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문제 정의
- IC50 값과 docking score간 상관관계 − Surflex-Dock에서 얻은 30개의 리간드 pose 각각에 대해 계산된 docking score 값과 IC50 값과의 상관관계를 보고자 하였다.
- 본 연구에서는 computer-aided drug design(CADD)의 한 방법인 molecular docking을 이용하여 인간 Topo I-DNA 절개가능 복합체 구조와 20S-CPT 유도체간의 결합양상을 분석하고, 저해 활성 값과 docking score 간의 상관관계를 수립하고자 하였다.
가설 설정
- 11) CPT는 Topo I-DNA 중간체를 trap함으로써 함께 안정한 삼성분 복합체(ternary structure)를 이루며 빠르게 분열하는 세포 내에서 replication fork와 충돌하고 lethal lesion에 이르게 되어 세포독성을 유발한다.12,13) DNA나 Topo I이 단독으로 있을 때는 결합하지 않는다.11)
제안 방법
- G_Score는 docking에 널리 사용되는 genetic algorithm을 이용한 program인 GOLD(Genetic Optimization for Ligand Docking)의 scoring function을 통해 도출된 score로 수소 결합, 리간드와 단백질 사이의 energy, 리간드 간의 energy를 항으로 가진다. CScore가 높으면서 G_Score 가 가장 좋은 conformation을 선택하여 Topo I-DNA 절개가능 복합체와의 상호작용을 분석하고, 알려진 약물 작용기전에 따라 cleavage site의 염기 사이에서 staking interaction을 형성하는지 보았다.
- Docking 실험에 사용할 20S-CPT 유도체의 구조는 수정된 1K4T.pdb의 결정 구조의 리간드인 topotecan의 5환을 기본으로 하여 sketch하였다. Tripos manual에서의 원자 형을 근거로 모든 원자형을 확인하였다.
- Docking에 사용된 12개의 20S-CPT 유도체를 20S-CPT의 IC50 값인 0.5 µM를 기준으로 IC50 값이 0.5 µM 이하인 화합물과 0.5 µM 이상인 화합물로 나누어 분류하였다.
- Docking을 수행하기 전에 X-선 결정 구조의 리간드와 그 리간드를 docking하였을 때를 서로 비교하여 사용한 docking protocol 에 의해 결정 구조가 얼마나 정확하게 재현되는지를 검증하기 위해, Topo I-DNA 절개가능 복합체의 X-선 결정 구조 1K4T.pdb 에서 리간드를 제거하고 그 구조에 제거한 리간드를 docking하였다. 그 결과, 리간드인 topotecan의 모핵은 DNA 염기 위에서 stacking 상호작용을 하며 X-선 결정 구조와 거의 흡사하게 intercalative mode로 결합하는 것을 확인하였다 RMSD는 0.
- 이 정의된 활성 부위를 protomol이라고 한다. Protomol을 생성하고, Surflex-Dock의 기본 setting으로(단, additional starting conformations per molecule은 5로 설정) 각 리간드마다 30개의 pose가 도출되도록 20S-CPT 유도체의 docking 실험을 수행하였다. Scoring fuction 은 Surflex score외에 ChemScore, G_Score, D_Score, PMF_ Score가 포함되어 있는 CScore(consensus score)를 추가로 계산 하였다.
- 값과의 상관관계를 보고자 하였다. Score 중 G_Score와 가장 큰 상관관계를 보였고 각 화합물마다 30개의 pose 중에서 가장 낮은 G_Score값을 갖는 것을 선택하여 Topo I에 대한 IC50값과 비교하였다. 선택된 각 pose의 G_Score의 결정계수(r2 )값은 0.
- Protomol을 생성하고, Surflex-Dock의 기본 setting으로(단, additional starting conformations per molecule은 5로 설정) 각 리간드마다 30개의 pose가 도출되도록 20S-CPT 유도체의 docking 실험을 수행하였다. Scoring fuction 은 Surflex score외에 ChemScore, G_Score, D_Score, PMF_ Score가 포함되어 있는 CScore(consensus score)를 추가로 계산 하였다.
- Surflex-Dock 실험 결과로 각 리간드 당 30개의 conformation 이 나왔으며 각 리간드 의 conformation은 같이 계산되어 나온 score에 근거하여 선택되었다. Surflex_Score 및 CScore에 포함 되어 있는 Chem_Score, G_Score,27) D_Score, PMF_Score를 함께 분석하였다. CScore는 각 리간드마다 얻어진 30개 conformation의 개별 score 평균값을 계산하여 각 개별 score가 평균값 이상을 가지면 1을 주고 이하의 값을 가지면 0을 준 후 합한 값이다.
- pdb의 결정 구조의 리간드인 topotecan의 5환을 기본으로 하여 sketch하였다. Tripos manual에서의 원자 형을 근거로 모든 원자형을 확인하였다. 생리적 조건에서의 protonation 상태에 맞게 조절하고 그에 상응하는 formal charge를 주었다.
- 리간드는 topotecan의 lactone form과 carboxylate form 중 비활성 형인 carboxylate form을 제거하였다. 그리고 SYBYL의 Biopolymer Structure Preparation Tool을 사용하여 atom types, backbone, N-, C-termini, hydrogen bonding, bump 등을 고려하여 docking 실험에 적합하도록 구조를 처리하였다. 그리고, 단백질에는 Kollman-all-atom charge를, DNA, 물 분자, 리간드에는 Gasteiger-Hückel charge를 주었다.
- 그리고 Tripos force field, Gasteiger-Hückel charge를 사용하여 에너지를 최소화하였다(Method, Powell; gradient, 0.001 kcal/(mol*A); maximum iterations, 100000).
- 그리고, 1K4T.pdb를 docking 연구에 적합하도록 수정하였다. 단백질, DNA, 리간드, 물 분자가 포함되어 있는 X-선 결정 구조에서 우선 DNA sequence의 G11을 수정하였다.
- pdb를 docking 연구에 적합하도록 수정하였다. 단백질, DNA, 리간드, 물 분자가 포함되어 있는 X-선 결정 구조에서 우선 DNA sequence의 G11을 수정하였다. G11의 경우 안정한 결정 구조를 만들기 위하여 G11의 5'-OH기가 5'-SH기로 치환23,24)된 5'-thio-2'-deoxy-guanosine phosphonic acid(TGP) 구조로 되어 있으므로 황을 산소로 바꾸었다.
- CScore는 각 리간드마다 얻어진 30개 conformation의 개별 score 평균값을 계산하여 각 개별 score가 평균값 이상을 가지면 1을 주고 이하의 값을 가지면 0을 준 후 합한 값이다. 이 실험에서는 CScore가 4~5로 높으면서 개별 score들의 가장 좋은 conformation을 선택하여 분석하였다. 선택된 conformation들과 저해 활성 값을 비교하였을 때, G_Score가 가장 큰 상관관계를 보였다.
대상 데이터
- Protein Data Bank(PDB)에서 인간 Topo I-DNA 절개가능 복합체 구조에 20S-CPT 유도체인 topotecan이 결합하고 있는 1K4T.pdb를 선택하였다. 1K4T.
성능/효과
- 0.038 µM과 0.368 µM의 사이에 있는 compound 1번~9번은 20S-CPT보다 활성이 좋은 것으로 보았고 0.635 µM과 1.022 µM 사이에 있는 compound 10번~12번은 20S-CPT 보다 활성이 좋지 않은 것으로 판단하였다(Table I).
- 2) 절단된 DNA 가닥의 5'-OH가 3'-phosphotyrosine 결합을 공격할 때, 두 번째 transesterification 반응을 통해서 DNA phosphotyrosine 골격은 복원된다.
- 3) Topo I에 의한 DNA 복원의 속도가 절단하는 속도보다 더 빠르기 때문에 공유결합으로 연결된 3'-phosphotyrosyl Topo I-DNA 절개가능 복합체(cleavable complex)의 steady-state concentration은 낮게 유지된다.
- 23) Lys532는 Topo I과 DNA 사이에서 cleavage mechanism 이 진행될 때 transition state를 안정화하는 역할을 하는 중요한 잔기로 알려져 있고,14) Asp533은 CPT에 대한 enzyme sensitivity 를 위해 필요로 하는 잔기로 알려져 있다.3) 대부분의 화합물들은 물 분자 1 또는 2번과 연계하여 Topo I과 수소결합을 하거나 수소결합이 가능한 거리에 위치해 있었다. 반면에 물 분자 3번과 연계하여 수소결합을 하는 화합물은 없었다.
- IC50 값이 0.5 µM 이상인 유도체의 docking 결과 − IC50 값이 0.5 µM 이상인 compound 10번~12번은 docking 결과, cleavage site의 DNA의 +1/-1 염기(G11-T10) 사이에서 벗어나 E 환이 major groove쪽으로 향하여 결합되어 있었다.
- IC50 값이 0.5 µM 이하인 유도체의 docking 결과 − IC50 값이 0.5 µM 이하인 compound 1~9는 docking한 결과, 공통적으로 CPT의 모핵이 DNA의 +1/-1 염기(G11-T10) 사이에 안정하게 intercalate 되었으며 cavity pocket안에 화합물들이 감싸져 있었다.
- 그 결과, 리간드인 topotecan의 모핵은 DNA 염기 위에서 stacking 상호작용을 하며 X-선 결정 구조와 거의 흡사하게 intercalative mode로 결합하는 것을 확인하였다 RMSD는 0.83 Å으로 좋은 재현성을 나타내었다(Fig. 2).
- 16,19-21) Topotecan이 -1과 +1의 염기 쌍과 stacking 상호 작용을 형성하여 평행하게 intercalation 되었음이 확인되었고 이성분 복합체에서 topotecan의 결합위치가 +1 염기 쌍이 존재하는 곳과 같은 공간에 위치하기 때문에 topotecan 의 평평한 5환이 DNA 염기 쌍과 유사하게 작용하는 것으로 밝혀졌다. 또한 intercalation이 되기 위한 binding pocket은 끊어지지 않은 가닥의 phosphodiester 결합의 작은 회전으로 생성되기 때문에 DNA 염기가 helix 밖으로 flip out 된다는 모델의 가능성은 줄어들었다.18)
- 이 실험에서는 CScore가 4~5로 높으면서 개별 score들의 가장 좋은 conformation을 선택하여 분석하였다. 선택된 conformation들과 저해 활성 값을 비교하였을 때, G_Score가 가장 큰 상관관계를 보였다. G_Score는 docking에 널리 사용되는 genetic algorithm을 이용한 program인 GOLD(Genetic Optimization for Ligand Docking)의 scoring function을 통해 도출된 score로 수소 결합, 리간드와 단백질 사이의 energy, 리간드 간의 energy를 항으로 가진다.
- 인간 Topo I-DNA 절개가능 복합체에 Topo I 저해 활성이 알려져 있는 CPT 유도체 12개를 docking한 결과, IC50 값이 0.5µM 이하인 9개의 화합물들은 모두 DNA의 G11과 T10 사이에 intercalative mode로 결합하였다.
- 전체적으로 화합물들의 Topo I 저해 활성에 따라 결합양상의 차이가 있고 Topo I 잔기와 화합물간의 수소결합 양상이 다르다는 것을 알 수 있었다. 이 차이는 A 환의 치환기에 따른 것으로 보이며 특히 compound 5의 amino기가 가장 강력한 수소결합 donor로서 작용하고 있었다.
- 활성부위 잔기와 직접적인 수소결합 또는 물 분자와 연계한 수소결합 형성으로 리간드-Topo I-DNA 삼성분 복합체의 구조를 안정화시켰다. 특히 공통적으로 E 환이 촉매활성 부위의 Topo I잔기인 Ptr723에 근접하여 주위의 잔기들과 상호 작용을 하고 있는 것을 docking 결과로 확인할 수 있었다. 반면에 IC50 값이 0.
후속연구
- 이상의 docking 실험 결과를 통해 CPT 유도체의 Topo I-DNA 절개가능 복합체에서 이루는 결합위치와 결합양상을 밝히고, 저해 활성 실험결과와 docking 실험결과의 상관관계를 발견하였으며, 이는 앞으로 다양한 CPT 유도체 및 새로운 Topo I 저해제 개발에 큰 도움이 될 것으로 예상된다.
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