포 증식과 SAC 효과의 실험에서 확인한 바 있었다. 그러나 10,000의 세포중에는 줄기세포, 분화된 세포, 변성 또는 세포 사멸에 빠진 세포들도 함께 존재하고 있으므로 단일세포 수준으로 세포를 96 well 배양판의 각 well 에 분주한 다음 SAC를 처치하고, 4주간 배양한 후 도립현미경으로 세포 증식의 colony를 검경하였다. 관찰의 편이를 위하여 Diff-Quick 염색을 시행하였다.
- , Korea)로 세포의 수 및 생존율을 확인하였다. 또한, 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력에 SAC이 미치는 영향을 알아보기 위해서 중간엽 줄기세포로 확인된 줄기세포를 limit dilution으로 단일세포 수준으로 분주하여 96 well plate에 배양하였다. 7일 간격으로 배지를 교체하였으며, 4주 후에 증식된 세포를 Diff-Quick stain을 이용하여 세포를 관찰하였다.
-
3. 줄기세포 면역 표식자 분석
분리한 세포가 중간엽 줄기세포임을 증명하기 위해서 부착성 세포들을 0.25% EDTA를 이용하여 배양용기로부터 떼어낸 후 2% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 phosphate-buffered saline(PBS)로 세척하여 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포 표면 항원에 대한 anti-human 항체(BD Science, USA)를 가지고 세포표면 항원을 표지하여 분석하였다. 세포표면 항원을 표지한 후 FACS calibur를 이용하여 세포 분포를 분석하였다.
- 1 mmol/ℓ를 첨가한 배지에서 24시간 간격으로 교환하면서 배양하였다. 산화적 스트레스 요인 중 과산화수소(H2O2)에 의해 유도되는 세포 스트레스가 줄기세포 증식 및 SAC의 영향을 관찰하기 위해서 SAC 전 처치 군과 후 처치 군으로 나누어 실험을 진행하였다. SAC 전 처치 군은 SAC을 포함한 배지에 줄기세포 46시간 배양한 후 2시간 동안 H2O2(0.
- 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸에서 SAC의 영향을 관찰하기 위해서 H2O2를 이용하여 산화 스트레스를 유도하였다(Fig. 3). 대조군과 SAC만을 처치한 군 비교 시 세포 사멸 초기 단계와 후기 단계의 세포가 거의 관찰되지 않았다(Fig.
- 각 군의 해당하는 세포의 총 배양시간은 72시간이었다. 세포 수의 변화는 automatic cell counter(Microchip type, Nano EnTek Inc., Korea)로 세포의 수 및 생존율을 확인하였다. 또한, 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력에 SAC이 미치는 영향을 알아보기 위해서 중간엽 줄기세포로 확인된 줄기세포를 limit dilution으로 단일세포 수준으로 분주하여 96 well plate에 배양하였다.
- 차가운 DPBS로 세포를 부유한 후 1,000×g로 5분간 상온에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포를 annexin V-FITC(BD Pharmingen, San Jose, CA)와 propidium iodide(BD Pharmingen, San Jose, CA)를 첨가하여 형광 염색한 후 Cytospin(Shandon Co, USA)에서 slide 위에 원침하여 형광현미경으로 관찰하였다.
- 25% EDTA를 이용하여 배양용기로부터 떼어낸 후 2% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 phosphate-buffered saline(PBS)로 세척하여 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포 표면 항원에 대한 anti-human 항체(BD Science, USA)를 가지고 세포표면 항원을 표지하여 분석하였다. 세포표면 항원을 표지한 후 FACS calibur를 이용하여 세포 분포를 분석하였다.
- 정량한 단백질을 10% SDS-PAGE gel에서 loading한 후 120 voltage에서 1시간 동안 전기영동을 실행하였다. 전기영동한 단백질을 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 transfer한 후 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GpX)에 대한 1차 항체를 이용하여 표지하였다. 1차에 항체에 대한 2차 항체를 표지한 후 ECL solution을 이용하여 단백질 발현 변화를 관찰하였다.
- 제대혈(umbilical cord blood, UCB) 80 ㎖를 실온 상태의 DPBS 80 ㎖와 동량 희석하고 15 ㎖ conical tuber에 비중이 1.077인 Ficoll-Paque™Plus 6 ㎖를 분주한 후 동량 희석액 9 ㎖를 점층하고 750×g, 30분 동안 상온에서 원심 분리하여 단핵세포층을 분리하였다.
- 본 연구는 위의 연구를 통해서 SAC이 중간엽 줄기세포의 계속된 배양으로 유발될 수 있는 산화 스트레스에 세포 보호효과가 있음을 증명하였고, 이 SAC의 효과가 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포 증식에 미치는 영향을 연구하였다. 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limit dilution을 통해 단일세포로 분리한 후 4주간 배양 후 세포를 관찰하였다. 대조군과 비교시 SAC을 포함한 배지는 줄기세포의 증식능력을 향상시킴을 확인하였다(Fig.
- 중간엽 줄기세포를 시험관 당 2×104 세포들을 분주하고 24시간 배양하여 안정화 하였다.
- 세포들을 분주하고 24시간 배양하여 안정화 하였다. 중간엽 줄기세포를 이용한 실험은 중간엽 줄기세포의 군집이 70%인 exponential 구간에 수행하였다. 중간엽 줄기세포의 증식에 SAC의 효과를 관찰하기 위해서 대조군은 24시간 간격으로 교환하면서 정상 배양하였고, SAC 투여군은 SAC을 0.
- 중간엽 줄기세포를 이용한 실험은 중간엽 줄기세포의 군집이 70%인 exponential 구간에 수행하였다. 중간엽 줄기세포의 증식에 SAC의 효과를 관찰하기 위해서 대조군은 24시간 간격으로 교환하면서 정상 배양하였고, SAC 투여군은 SAC을 0.1 mmol/ℓ를 첨가한 배지에서 24시간 간격으로 교환하면서 배양하였다. 산화적 스트레스 요인 중 과산화수소(H2O2)에 의해 유도되는 세포 스트레스가 줄기세포 증식 및 SAC의 영향을 관찰하기 위해서 SAC 전 처치 군과 후 처치 군으로 나누어 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- S-allylcysteine(C6H11NO2S, 동경화성공업주식회사, 일본), hydrogen peroxide(Calbiochem, San Diego, CA)를 구입하였으며, 세포 배양과 관련한 실험재료인 DPBS, 0.25% trypsinEDTA(WelGene, Daegu, Korea), DMEM/low glucose(Hyclone, Laboratories, Inc., Logan, Utah), antibiotics(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 구입하였다. 항산화 효소의 발현을 검사하기 위한 1차 항체인 CAT, Gpx, SOD(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다.
- , Logan, Utah), antibiotics(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 구입하였다. 항산화 효소의 발현을 검사하기 위한 1차 항체인 CAT, Gpx, SOD(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 사이의 세포의 감소 및 증가가 통계적 유의성을 가지는지를 분석하기 위해서 SigmaSTAT 통계 소프트웨어를 통하여 one-way ANOVA를 이용하였으며, 사후검정으로 Holm-Sidak method를 사용하였다. 통계적 유의성은 p<0.
이론/모형
- 각 실험군의 세포에서 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 BAC(bicinchoninic acid) 방법으로 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질을 10% SDS-PAGE gel에서 loading한 후 120 voltage에서 1시간 동안 전기영동을 실행하였다.
성능/효과
- 본 연구결과에서 SAC이 H2O2에 의해 유도되는 세포 손상을 방지함을 확인할 수 있었으며, 세포 사멸 실험에서 SAC이 중간엽 줄기세포 배양 시 산화 스트레스에 의해서 세포 사멸 단계로 진전하는 과정을 방지함을 알 수 있었다. H2O2에 대한 SAC의 세포 보호 효과가 항산화 효소와 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 단백질 발현실험에서 SAC은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 유의하게 단백질이 발현되었다. 본 연구의 저자들은 위의 연구를 통해서 SAC의 중간엽 줄기세포의 세포 보호 효과에 대한 자세한 기전을 밝히지는 못하였지만 세포 내에 존재하는 항산화 효소의 발현을 유지시킴으로써 세포를 보호함을 알 수 있었다.
- SAC 처치가 세포 증식에 미치는 영향을 10,000 이상의 세포를 사용하는 배양용기내에서 분석한 결과, 대조군과 세포증식에서는 차이가 없었음을 위의 중간엽 줄기세포 증식과 SAC 효과의 실험에서 확인한 바 있었다. 그러나 10,000의 세포중에는 줄기세포, 분화된 세포, 변성 또는 세포 사멸에 빠진 세포들도 함께 존재하고 있으므로 단일세포 수준으로 세포를 96 well 배양판의 각 well 에 분주한 다음 SAC를 처치하고, 4주간 배양한 후 도립현미경으로 세포 증식의 colony를 검경하였다.
- 4). SAC을 전 처치한 군은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 유의하게 단백질이 발현되었다(Fig. 4).
- 본 연구에서는 이들의 연구들보다 더욱 직접적으로 SAC에 의한 항산화 단백질의 변동 여부를 확인하기 위하여 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 항체를 이용하여 확인한 결과, H2O2를 처치한 군은 대조군과 비교 시 CAT의 단백질 발현을 감소시켰으며, SOD 및 Gpx의 단백질 발현을 관찰할 수 없었다. SAC을 전 처치한 군은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 육안으로 확인할 수 있는 정도의 단백질을 확인하였다.
- 본 연구의 저자들은 위의 연구를 통해서 SAC의 중간엽 줄기세포의 세포 보호 효과에 대한 자세한 기전을 밝히지는 못하였지만 세포 내에 존재하는 항산화 효소의 발현을 유지시킴으로써 세포를 보호함을 알 수 있었다. SAC이 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력을 향상시킬 수 있는지를 관찰한 실험에서 SAC은 지속된 배양에도 불구하고, 중간엽 줄기세포의 증식능력의 유지 및 증식속도가 증진하였다.
- 본 연구가 비록 SAC의 중간엽 줄기세포의 세포보호 효과에 대한 자세한 기전을 밝히지는 못하였지만 세포 내에 존재하는 항산화 효소의 수준을 유지시킴으로써 세포를 보호함을 알 수 있었다. 간접적으로 SAC의 효과가 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력을 향상시킬 수 있는지를 관찰한 결과, 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limiting dilution(one cell/well of 96 well plate)을 통해 단일세포 수준으로 분주한 다음, 4주간 배양하였을 때, 대조군과 비교 시 SAC을 포함한 배지는 확실하게 중간엽 줄기세포의 증식을 유도하였음을 알 수 있었고, 저산소농도인 5% O2의 배양군과 비견할 수준 만큼 줄기세포의 증식능력을 향상시킴을 확인하였다. 아직까지 SAC가 줄기세포의 limiting dilution culture에 미치는 영향에 대한 다른 연구자들의 보고가 없어서 비교할 수는 없지만, SAC의 항산화 능력을 입증할 수 있는 single cell level 의 연구라고 생각하고 있으며, 향후 다른 antioxidant 또는 항산화 천연물이 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 연구할 수 있는 또 하나의 도구로 개발할 수 있다고 본다.
- 결론적으로, 본 연구에서는 산화 스트레스로 야기되는 세포 생존율 감소, 세포 사멸 증가, 항산화 효소에 결핍을 SAC이 방지함으로써 중간엽 줄기세포의 증식능력을 향상시키는 작용이 있음을 관찰하였다. 이러한 결과는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 다양한 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포를 배양하는데 있어 줄기세포의 능력을 보존하는데 있어 유익할 가능성이 있다고 사료된다.
- 그러나 SAC이 H2O2에 의해 유도되는 세포 사멸을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다. 대조군과 SAC만을 처치한 군비교 시 세포 사멸 초기 단계와 후기 단계의 세포가 거의 관찰되지 않았다.
- 본 연구의 결과는 지속적인 시험관내 배양 시 대부분의 줄기세포가 산화 스트레스에 노출됨으로써 세포 사멸 단계로 진전됨을 짐작할 수 있다. 그러므로 이 결과는 SAC이 중간엽 줄기세포 배양 시 산화 스트레스에 의해서 세포 사멸 단계로 진전하는 과정을 방지할 수 있음을 알 수 있다. Li 등(2005)은 aged garlic extract(AGE)가 상피세포의 세포 사멸을 억제한다고 보고한 바 있는데, 본 연구는 AGE 중에서도 SAC가 세포 사멸을 억제하고 있음을 확인하였다.
- 2). 대조군과 SAC만을 처치한 군과 비교 시, 총 72시간 내의 실험에서는 SAC이 줄기세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다. 대조군과 비교 시 H2O2에 의해서 유도된 산화 스트레스에 의해서 세포 생존율이 38%가 감소하였다(P<0.
- 2). 대조군과 SAC만을 처치한 군과 비교 시, 총 72시간 내의 실험에서는 SAC이 줄기세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다. 대조군과 비교 시 H2O2에 의해서 유도된 산화 스트레스에 의해서 세포 생존율이 38%가 감소하였다(P<0.
- 3). 대조군과 SAC만을 처치한 군 비교 시 세포 사멸 초기 단계와 후기 단계의 세포가 거의 관찰되지 않았다(Fig. 3a, 3b).
- 에 대한 SAC의 세포 보호 효과가 항산화 효소와 연관성이 있는지를 분석하기 위해서 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 단백질 발현을 조사하였다. 대조군과 비교 시 SAC이 세포 내의 항산화 효소 CAT, SOD, Gpx의 단백질 발현 자체에는 영향을 미치지 않았다. 반면 H2O2를 처치한 군은 대조군과 비교 시 CAT의 단백질 발현을 감소시켰으며, SOD 및 Gpx의 단백질 발현을 관찰할 수 없었다(Fig.
- 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limit dilution을 통해 단일세포로 분리한 후 4주간 배양 후 세포를 관찰하였다. 대조군과 비교시 SAC을 포함한 배지는 줄기세포의 증식능력을 향상시킴을 확인하였다(Fig. 5).
- 본 연구가 비록 SAC의 중간엽 줄기세포의 세포보호 효과에 대한 자세한 기전을 밝히지는 못하였지만 세포 내에 존재하는 항산화 효소의 수준을 유지시킴으로써 세포를 보호함을 알 수 있었다. 간접적으로 SAC의 효과가 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력을 향상시킬 수 있는지를 관찰한 결과, 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limiting dilution(one cell/well of 96 well plate)을 통해 단일세포 수준으로 분주한 다음, 4주간 배양하였을 때, 대조군과 비교 시 SAC을 포함한 배지는 확실하게 중간엽 줄기세포의 증식을 유도하였음을 알 수 있었고, 저산소농도인 5% O2의 배양군과 비견할 수준 만큼 줄기세포의 증식능력을 향상시킴을 확인하였다.
- 그리하여 항산화 효과를 가지고 있는 물질을 세포배양액에 첨가함으로써 줄기세포의 증식능력을 향상시킬 것으로 기대하였다. 본 연구결과에서 SAC이 H2O2에 의해 유도되는 세포 손상을 방지함을 확인할 수 있었으며, 세포 사멸 실험에서 SAC이 중간엽 줄기세포 배양 시 산화 스트레스에 의해서 세포 사멸 단계로 진전하는 과정을 방지함을 알 수 있었다. H2O2에 대한 SAC의 세포 보호 효과가 항산화 효소와 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 단백질 발현실험에서 SAC은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 유의하게 단백질이 발현되었다.
- 본 연구는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 배양의 최적화를 위해서는 시험관내 배양 시 이용되는 배양 조건에서 20% 산소가 점차적으로 세포 내 산화 스트레스를 유발함으로써 줄기세포의 증식에 영향을 미칠 것으로 생각되었다. 그리하여 항산화 효과를 가지고 있는 물질을 세포배양액에 첨가함으로써 줄기세포의 증식능력을 향상시킬 것으로 기대하였다.
- 1). 본 연구에서 사용하는 줄기세포가 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.
- 에 의한 세포내 산화 스트레스를 억제하는지 대한 연구로 Shin & Ihm(2008)은 스트렙토조토신으로 유발한 당뇨병 백서의 간에서 glutathione을 정량하고 실시간 RT-PCR에서 항산화 효소들의 mRNA 발현을 보고하였으며, Nagatoshi 등(2001)은 정량적으로 hydrogen peroxide 의 scavenging assay 를 실시하였다. 본 연구에서는 이들의 연구들보다 더욱 직접적으로 SAC에 의한 항산화 단백질의 변동 여부를 확인하기 위하여 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 항체를 이용하여 확인한 결과, H2O2를 처치한 군은 대조군과 비교 시 CAT의 단백질 발현을 감소시켰으며, SOD 및 Gpx의 단백질 발현을 관찰할 수 없었다. SAC을 전 처치한 군은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 육안으로 확인할 수 있는 정도의 단백질을 확인하였다.
- H2O2을 처치한 군의 경우 대부분의 세포에서 세포 사멸 후기 단계인 propidium iodide이 양성으로 관찰되었으나, SAC를 전 처치한 군은 H2O2에 의해 유도되는 세포 사멸을 관찰할 수 없었다. 본 연구의 결과는 지속적인 시험관내 배양 시 대부분의 줄기세포가 산화 스트레스에 노출됨으로써 세포 사멸 단계로 진전됨을 짐작할 수 있다. 그러므로 이 결과는 SAC이 중간엽 줄기세포 배양 시 산화 스트레스에 의해서 세포 사멸 단계로 진전하는 과정을 방지할 수 있음을 알 수 있다.
- H2O2에 대한 SAC의 세포 보호 효과가 항산화 효소와 항산화 효소인 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(Gpx)의 단백질 발현실험에서 SAC은 catalase의 경우 단백질 발현을 대조군과 비교할 수 있는 수준으로 발현이 유지되었으며, SOD 및 Gpx의 경우 단백질 발현은 감소하였으나 H2O2를 처치한 군과 비교 시 유의하게 단백질이 발현되었다. 본 연구의 저자들은 위의 연구를 통해서 SAC의 중간엽 줄기세포의 세포 보호 효과에 대한 자세한 기전을 밝히지는 못하였지만 세포 내에 존재하는 항산화 효소의 발현을 유지시킴으로써 세포를 보호함을 알 수 있었다. SAC이 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력을 향상시킬 수 있는지를 관찰한 실험에서 SAC은 지속된 배양에도 불구하고, 중간엽 줄기세포의 증식능력의 유지 및 증식속도가 증진하였다.
- 본 연구에서 이용한 제대혈 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포인지를 확인하기 위해서 중간엽 중기세포 면역표식자를 이용하여 분석하였다. 조혈 줄기세포 표식자인 CD14, CD34, CD45 및 CD117은 발현하지 않았으며, 중간엽 줄기세포 표식자인 CD29, CD44, CD90, CD105 및 CD166은 발현하였다(Fig. 1). 본 연구에서 사용하는 줄기세포가 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.
후속연구
- 72시간 처치한 실험에서는 SAC에 의한 세포의 증식은 유의하지 않았으며, Kang 등(2004)이 보고한 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 증식속도가 느리다는 결과와 일치하는 바이다. 그러나 SAC를 2～4주 동안 지속적으로 처치했을 때 세포 증식 효과의 유무는 향후 추구되어야 할 과제이다. 세포유식기를 통하여 표면 항원의 발현이 높은 고순도의 중간엽 줄기세포를 분리하였으나 배양과정을 거치면서 휴지기의 줄기세포, 분화된 세포, 또는 세포 사멸 단계의 세포를 상당수 포함하고 있을 것으로 사료되며, 이들로 인하여 SAC가 짧은 시간 내에 자가 복제 능력 및 분화능을 온전하게 가지는 중간엽 줄기세포의 증식에 영향을 미치기 어려웠을 것으로 추측하였다.
- 본 연구는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 배양의 최적화를 위해서는 시험관내 배양 시 이용되는 배양 조건에서 20% 산소가 점차적으로 세포 내 산화 스트레스를 유발함으로써 줄기세포의 증식에 영향을 미칠 것으로 생각되었다. 그리하여 항산화 효과를 가지고 있는 물질을 세포배양액에 첨가함으로써 줄기세포의 증식능력을 향상시킬 것으로 기대하였다. 본 연구결과에서 SAC이 H2O2에 의해 유도되는 세포 손상을 방지함을 확인할 수 있었으며, 세포 사멸 실험에서 SAC이 중간엽 줄기세포 배양 시 산화 스트레스에 의해서 세포 사멸 단계로 진전하는 과정을 방지함을 알 수 있었다.
- 간접적으로 SAC의 효과가 장기간 배양 시 중간엽 줄기세포의 자기 복제 능력을 향상시킬 수 있는지를 관찰한 결과, 중간엽 줄기세포로 확인된 세포를 limiting dilution(one cell/well of 96 well plate)을 통해 단일세포 수준으로 분주한 다음, 4주간 배양하였을 때, 대조군과 비교 시 SAC을 포함한 배지는 확실하게 중간엽 줄기세포의 증식을 유도하였음을 알 수 있었고, 저산소농도인 5% O2의 배양군과 비견할 수준 만큼 줄기세포의 증식능력을 향상시킴을 확인하였다. 아직까지 SAC가 줄기세포의 limiting dilution culture에 미치는 영향에 대한 다른 연구자들의 보고가 없어서 비교할 수는 없지만, SAC의 항산화 능력을 입증할 수 있는 single cell level 의 연구라고 생각하고 있으며, 향후 다른 antioxidant 또는 항산화 천연물이 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 연구할 수 있는 또 하나의 도구로 개발할 수 있다고 본다.
- 결론적으로, 본 연구에서는 산화 스트레스로 야기되는 세포 생존율 감소, 세포 사멸 증가, 항산화 효소에 결핍을 SAC이 방지함으로써 중간엽 줄기세포의 증식능력을 향상시키는 작용이 있음을 관찰하였다. 이러한 결과는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 다양한 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포를 배양하는데 있어 줄기세포의 능력을 보존하는데 있어 유익할 가능성이 있다고 사료된다.
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