오징어내장 분획물의 in vitro에서의 암세포 성장억제 및 quinone reductase유도 활성 증가 효과 Growth Inhibitory and Quinone Reductase Activity Stimulating Effects of Internal Organs of Todarodes pacificus Fractions on Human Cancer Cell Lines In vitro원문보기
본 연구에서는 오징어내장을 각 용매별로 분획하여 암세포 성장 억제 효과와 quinone reductase (QR) 유도 활성 증가 효과를 알아보았다. 간암 세포인 HepG2, 유방암 세포주인 MCF-7 그리고 대장암 세포주인 HT-29를 이용하여 암세포 성장 억제 효과를 실험한 결과 모든 세포주에서 TPMH층에서 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었고 다음으로 TPMM층에서도 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 그리고 HepG2, MCF-7 및 HT-29 세포주에서 모두 농도 의존적인 암세포 성장 억제 효과를 나타내었으나 간암 세포주인 HepG2에서 가장 높은 효과를 나타내어 특히 간암에 대한 예방효과가 기대되어진다. 또한 암 예방 효과를 알아보기 위하여 3종의 암세포 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 인체 간암세포주인 HepG2를 이용하여 QR 유도 활성 증가 효과를 측정한 결과, 암세포 성장 억제 효과의 결과에서와는 달리 TPMM층에서 유의적으로 가장 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었고 다음으로 TPMH층에서도 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었다. 본 실험 결과에서 암세포 성장 억제 효과는 오징어내장의 hexane 분획층인 TPMH층에서 가장 높게 나타났으며, QR 유도 활성 효과는 methanol 분획층인 TPMM층에서 가장 높게 나타났으므로 이들 분획층에 유효한 생리활성 물질이 함유되어 있을 가능성 추정되어진다. 따라서 본 연구를 통하여 오징어 부산물인 내장을 이용한 항암 관련 기능성 식품의 개발 가능성이 보이며, 이를 위한 TPMH 분획층과 TPMM 분획층에 대한 집중적인 연구가 요구된다.
본 연구에서는 오징어내장을 각 용매별로 분획하여 암세포 성장 억제 효과와 quinone reductase (QR) 유도 활성 증가 효과를 알아보았다. 간암 세포인 HepG2, 유방암 세포주인 MCF-7 그리고 대장암 세포주인 HT-29를 이용하여 암세포 성장 억제 효과를 실험한 결과 모든 세포주에서 TPMH층에서 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었고 다음으로 TPMM층에서도 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 그리고 HepG2, MCF-7 및 HT-29 세포주에서 모두 농도 의존적인 암세포 성장 억제 효과를 나타내었으나 간암 세포주인 HepG2에서 가장 높은 효과를 나타내어 특히 간암에 대한 예방효과가 기대되어진다. 또한 암 예방 효과를 알아보기 위하여 3종의 암세포 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 인체 간암세포주인 HepG2를 이용하여 QR 유도 활성 증가 효과를 측정한 결과, 암세포 성장 억제 효과의 결과에서와는 달리 TPMM층에서 유의적으로 가장 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었고 다음으로 TPMH층에서도 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었다. 본 실험 결과에서 암세포 성장 억제 효과는 오징어내장의 hexane 분획층인 TPMH층에서 가장 높게 나타났으며, QR 유도 활성 효과는 methanol 분획층인 TPMM층에서 가장 높게 나타났으므로 이들 분획층에 유효한 생리활성 물질이 함유되어 있을 가능성 추정되어진다. 따라서 본 연구를 통하여 오징어 부산물인 내장을 이용한 항암 관련 기능성 식품의 개발 가능성이 보이며, 이를 위한 TPMH 분획층과 TPMM 분획층에 대한 집중적인 연구가 요구된다.
We investigated the growth inhibitory effect of internal organs of Todarodes pacificus (TP) on proliferation in human cancer cell lines in vitro. The internal organs of TP were extracted with methanol (TPM), which was then further fractionated into four subfractions by using a solvent partition meth...
We investigated the growth inhibitory effect of internal organs of Todarodes pacificus (TP) on proliferation in human cancer cell lines in vitro. The internal organs of TP were extracted with methanol (TPM), which was then further fractionated into four subfractions by using a solvent partition method, resulting in hexane (TPMH), methanol (TPMM), butanol (TPMB), and aqueous (TPMA) soluble fractions. We determined the cytotoxic effect of these four fractions in three kinds of cancer cell lines - HepG2, MCF-7 and HT-29 - by MTT assay. Among the four subfractions of TPM, TPMH showed the strongest cytotoxic effects at a concentration of $300{\mu}g$/ml, displaying 91.56% on the HepG2 cell line and 85.93% on the MCF-7 cell line. Morphological changes such as membrane shirinking and blebbing of cells were also observed during TPMH treatment of HepG2 cells. In addition, we also observed quinone reductase (QR) induced effect in the methanol (TPMM) layer of HepG2 cells. TPMM showed the highest induction activity of quinone reductase on HepG2 cells among the other partition layers. The QR induced effect of TPMM was determined to be 2.7 at a level of $360{\mu}g$/ml with a control value of 1.0. Although further studies are needed, the present work suggests that internal organs of Todarodes pacificus (TP) may be a chemopreventive agent for the treatment of human cells.
We investigated the growth inhibitory effect of internal organs of Todarodes pacificus (TP) on proliferation in human cancer cell lines in vitro. The internal organs of TP were extracted with methanol (TPM), which was then further fractionated into four subfractions by using a solvent partition method, resulting in hexane (TPMH), methanol (TPMM), butanol (TPMB), and aqueous (TPMA) soluble fractions. We determined the cytotoxic effect of these four fractions in three kinds of cancer cell lines - HepG2, MCF-7 and HT-29 - by MTT assay. Among the four subfractions of TPM, TPMH showed the strongest cytotoxic effects at a concentration of $300{\mu}g$/ml, displaying 91.56% on the HepG2 cell line and 85.93% on the MCF-7 cell line. Morphological changes such as membrane shirinking and blebbing of cells were also observed during TPMH treatment of HepG2 cells. In addition, we also observed quinone reductase (QR) induced effect in the methanol (TPMM) layer of HepG2 cells. TPMM showed the highest induction activity of quinone reductase on HepG2 cells among the other partition layers. The QR induced effect of TPMM was determined to be 2.7 at a level of $360{\mu}g$/ml with a control value of 1.0. Although further studies are needed, the present work suggests that internal organs of Todarodes pacificus (TP) may be a chemopreventive agent for the treatment of human cells.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 오징어내장을 각 용매별로 분획하여 암세포 성장 억제 효과와 quinone reductase (QR) 유도 활성 증가 효과를 알아보았다.
본 연구에서는 저이용 되고 있는 오징어 부산물인 오징어 내장을 이용하여, 암세포 성장 억제 효과를 MTT방법 assay를 이용하여 알아보았고, 암 예방 물질 탐색에 사용되어지는 quinone reductase (QR) 유도 활성 증가 효과를 측정하여 암 예방효과를 검토하여 발암 억제 효과를 가진 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria[24, 29] 의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 80% 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 IxlO, cells/ml 되도록 HepG2 세포주를 분주하여, incubator에 24시간동안 배 양한 후 오징어내장 분획물을 HepG2의 세포생존율이 50% 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 90, 180, 270 및 360 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 다시 24시간동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 80% 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 IxlO, cells/ml 되도록 HepG2 세포주를 분주하여, incubator에 24시간동안 배 양한 후 오징어내장 분획물을 HepG2의 세포생존율이 50% 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 90, 180, 270 및 360 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 다시 24시간동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 μ1의 lysis buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.
일정시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 100 μ1씩 첨가하여 4시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 form azan이 흐트러지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액을 1 ml를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 측정하였다. 대조군 세포수를 100%로 정하고 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
T-75 flask의 세포가 80% 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 IxlO, cells/ml 되도록 HepG2 세포주를 분주하여, incubator에 24시간동안 배 양한 후 오징어내장 분획물을 HepG2의 세포생존율이 50% 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 90, 180, 270 및 360 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 다시 24시간동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 μ1의 lysis buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 14 mM NaCl, 15 mM MgCl2/ 0.5% NP-40)를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에 10분간 두면서 cell을 lysis한 후 reaction mixture 즉, 10 mM Tris-Cl (pH 7.4), 0.5 mg/ml BSA, 0.008% tween-20, 40 μM FAD, 0.8 mM glucose-6-phosphate, 2 Unit/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase, 25 μM NADP, 40 gg/ml MTT 및 1 mM me-nadione을 혼합하여 well에 1 ml씩 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 반응 정지용액인 10.3 mM dicumarol, 0.5% pyridine, 5 mM potassium phosphate (pH 7.4) 혼합액을 250 μ1씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리 고단백 질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다.
본 실험에서는 간암 세포인 HepG2, 유방암 세포인 MCF-7 및 대장암 세포인 HT-29를 이용하여 오징어내장 분획물에 대한 각 암세포주의 성장 억제 효과를 MTT assay를 이용하여 알아보았다. Fig.
세포배양용 petridish에 각각의 암세포주를 24시간 동안 안정화시킨 다음 오징어내장 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰한 후에 Olympus DP70을 이용하여 촬영하였다.
시료로 사용된 오징 어내장은 paste형태로 동결 건조 후 시료와 메 탄올을 1:5 (W/V)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하기 위하여 우선 메탄올과 다이클로로메탄(CH2CI)을 1:1로 섞은 용액에 2회 추출한 후 회전식 진공농축기로 일정시간 감압 농축시켜 동결건조한 후 오징어내장 methanol추출물(TPM)을 얻었다. 이 추출물을 hexane층(TPMH), methanol층(TPMM), butanol층 (TPMB) 및 aqueous층(TPMA)으로 나누어 비극성에서 극성으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
암세포 성장 억제 효과에 사용된 3종의 암세포 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 간암 세포인 HepG2 세포주를 사용하여 오징 어내장의 QR 유도 활성 증가 효과를 측정하였으며 그 결과는 Fig. 5와 같다. HepG2 암세포주에 대한 용매별 오징어내장 분획물을 각각 90, 180, 270, 360 ㎍/ml씩 첨가했을 때, TPMH층이 가장 높은 효과를 보인 암세포 성장 억제 효과의 결과와는 달리 TPMM층에서 가장 높은 QR유도 활성증가 효과를 나타내었다.
암세포 성장 억제 효과에서 가장 높은 효과를 나타낸 hexane 분획층인 TPMH층의 처리가 암세포의 형태에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해 각 세포주에 여러 농도의 TPMH 층을 48시간 동안 처리한 후 위상차현미경으로 형태학적인 관찰을 하였다.
오징 어내장은 paste형태로 동결 건조 후 시료와 메탄올을 1:5(W/V)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하기 위하여 다시 메탄올과 다이클로로메탄(CH2CI)을 1:1로 섞은 용매에 2회 추출하여 오징어내장 추출물(TPM) 33.72 g을 얻고, 이 추출물을 분획하여 hex-ane층(TPMH) 4.21%, methanol층(TPMM) 9.19%, butanole (TPMB) 3.70% 및 aqueous층(TPMA) 59.30%를 수득하였으며, 각 시료의 용매별 수득율은 Table 2와 같다.
incuba tor 에서 monolay er 로 배양하였다. 위의 3 종의 세포주는 일주일에 2~3회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포주가 5x1(/ cells/ml 정도 증식 되면 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.0)으로 2번 세척한 후 tryp- sin-EDTA를 처 리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배양액으로 암세포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75 flask에 10 ml씩 분할하여 주입하고 4~5일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계 대 배 양시 각각의 passage number가 10회 이상일 때는 액체질소탱크로부터 새로운 세포를 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.
후 오징어내장 methanol추출물(TPM)을 얻었다. 이 추출물을 hexane층(TPMH), methanol층(TPMM), butanol층 (TPMB) 및 aqueous층(TPMA)으로 나누어 비극성에서 극성으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
이를 위해 각 세포주는 IxlO, cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 ml씩 첨가하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400, 500㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 일정시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 100 μ1씩 첨가하여 4시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 form azan이 흐트러지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액을 1 ml를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 측정하였다.
대상 데이터
HepG2, MCF-7 세포주는 DMEM medium을 사용하였고 HT-29 세포주는 RPMI1640을 사용하였으며 medium에 10% 의 fetal bovine serum (FBS) 와 1% 100 units/ml의 penicillin streptomycin이 함유된 것으로 T-75 flask에 이식한 후 37℃, 5% CO2 incuba tor 에서 monolay er 로 배양하였다. 위의 3 종의 세포주는 일주일에 2~3회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포주가 5x1(/ cells/ml 정도 증식 되면 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.
본 실험에 사용된 오징 어내장(internal organs of Todarodes pacificus, TP)은 2006년 동우산업(주)에서 paste 형태로 제공받아 시료로 사용하였다.
본 실험에 사용된 오징어내장 paste는 경북 포항에 위치한 (주)동우산업에서 제공받은 것으로 (주)동우산업 사장님께 감사드립니다.
본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2(Human hepatocellular carcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (Human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 대장암세포인 HT-29 (Human colon adenocarcinoma)로서 2005년 6월 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다.
세포실험에 사용된 시약 중 NP4)과 3-[4^-dimethylthiazol- 2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 와 menadionee Sigma사 제품을 구입하였고 flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase는 Amresco사 제품을 구입하였으며, minimum essential medium (MEM), Dulbeco's Eagle modified medium (DMEM)과 phosphate buffered saline (PBS) 등은 Gibco-BRL (USA) 에서구입하였다. 그 외 연구에 사용된 용매 및 시 약은 특급 을 사용하였다.
데이터처리
본 실험에 대한 실험결과는 세 번 실험하여 얻어진 평균치 및 표준편차를 나타내었고, 그룹간의 통계적 차이는 studenfs t-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
4) 혼합액을 250 μ1씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리 고단백 질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다.
4) 혼합액을 250 μ1씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리 고단백 질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다.
의하여 측정하였다. 수분은 상압가열 건조법, 회분은 건식 회화법, 조지 방은 Soxhlet법 (Extraction system B-811, BuCHK, Switzland), 조단백 질은 semi micro kjeldahl법 (Auto Kjeldahl Unit K-370, BuCHK)으로 측정하였다.
오징 어내장 분획물의 암세포 증식억제효과는 MTT assay를 사용하여 행하였다. MTT (3-^^-dimethylthiazole-yl]-^- diphenyltetrazolium bromide) [1, 5] assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 dehydrogenase/} 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용하였다.
오징어내장의 일반성분은 식품공전(2005)의 일반성분 시험법에 의하여 측정하였다. 수분은 상압가열 건조법, 회분은 건식 회화법, 조지 방은 Soxhlet법 (Extraction system B-811, BuCHK, Switzland), 조단백 질은 semi micro kjeldahl법 (Auto Kjeldahl Unit K-370, BuCHK)으로 측정하였다.
성능/효과
3가지 인체 암세포주에 미치는 오징어내장 분획물의 암세포 성장 억제에 대한 실험 결과에서 hexane 분획층인 TPMH층에서 그 효과가 가장 높게 나타났으며 다음으로 methanol 분획 층인 TPMM층에서 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 본 실험실에서 연구되어진 말똥성게 분획물의 암세포 성장 억제 효과의 결과[36]와 일치하였으나 첨가한 시료의 양을 비교해 볼 때, 말똥성게의 2배에 해당되는 양에서 유사한 효과를 보여 말똥성게보다는 낮은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다.
그러나 TPMB층과 TPMA 층의 암세포 성장 억제 효과는 40% 이하로 매우 낮았다. Fig. 2는 MCF-7 세포주에 대한 결과로서 HepG2 에서와 마찬가지로 TPMH층에서 가장 높은 억제 효과를 나타내어 500 ng/ml 농도에서 85.93%의 효과를 나타내었으며 다음으로 TPMM층에서 500 ng/ml 농도에서 85.51%의 높은 억제효과를 나타내었다. 그리고 TPMB층에서는 조금 낮은 55.
5와 같다. HepG2 암세포주에 대한 용매별 오징어내장 분획물을 각각 90, 180, 270, 360 ㎍/ml씩 첨가했을 때, TPMH층이 가장 높은 효과를 보인 암세포 성장 억제 효과의 결과와는 달리 TPMM층에서 가장 높은 QR유도 활성증가 효과를 나타내었다. 대조군을 1로 했을 경우 TPMM층에서 그 효과가 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였으며 180 gg/ml 첨가 했을 때 1.
1은 HepG2 세포주에 대한 실험 결과이며 오징어내장 분획물의 암세포 성장 억제 효과는 TPMH층에서 가장 높은 억 제 효과를 나타내었다. TPMH층은 300 ㎍/ml의 농도에서 86.82%의 억제 효과를 나타내었고, 500 gg/ml 농도에서는 91.56%의 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 다음으로 TPMM층에서 암세포 성장 억제 효과를 나타내 었으며 400 gg/ml 농도에서 84.
간암 세포인 HepG2, 유방암 세포주인 MCF-7 그리고 대장암 세포주인 HT-29 를 이용하여 암세포 성장 억제 효과를 실험한 결과 모든 세포주에서 TPMH층에서 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었고 다음으로 TPMM층에서 도 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 그리고 HepG2, MCF-7 및 HT-29 세포주에서 모두 농도 의존적인 암세포 성장 억제 효과를 나타내었으나 간암 세포주인 HepG2에서 가장 높은 효과를 나타내어 특히 간암에 대한 예방효과가 기대되어진다.
1에 나타내었다. 그 결과, 조지방은 23.1%, 조단백질은 57.2%로 전체의 80% 이상을 차지하였고 회분은 7.1%였다.
51%의 높은 억제효과를 나타내었다. 그리고 TPMB층에서는 조금 낮은 55.72%의 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며, TPMA층에서는 최종 농도인 500 gg/ml 농도에서도 가장 낮은 18.52%의 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. Fig.
56%의 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 다음으로 TPMM층에서 암세포 성장 억제 효과를 나타내 었으며 400 gg/ml 농도에서 84.69%와 500 gg/ml 농도에서 86.37%의 억제 효과를 나타내었다. 그러나 TPMB층과 TPMA 층의 암세포 성장 억제 효과는 40% 이하로 매우 낮았다.
HepG2 암세포주에 대한 용매별 오징어내장 분획물을 각각 90, 180, 270, 360 ㎍/ml씩 첨가했을 때, TPMH층이 가장 높은 효과를 보인 암세포 성장 억제 효과의 결과와는 달리 TPMM층에서 가장 높은 QR유도 활성증가 효과를 나타내었다. 대조군을 1로 했을 경우 TPMM층에서 그 효과가 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였으며 180 gg/ml 첨가 했을 때 1.4배, 270 gg/ml 첨가 했을 때 2.0배 그리고 최종농도인 360 gg/ml 첨가 했을 때에는 대조군에 비해 TPMM층이 2.73배의 높은 QR 유도 활성을 나타내었다. 다음으로 TPMH층에서도 1.
그리고 HepG2, MCF-7 및 HT-29 세포주에서 모두 농도 의존적인 암세포 성장 억제 효과를 나타내었으나 간암 세포주인 HepG2에서 가장 높은 효과를 나타내어 특히 간암에 대한 예방효과가 기대되어진다. 또한 암 예방 효과를 알아보기 위하여 3종의 암세포 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 인체 간암세포주인 HepG2를 이용하여 QR 유도 활성 증가 효과를 측정한 결과, 암세포 성장 억제 효과의 결과에서와는 달리 TPMM층에서 유의적으로 가장 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었고 다음으로 TPMH층에서도 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었다.
본 실험 결과에서 암세포 성장 억제 효과는 오징어내장의 hexane 분획층인 TPMH층에서 가장 높게 나타났으며, QR 유도 활성 효과는 methanol 분획층인 TPMM층에서 가장 높게 나타났으므로 이들 분획층에 유효한 생리활성 물질이 함유되어 있을 가능성 추정되어진다. 따라서 본 연구를 통하여 오징어 부산물인 내장을 이용한 항암 관련 기능성 식품의 개발 가능성 이 보이며, 이를 위한 TPMH분획층과 TPMM분획층에 대한 집중적인 연구가 요구된다.
4는 HepG2 세포주에 농도별로 시료를 첨가한 후의 세포형태의 변화를 관찰한 결과이다. 시료 농도의 증가에 따라 의존적으로 현저한 세포 밀도의 감소현상과 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상 등의 형태학적 변화가 나타났으며 암세포들의 부착력 상실과 파괴된 세포 잔여물들이 뚜렷하게 관찰되었다.
2배의 QR유도 활성 증가 효과를 나타내었다. 이상의 결과에서 오징어내장 분획물 중 TPMM층에서 가장 높은 QR 유도 활성 증가 효과를 보였고 다음으로 TPMH에서도 유의성 있는 QR 유도 활성을 보였으므로 이 두 분획층에서 암예 방 효소계 인 quinone reductase의 inducer가 주로 존재함을 추정할 수 있었다. 이러한 결과는 본 연구실에서 연구된 다른 시료들과 비교해볼 때, 키조개[28], 참치지느러미[35]등의 대부분의 해양생물이 주로 메탄올 분획 층에서 가장 높은 QR 활성 효과를 나타낸 결과와 일치하였으나 QR 유도 활성 효과는 다소 낮은 결과이다.
이와 같은 결과는 본 실험실에서 연구되어진 말똥성게 분획물의 암세포 성장 억제 효과의 결과[36]와 일치하였으나 첨가한 시료의 양을 비교해 볼 때, 말똥성게의 2배에 해당되는 양에서 유사한 효과를 보여 말똥성게보다는 낮은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 그러나 키조개, 참치지느러미 등의 해양 동물과 대부분의 해조류가 모두 메탄올 분획물에서 가장 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 결과[12, 26, 35, 3기와는 다른 결과이다.
3은 HT-29 세포주에 대한 결과로서 앞의 결과에서와 같이 TPMH층에서 가장 높은 억제 효과를 보였으나 앞의 HepG2 세포주와 MCF-7 세포주의 경우와 비교해 볼때 암세포 성장 억제 효과가 매우 낮았다. 즉, 500 ㎍/ml의 최종농도에서 TPMH층이 71.95%의 암세포 억제 효과를 나타내었으며, 다음으로 TPMM층에서 55.40%의 억제효과를 나타내었고, TPMB층에서 40.5%와 TPMA층에서 22.76%의 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다.
후속연구
따라서 암세포 성장 억제 효과를 일으키는 오징어내장의 생리활성 물질은 hexan층에 주로 존재하며 다음으로 methanol 층에서도 존재한다고 추측해 볼 수 있었으며 앞으로 이들 분획 층에서의 암세포 성장을 저지하기위한 기능성 물질의 존재가 기대되어진다. 그리고 실험에 사용한 세포주들을 비교해 볼 때, TPMH층이 간암세포주인 HepG2에서 가장 높은 억제 효과를 나타내었으며 다음으로 유방암 세포주 및 대장암 세포주 순으로 억제효과를 나타내었으므로 특히, 간암에 대한 항 발암 효과가 기대되어지고 앞으로 더욱 심도 있는 연구를 통해 이들 분획 층의 생 리 활성물질들을 규명하고 구조와 그 기 전들을 알아보는 연구가 진행되어야 한다고 생각된다.
있을 가능성 추정되어진다. 따라서 본 연구를 통하여 오징어 부산물인 내장을 이용한 항암 관련 기능성 식품의 개발 가능성 이 보이며, 이를 위한 TPMH분획층과 TPMM분획층에 대한 집중적인 연구가 요구된다.
이러한 결과는 본 연구실에서 연구된 다른 시료들과 비교해볼 때, 키조개[28], 참치지느러미[35]등의 대부분의 해양생물이 주로 메탄올 분획 층에서 가장 높은 QR 활성 효과를 나타낸 결과와 일치하였으나 QR 유도 활성 효과는 다소 낮은 결과이다. 앞으로 더욱더 심도 있는 연구를 통해 오징어내장 분획물중 이층에서의 생리활성 물질을 추적, 보완하여 그 구조를 동정함으로서 식품 산업에 있어서의 암 예방 효과를 지닌 기능성 식품개발에 매우 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
참고문헌 (39)
Alley, M. C., D. A. Scudiero, A. Monks, M. L. Hursey, M. J. Czerwinski, D. L. Fine, B. J. Abbortt, J. G. Mayo, R. H Shoemarker, and M. R. Boyd. 1988. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lline using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res. 48, 589-601
Bae, M. J., S. T. Yee, S. Y. Chae, S. H. Shin, S. H Kweon, M. H Park, M. K. Song, and S. J. Hwang. 2004. The effect of arabinoxylane and the polysaccharide peptide (PSP) on the antiallergy, anticancer. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 33, 469-474
Budd, G. T., B. Osgood, B. Barna, I. M. Boyett, J. Finke, S. V. Mdendrop, S. Murth, and R. M. Bukoski. 1989. Phase I clinical trial Toxicity and immunologic effects. Cancer Res. 49, 6432-6439
Carmichael, J., W. G. De Graff, A. F. Gazder, J. D. Minna, and J. B. Mitchell. 1987. Evalution of the tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 47, 936-942
Cha, B. c., H W. Lee, and M. Y. Cho. 1998. Antioxidative and antimicrobial effeats of nut species. Kor. J. Pharmacogn. 29, 28-34
Giampietri, A. 1981. Drug-mediated increase of tumor immunogenicity in vivo for a new approach to experimental cancer immunotherapy. Cancer Res. 41, 681-685
Hong, E. Y., H. J. Kang, C. S. Kwan, Y. J. Na, M. J. Suh, and J. S. Kim. 1997. Modulation of cellular quinone reductase inducibility by roasting treatment and acid hydrolysis of perilla. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 26, 186-192
Hwang, S. H., K. T. Lee, and K. S. Youn. 2007. Effect of emulsifiers on characteristics of microcapsule containing squid liver oil as a core material. Korean J. Food Sci. Technol. 39, 29-32
Jeong, Y. J. and J. H Seo. 2001. Quality characteristics for doenjang using squid internal organs. Korean J. Food Sci. Technol. 33, 89-93
Johnson, E. J. and E. J. Scahaefer. 2006. Potential role of dietary n-3 fatty acids in the prevention of dementia and macular degeneration. Am. J. Clin. Nutr. 83, 1494S-1498S
Jung, Y. H., B. M. Jung, M. O. Shin, and S. J. Bae. 2006. A study on the effects of anticarcinogenic activity of gloiopeltis tenax. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 35, 395-401
Kim, E. M., J. H. Jo, S. W. Oh, and Y. M. Kim. 1997. Characteristics of squid viscera oil. J. Kor. Fish. Soc. 30, 595-600
Kim, J. H, J. H Ha, and E. H Lee. 1997. Refining of squid vic era oil. J. Kor. Soc. Appl. BioI. Chem. 40, 294-300
Kim, J. S. 2005. Cancer chemoprevention and NSAID-activated gene (NAG-I). Biochemistry and Molecular Biology News 12, 286-291
Kim, J. S., J. G. Kim, and E. H Lee. 1997. Screening of by-products derived from marine food processing for extraction of DHA-contained lipid. J. Kor. Soc. Appl. BioI. Chem. 40, 215-219
Kim, K D., J. Y. Kang, J. B. Jeong, S. K Moon, and B. Y. Jeong. 2006. Lipid class and fatty acid composition of muscle portion from male and female common squid Todarodes pacificus. J. Kor. Fish Soc. 39, 367-375
Kinsella, J. E. 1988. Food lipid and fatty acids importance in food quality, nutrition and health. Food Technol. 42, 124-145
Lim, Y. H., M. W. Kim, A. J. Kim, and M. H Kim. 1999. The sensory and texture characteristics of inkyrice cake in according to concentrations of aquid ink. J. East Asian Soc. Dietary Life 9, 468-474
Moon, S. K, K D. Kim, J. Y. Kang, N. J. Sun, and B. Y. Jeong. 2006. Lipid class and fatty acid composition of the viscera from common squid, todarodes pacificus. J. Kor. Fish Soc. 39, 376-383
Oh, S. C. and J. S. Cho. 2002. The change of non-volatile organic acids in low salt fermented squid affected by adding to squid ink. J. Korean oil Chem. Soc. 20, 64-71
Ong, T. M., W. Z. Whong, S. Stewatr, and H E. Brickman. 1986. Chlorophyllin; a potent antimutagen against environmental and dietary complex mixture. Mutat. Res. 173, 111-115
Park, B. L H S. Suk, G. S. Chung, and J. K Shon. 1987. Studies on protoplast culture and fusion in cruciferae. Korean J. Breed. 19, 230-234
Park H J. 1998. Induction of quinone reductase and its regulatory mechanism at the transcriptional level by Scutellaria baicalensis, Ph. D. Dssertation, Yonsei University, Seoul
Park J. c. and J. W. Choi. 1996. Screening of marine natural products on inhibitory effect of the formation of lipid peroxidation. Kor. J. Pharmacogn. 27, 117-122
Park, S. Y., B. M. Jung, Y. H. Choi, and S. J. Bae. 2005. Growth inhibition effects of cancer cell lines by gloiopeltis furcata fractions in vitro. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34, 771-775
Park, T. S., J. E. Park J. S. Chang, M. W. Son, and K H Shon. 1998. Taurine content in korean foods of plant origin. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27, 801-807
Park, Y. L M. O. Shin, S. H Lee, and S. J. Bae. 2005. The growth inhibitory effects of atrina pecitinata fractions on cancer cell lines. Korean J. Nutrition 38, 307-312
Prochaska, H J. 1994. Screening strategies for the detection of anticarcinogenic enzyme inducers. J. Mutr. Biochem. 5, 360-370
Prochaska, H L A. B. Santamaria, and P. Talalay. 1992. Rapid detection of inducers of enzyme that protect against carcinogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 2394-2399
Prochaska, H J. and A. B. Santamaria. 1988. Direct measurement of NAD(P)H : Quinone reductase from cells cultured in microtiter wells : A screening assay for anticarcinogenic enzyme in ducers, Anal. Biochem. 169, 328-336
Schwartsmann, G., A. B. Roch, R. G. Berlinck, and J. Jimeno. 2001. Marine organisms as a source of new anticancer agents. Oncology 2, 221-225
Seo, J. H., Y. J. Jeong, G. D. Lee, and M. H Lee. 1999. Moniteoring characteristics of protease isolated from aquid viscera. J. East Asian Soc. Dietary Life 9, 195-199
Shim, J. H, K M. Kim, and D. H Bae. 2003. Comparisons of physicochemical and sensory properties in noodles containing spinach juice, beetroot juice and cuttlefish ink. Food Engineering Progress 7, 37-43
Shin, M. O., M. J. Ku, and S. J. Bae. 2007. Cytotoxicity and quinone reductase activity stimulating effects of fin of thunnus thynnus extracts in various cancer cells. Korean J. Nutrition 40, 147-153
Shin, M O. and S. J. Bae. 2009. The anticarcinogenic and antioxidative activity of Hemicentrotus pulacherrimus fractions in various cancer cells. J. Life science 19, 607-614
Shon, J. H, D. Y. Kang, H C. OH, B. M. Jung, M. H Kim, O. M. Shin, and S. J. Bae. 2006. The effects on antimicrobal and cytotoxicity of hijikia fusiformis fraction. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 39, 444-450
Wefers, H, T. Komai, P. Talalay, and H. Sies. 1984. Protection against reactive oxygen species by NAD(P)H: quinone reductase induced by the dietary antioxidant butylated hydroxyanisole (BHA). Federation of European Biochemical Societies 169, 63-66
Yazawa, K and H Kageyama. 1991. Physiology activity of docosahexaenoic acid. J. Japan Oil Chem. Soc. 40, 974-978
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.