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문제 정의
- HCT가 비만세포(HMC-1)에서 histamine분비 및 세포증식에 미치는 효과에 대해 실험하였다. 그 결과 HCT는 histamine분비 및 세포증식면에서 농도별로 별다른 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(Fig.
- 그래서 본 실험에서는 NF-κB 및 NF-κB 억제자인 I-κB의 단백질 발현정도를 관찰하였다.
- 본 연구는 魚腥草가 제반 만성질환 및 폐렴, 관절염, 알레르기 비염, 아토피피부염등 염증성질환에 광범위하고 다양하게 활용되고 있다는 것은 魚腥草의 항염증작용이 있을 것이라 보고 魚腥草 抽出物(HCT)의 항염증효과를 분자생물학적으로 확인해 보고자 하였다.
- 본 연구는 魚腥草의 항염증 작용을 알아보고자 비만세포를 활성화할 때 방출되는 histamine, TNF-α, IL-6, IL-8와 같은 염증 매개물질에 대한 억제효과를 분자 생물학적으로 규명하고자 진행하였다.
- 본 연구는 魚腥草의 항염증 효과를 알아보기 위하여 비만세포를 80% ethanol로 추출한 魚腥草 抽出物(HCT)로 전처리한 후, PMA와 A23187로 유도한 TNF-α, IL-6, IL-8의 염증매개물질의 생성에 어떠한 영향을 미치는가 알아보았으며, 또한 HCT로 전처리된 비만세포가 NF-κB의 활성을 억제하므로써 염증성 매개물질에 대한 억제 효과를 기대할 수 있는지에 대한 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 비만세포주인 HMC-1 세포에 PMA와 calcium ionophore A23187 로 자극하여 분비하는 염증성 물질에 대한 魚腥草 抽出物의 억제효과를 보여줌으로서, 魚腥草 抽出物이 typeⅠ인 즉시형 과민증에 나타나는 염증반응을 조절하는 효과가 있음을 규명하려 하였다.
- 이러한 사실을 바탕으로 이 실험에서는 염증성 질환에 대한 魚腥草의 효과를 확인하기 위하여 비만세포를 魚腥草 抽出物로 전처리한 후, PMA와 A23187로 유도한 TNF-α, IL-6, IL-8의 염증매개 물질의 생성에 어떠한 영향을 미치는가 알아보았으며, 또한 魚腥草 抽出物로 전처리된 비만세포가 NF-κB의 활성을 억제하므로써 염증성 매개물질에 대한 억제 효과를 기대할 수 있는지 알아보았다.
제안 방법
- HMC-1 세포에 HCT를 농도별로 처리했을 때 생존율을 MTS (Promega, Madison, USA) assay로 조사하였다.
- 25 ㎎/㎖로 넣어 2시간 반응하였다. 490 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였고, HCT의 세포증식효과에 대한 영향을 조사하였다.
- 5 unit Taq. DNA polymerase(TaKaRa Korea, Seoul, Korea)를 혼합하여 시행하였다. PCR 조건은 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 하였다.
- 비만세포인 HMC-1에서 HCT에 의한 PMA와 A23187로 유도된 TNF-α의 억제효과를 알아보기 위해 ELISA 및 RT-PCR 방법을 이용하였다. HCT를 0.05, 0.1, 0.2 ㎎/㎖의 농도로 HMC-1세포에 1시간 전 처리한 후 PMA(25 ng/㎖)와 A23187(1 uM)로 4시간 동안 처리하여 결과를 얻었다. 그 결과 HCT의 농도 의존적으로 TNF-α의 생성율이 현저히 감소되어 있었다.
- Luciferase assay를 위해 보관 중인 세포용해된 상층액 100 ㎕를 상온에서 Luciferase substrate20 ㎕씩 불투명한 96well에 넣어 luminometer(1420 luminescence counter, Perkin Elmer)로 측정하였다. Luciferase activity는 측정값을 총 단백질량으로 나누어 수치를 구한 뒤 (relative light units per milligram of protein), transfection된 정상세포를 기준으로 fold값을 구하였다.
- 얻은 상층액은 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. Luciferase assay를 위해 보관 중인 세포용해된 상층액 100 ㎕를 상온에서 Luciferase substrate20 ㎕씩 불투명한 96well에 넣어 luminometer(1420 luminescence counter, Perkin Elmer)로 측정하였다. Luciferase activity는 측정값을 총 단백질량으로 나누어 수치를 구한 뒤 (relative light units per milligram of protein), transfection된 정상세포를 기준으로 fold값을 구하였다.
- (Sigma Aldrich, Louis, MO), anti-NF-κB, anti-p-I-κB, anti-lamineB antibodies(Santa Cruz, California)를 이용하여 1차 항체반응을 4℃에서 16 시간 반응 시킨 다음 PBST로 2차 항체반응을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 10분, 15분, 30분간 세척한 후 ECL(Amersham Biosciences, UK) 로 발광하여 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현 분석을 실시하였다.
- 기질액을 각 well에 50 ㎕씩 가하여 20분간 발색을 유도한 다음 2N 황산을 이용하여 반응을 멈추고 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 TNF-α, IL-6, IL-8의 단백질 양을 측정하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 하였다. 반응액 중 cycle 별로 각각 5 ㎕를 취해서 2.0% 한천 겔에 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 PCR 산물을 확인하였다.
- 비만세포인 HMC-1에서 HCT에 의해 PMA와 A23187로 유도된 IL-6의 억제효과를 알아보기 위해 ELISA 및 RT-PCR 방법을 이용하여 IL-6의 단백질 및 mRNA의 발현량을 확인하였다. 그 결과 HCT의 0.
- 사람 비만세포인 HMC-1(Human Mast Cells)은 10% fetal bovine serum (FBS)을 첨가한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)에 100U/㎖ Penicillin과 100 ㎍/㎖ Streptomycin(P-S)을 첨가한 배지에서 2-3일마다 배양액을 교환해 주었으며, 배양 환경은 37℃ 포화 습도로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 세포를 24-well culture plate에 각각 1×106 개가 되도록 심어준 후 HCT를 0.01, 0.02, 0.04 ㎎/㎖로 1시간 전 처리 후 25 ㎚ PMA와 1 µM A23187을 24시간 처리한 후 MTS를 최종농도 0.25 ㎎/㎖로 넣어 2시간 반응하였다.
- 세포에 유전자 도입을 위해 transfection을 수행하였다. 우선 HMC-1세포를 1×106으로 12 well에 접종시킨 후 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pNF-κB luciferase(LUC)(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 혈청이 없는 배지 상태에서 일시적으로 transfection하였다.
- 우선 HMC-1세포를 1×106으로 12 well에 접종시킨 후 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pNF-κB luciferase(LUC)(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 혈청이 없는 배지 상태에서 일시적으로 transfection하였다.
- 우선, A23187과 PMA로 자극된 HMC-1 세포에서 염증 반응 조절 효과를 관찰하기 위해 ELISA 방법으로 HCT의 1시간 전 처리한 비만세포의 배양액으로부터 TNF-α, IL-6, 그리고 IL-8을 분비량을 측정하였다.
- RNA 침전물을 75% 에탄올로 세척하고, 상온에서 건조시킨 다음 diethylpyrocarbonate(DEPC)로 처리한 증류수에 녹였다. 정제된 RNA를 GeneQuant Pro(Amersham Biosciences)로 정량하고, ethidium bromide를 넣은 한천 겔에 전기영동하여 RNA의 integrity와 정확한 quantification을 재확인하였다.
- 즉 anti-human TNF-α, IL-6, IL-8 capture단클론 항체를 96 well plate에 각각 2 ㎍/㎖ 로 코팅하고 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다.
- 실험에 사용된 魚腥草 抽出物(HCT)은 옴니허브(Korea)에서 魚腥草를 구입하여 100g을 정량 후 80% 에탄올을 가하여 30분 동안 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다. 지름 185mm 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압여과 하였다. 그 후 감압농축기(Eyela, Japan)를 사용하여 농축한 다음, 동결건조기(Freezedryer, Matsushita, Japan)로 동결건조하여 분말을 얻어 DMSO에 녹여 사용하였다.
대상 데이터
- Western blot 분석에 사용된 NF-κB, p-I-κB, lamine B 항체는 Santacruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하였으며, α-tubulin 항체는 Sigma aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Anti-human IL-6/IL-8 항체, biotinylated anti-human IL-6/IL-8 항체, 재조합 human IL-6/IL-8 단백질은 BD Biosciences(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- Anti-human TNF-α 항체, biotinylated anti-human TNF-α항체, 그리고 재조합 human TNF-α는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), A23187은 Sigma aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, MTS는 promega(Madison, UI, USA)에서 구입하였다.
- 세포배양액인 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)은 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 魚腥草 抽出物(HCT)은 옴니허브(Korea)에서 魚腥草를 구입하여 100g을 정량 후 80% 에탄올을 가하여 30분 동안 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다. 지름 185mm 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압여과 하였다.
- 칼슘 ionophore인 A23187는 세포내 칼슘의 농도를 증가시켜 비만세포의 활성화를 통해 탈과립을 유도하며, PMA는 protein kinase C에 직접 작용하는 분열 촉진제로서 비만세포를 활성화시켜 세포활성물질을 분비하게 한다. 하지만, PMA 단독으로는 비만세포의 탈과립이 나타나지 않으므로, A23187과 PMA를 모두 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 결과는 측정값의 평균±표준편차값을 기준으로 통계분석하였다.
- 본 실험에서 결과는 측정값의 평균±표준편차값을 기준으로 통계분석하였다. 실험 결과값의 통계적 분석을 위해 independent t-tests를 사용하여 각 실험군간의 유의성을 분석하였고, 그 유의수준은 p〈0.05로 하였다.
이론/모형
- The NF-κB activity was examined with a luciferase assay .
- 다음으로는 NF-κB의 프로모터 활성에 대해 알아보기 위해 luciferase assay를 수행하였다.
- 배양된 HMC-1세포의 배지내에서 TNF-α, IL-6, 그리고 IL-8을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)방법을 이용하여 실험하였다.
- 2 mM PMSF가 포함된 버퍼 40 ㎕를 넣고 30분간 반응시킨 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻는다. 분리하여 얻은 세포질과 핵 단백질은 Bradford assay(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) 방법을 이용하여 정량하여 사용하였다.
- 비만세포인 HMC-1에서 HCT에 의한 PMA와 A23187로 유도된 TNF-α의 억제효과를 알아보기 위해 ELISA 및 RT-PCR 방법을 이용하였다.
- 비만세포인 HMC-1에서 HCT의 PMA와 A23187로 유도된 IL-8의 억제효과를 알아보기 위해 ELISA 및 RT-PCR방법을 이용하였다. 그 결과 IL-8의 분비량에는 크게 영향이 없는 것을 알 수 있었다.
-
그리고 난 후 4℃, 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하여 총 단백질을 얻었다. 얻은 총 단백질을 Bradford assay(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) 방법을 이용하여 정량한 다음 40 ㎍의 단백질을 15% acrylamide gel에 전기영동하였다. 이것을 nitrocellulose membrane (Schleicher&Schuell
성능/효과
- HCT는 I-κB의 인산화를 억제함으로써 NF-κB의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 1. HCT는 HMC-1세포에 대한 실험에서 히스타민 분비와 세포증식에 별다른 영향을 주지 않았다.
- 2. HMC-1세포에서 HCT의 TNF-α에 대한 억제효과에 대한 실험에서는 농도에 비례하여 그 효과가 컸으며, 특히, 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 60% 이상의 높은 저해율을 보였고 mRNA 발현에도 높은 억제효과가 있었다.
- 3. HMC-1세포에서 HCT의 IL-6 억제효과에 대한 실험에서도 농도에 비례하여 그 효과가 컸으며, 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 55% 정도의 저해율이 관찰되었다. mRNA 발현율에서도 농도의존적으로 억제현상을 나타내었다.
- 4. HMC-1세포에서 HCT의 IL-8 억제효과실험에서는 IL-8의 분비량에는 크게 영향이 없었으며, HCT 0.2 ㎎/㎖의 농도에서만 약간의 억제율을 보였다. 이에 반해 IL-8의 mRNA는 농도의존적으로 IL-8의 mRNA 발현이 감소되어 나타나는 것을 알 수 있었다.
- 5. NF-κB와 NF-κB 억제자인 I-κB의 단백질 발현 정도를 관찰하는 실험에서 HCT는 농도의존적으로 핵 내 NF-κB 단백질이 뚜렷하게 감소되어 있음을 확인하였다.
- . 결과적으로 IgE에 의한 비만세포의 활성화는 여러 가지 즉시형 과민증 반응에 주요한 메카니즘을 보이며, 반면 다양한 T 세포 소집단에서는 지연형 과민증 반응에 주요한 효과를 나타낸다31).
- HCT가 비만세포(HMC-1)에서 histamine분비 및 세포증식에 미치는 효과에 대해 실험하였다. 그 결과 HCT는 histamine분비 및 세포증식면에서 농도별로 별다른 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 그 결과 HCT의 0.1 ㎎/㎖와 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 각각 0.349±0.012 ng/㎖과 0.214±0.029 ng/㎖의 농도를 나타내며 PMA plus A23187로 유도된 IL-6의 생성량인 0.475±0.006 ng/㎖보다 27%, 55% 정도 감소하여 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 3A).
- 그 결과 HCT의 농도 의존적으로 TNF-α의 생성율이 현저히 감소되어 있었다.
- 그 결과 IL-8의 분비량에는 크게 영향이 없는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과 TNF-α의 경우 HCT 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 현저히 감소하였으며(Fig. 2), IL-6의 경우에서는 0.1 ㎎/㎖과 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 농도의존적으로 그 분비량이 억제되는 것이 보였으며, A23187과 PMA 단독으로 유도된 HMC-1세포 배양액의 IL-6 생성량과 0.2 ㎎/㎖의 농도에서의 HMC-1세포 배양액의 IL-6 생성량을 비교하였을때 50%의 높은 저해율을 나타내었다(Fig. 3).
- 그 결과 핵안에 존재하는 NF-κB는 PMA와 A23187로 유도하였을 때 loading control인 핵막을 구성하는 성분인 laminB와 비교하여 현저히 증가한 반면, HCT를 0.05 ㎎/㎖부터 0.2 ㎎/㎖의 농도로 처리하였을 때 농도의존적으로 핵 내 NF-κB 단백질이 뚜렷하게 감소되어 있음을 확인하였다.
- 먼저 HCT의 농도를 다르게 하여 HMC-1세포를 처리한 후 A23187과 PMA로 세포의 활성을 유도하여 히스타민 분비량을 측정한 실험과 세포 생존율을 비교한 실험에서, HCT는 히스타민 분비와 세포증식에 별다른 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다.
- 이러한 실험결과로 미루어 보아 HCT가 염증매개물질인 TNF-α, IL-6의 생성을 억제함으로써 염증치료에 효능이 있을 것으로 사료된다.
- 4A). 이에 반해 IL-8의 mRNA 수준을 조사한 결과 HCT 0.05에서 0.2 ㎎/㎖의 모든농도에서 농도의존적으로 IL-8의 mRNA 발현이 감소되어 나타나는 것을 알 수 있었다. 특히, 0.
후속연구
- 이러한 결과를 통해 HCT가 탈과립된 비만세포에서 I-κB/NF-κB 경로의 발현을 조절함으로써 이에 수반되는 염증매개물질인 TNF-α, IL-6, IL-8의 생성을 억제하는 효과가 있어, 어성초를 이용한 염증성 치료에 중요한 단서로 활용될 수 있으리라 생각된다.
- 이상의 연구 결과에서, 그 동안 임상적으로 확인된 魚腥草의 항염증 작용을 분자생물학적 차원에서도 확인할 수 있었으며, 앞으로 魚腥草를 항염증 치료에 보다 폭넓게 활용할 수 있는 가능성을 보여주었다고 사료된다.
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