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문제 정의
- 13,14) 세포는 TNF-α에 의해서 상해를 받게 되고 이때 IL-6가 세포 밖으로 방출되게 되는데 본 실험에서는 MG-63 세포를 이용하여 마타리 뿌리로부터 분리한 화합물들이 IL-6의 유리에 어떠한 영향을 미치는 가와 NBT assay를 통한 항산화활성을 검토하였기에 이에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 4-12) 본 연구에서는 마타리의 정유성분에 기인하는 진정 최면작용 이외의 생리활성에 대한 탐색을 위해 마타리 뿌리의 MeOH 추출물 및 용매분획에 의해 얻어진 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획에 대해 NBT assay를 통한 항산화 활성, MG-63 세포주를 이용한 TNF-α에 의해 유도된 IL-6 유리 저해활성을 검색하였다.
- IL-6의 저해활성은 Inhibition(%)=(A-B)/A×100[Where A is the IL-6 concentration when the TNF-α only was treated, and B is the IL-6 concentration when the compounds were treated] 로 하였다.
- NBT superoxide scavenging assay는 조금 수정된 방법을 사용하였다.15) 15 mM Na2EDTA(50 mM KH2PO4/KOH pH 7.
- 4-12) 본 연구에서는 마타리의 정유성분에 기인하는 진정 최면작용 이외의 생리활성에 대한 탐색을 위해 마타리 뿌리의 MeOH 추출물 및 용매분획에 의해 얻어진 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획에 대해 NBT assay를 통한 항산화 활성, MG-63 세포주를 이용한 TNF-α에 의해 유도된 IL-6 유리 저해활성을 검색하였다. 그 결과 마타리 뿌리로부터 얻은 CH2Cl2 분획이 항산화 활성 및 IL-6 저해활성을 가진 것으로 나타났고, 이를 바탕으로 CH2Cl2 분획에 대한 활성-지향 정제를 실시하였다. IL(interleukin)-6는 cytokine 일종의 단백질 그룹으로 일부는 림프구 계통의 세포가 성장하여 면역조정 역할을 하며 조혈작용을 조절한다.
- 여기에 TNF-α와 세포독성이 없는 농도의 시료를 처리한 후 37℃ incubator에서 배양한 후 24시간과 48시간 뒤 각각 70 µl씩 배지를 채취하여 냉동 보관하였다.
- 융점측정기는 Fisher Scientific(Model 307N0043, Canada)를 사용하였고 선광도는 AUTOPOL IV automatic polarimeter (Rudolph Research Flangers, NJ 07836)를 사용하였으며, IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR-300E(JASCO Co., Japan)를 사용하였다.
- 1 g의 MeOH extract를 얻었다. 이를 증류수로 현탁하고 CH2Cl2, EtOAc, n-butanol 순서로 분획하였다. 항산화 활성을 나타낸 CH2Cl2 분획 10 g을 실리카젤을 이용하여 컬럼 크로마토그라피를 실시하였다.
- 이를 증류수로 현탁하고 CH2Cl2, EtOAc, n-butanol 순서로 분획하였다. 항산화 활성을 나타낸 CH2Cl2 분획 10 g을 실리카젤을 이용하여 컬럼 크로마토그라피를 실시하였다. 용매는 hexane : acetone=10 : 1을 이용하여 용출시키고 각각의 분획들을 TLC pattern에 따라 유사한 것들을 합쳐 16개의 sub-fraction을 얻었다.
대상 데이터
- , Japan)를 사용하였다. 1H-NMR과 13C-NMR는 VARIAN Unity Inova 500 및 JEOL JNM-LA 300을 사용하였다. 분취용 column chromatography의 packing material로는 Kieselgel 60(230-400 mesh, ASTM, Art.
- 본 실험에 사용한 마타리(Patrinia scabiosaefolia F.)뿌리는 조선대 약초원에서 채집하여 정확히 감정한 후 사용하였고 자료의 일부는 표준품(CU-958)으로 조선대학교 약학대학 표본실에 보관하고 있다.
- 분취용 column chromatography의 packing material로는 Kieselgel 60(230-400 mesh, ASTM, Art. 7734, Merck), Kieselgel 60(40~60 µm, Art. 9385, Merck), LiChroprep RP-18(40~63 µm, L610400 138, Merck)을 사용하였다.
- 여기에 xanthine oxidase(1 unit in 10 ml buffer)용액 50 µl를 넣은 후 25℃ incubator 안에서 30분 동안 반응을 시킨 다음 570 nm에서 microplate reader를 통해 흡광도를 측정하였다. 시료를 녹였던 5% DMSO in buffer 용액을 control로 하였으며 실험의 표준물질로는 allopurinol을 사용하였다. 항산화 활성(%)은 control에 대한 상대적인 퍼센트 즉 [(rate of control-rate of sample reaction)/rate of control]*100으로 표시하였다.
성능/효과
- IR spectrum에서 3430 cm-1의 흡수피크로 OH 피크를, 1760 cm-1의 흡수피크로 γ-lactone기가 존재함을 확인하였다.
- 또한 화합물 1~2에 대해 MG-63 세포에서 IL-6의 유리(%)를 검토한 결과 화합물 1~2의 IL-6의 유리(%)는 각각 66.1±2.5, 18.7±8.3로 나타나 화합물 1은 MG-63 세포로부터 IL-6의 유리를 현저히 감소시키는 것으로 관찰되었다.
- 0에 C-8에 기인하는 피크가 각각 관찰되었다. 이상의 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 2는 dibenzylbutyrolactone 인 nortrachelogenin으로 동정하였으며,23-27) 마타리 뿌리로부터 처음으로 분리된 화합물이다.
- 2에 C-8, C-8', C-8''에 기인하는 methine carbon 피크가 관찰되었다. 이상의 분광학적인 결과 및 문헌상에 나타난 data와의 비교를 통해 화합물 1은 butyrolactone sesquilignan인 lappaol E로 동정하였으며,18-22) 마타리 뿌리로부터 처음으로 분리된 화합물이다.
- 화합물 1~2에 대해 NBT superoxide scavenging assay를 이용한 항산화활성을 검색한 결과 화합물 1~2의 EC50는 각각 10.7, 13.1 µg/ml로 강한 활성을 나타냈으며 이는 aromatic ring및 화합물에 존재하는 OH기가 활성발현에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다.
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