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문제 정의
- 심리적 스트레스에 관한 실험연구는 아직 접하지 못하였다. 따라서 본 연구에서는 半夏를 재료로 하여 그 추출물의 투여가 스트레스의 해소에도 효과적으로 작용하는지 확인하기 위하여 스트레스와 관련된 몇 가지 지표 및 스트레스로 인한 생체의 변조를 개선할 수 있는지를 살펴보았다.
- 심리적 스트레스 부하 장치에서 일정 시간 동안 스트레스를 야기 시킨 생쥐에게 半夏 추출물을 경구투여한 후 스트레스와 관련 있는 지표 및 microarray 분석법을 이용하여 사회 . 심리적 스트레스가 뇌 조직에 미치는 영향을 정량적으로 측정하여 의미 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 심리적 스트레스에 대한효능을 연구 보고하였으나, 半夏의 항 스트레스 효과에 관한 실험은 찾아보기 어려웠다. 이에 저자는 祛痰之劑의 대표적 약물인 半夏 에 대해 실험하였다. 化痰止嘔, 燥濕降逆, 消 痞散結 등의 효능이 있는 半夏는 痰多喘咳, 痰飮眩悸, 痰厥頭痛, 嘔吐反胃, 胸脘痞悶, 梅 核氣 등을 치료하는 것으로 알려져 있다10).
- 인간 유전자의 분석이 최근 마무리됨으로써 탄생하게 된 Microarray 기술을 이용한 대량의 유전자분석법은 종양을 비롯한 수많은 질환에서 유전자 발현의 변화를 찾아내는데 큰 기여를 하고 있는데32), 현재까지는 주로 약물에 대한 신경세포를 이용한 뇌신경학적 연구가 많이 이루어졌으나33-34) 본 실험에서는 정신적 자극이 뇌신경세포에 미치는 영향을 정량적으로 측정해보았으며 의미 있는 결과를 얻었다.
제안 방법
- Probe 준비 와 hybridizatione 3DNA array detection system(Genisphere, PA)을 이용하였다. 10ug 의 분리된 RNA를 이용하여 cy3 또는 cy5 형광 물질이 부착된 cDNA로 변환 시킨 뒤 chip과 hybridization 시켰다. 공통 reference 로 사용할 정상 mouse 뇌로부터 얻은 RNA 는 cy3 UTP를 이용하였으며, 각 실험군으로부터 얻은 RNA는 cy5-UTP를 이용하여 형광 부착 하였다.
- 각 실험군의 microarray 실험 조건은 Table I 과 같다. Hybridization 이 종료되면, 세척 후 GenePix 4000B(Axon Instruments, Union City, CA) 레 이 저 스캐 너를 이용하여 스캔 image를 얻은 뒤, GenePix Pro 3.0 software(Axon Instruments, Union City, CA) 를 통해 chip 의 결과를 수치화 하였다.
- Microarray의 실험적 오차를 최소화하기 위하여 수치화된 RNA의 발현 비율을 변환시키는 표준화 작업을 수행하였다. 사용한 표준화 작업 방법은 Lowess 회귀 분석 방법으로 전체 RNA 발현 비율을 균일하게 유지하였다.
- 부착되어 있다. Probe 준비 와 hybridizatione 3DNA array detection system(Genisphere, PA)을 이용하였다. 10ug 의 분리된 RNA를 이용하여 cy3 또는 cy5 형광 물질이 부착된 cDNA로 변환 시킨 뒤 chip과 hybridization 시켰다.
- 半夏 50 g을 증류수 1500 ml와 함께 전기 약탕기 (DWP-1800T, 대웅, 한국)로 100C 에서 2 시간 전탕한 후 추출액을 부직포를 이용하여 찌꺼기를 제거한 후 동결 건조기 (SFDSM06, 삼원, 한국)를 이용하여 6.6 g의 건조 추출물을 얻었다. 이를 냉동실에 신선하게 보관하였다가 실험 직전에 필요한 농도로 증류수에 녹여 시료로 사용하였다.
- 半夏 추출물을 실험동물에 100 ㎎/㎏/day 용량으로 5일 동안 경구 투여한 후 elevated plus-maze(Fig. 2)를 이용하여 항 불안 효과를 측정하였다. 최종 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였다.
- 노르아드레 날린 의형 광물질은 형광광도계를 사용하여 excitation 380 nm, emission 495 nm에서 측정하였다. 노르아드레날린 표준물질은 100 /ml 농도로 준비하여 표준 검량선에 의거, 노르아드레날린의 분비량(ng/g brain)을 정량하였다.
- 뇌 조직의 total RNA는 Qiagen 키트를 사용하여 분리하였으며, 분리된 RNA의 quality는 아가로스 젤 전기영동상의 28S/18S RNA의 존재유무 및 비율을 이용하여 측정하여 연구의 진행에 적절함을 확인 후 실험에 사용하였다.
- 생쥐를 ether로 가볍게 마취시키고 3 ml 용량의 일회용 주사기(삼우, 한국)로 혈액을 복부 대정맥으로부터 1.0 ml 취하여 실온에 30 분 방치한 후 냉장원심분리기(VS6000CFN, Vision, 한국)로 1300xg로 20 분간 원심 분리시켜 상층의 혈청을 얻었다. 혈청 중 코티코스테론 함량은 Zenker와 Bernstein 방법13) 에준해 측정하였다.
- 신체적 스트레스군은 하루 1 시간의 전기적 충격을 부하하였고, 정상군은 아무 처치도 안하였으며, 대조군은 신체적 스트레스 군을 옆에서 지켜보는 것으로써 사회 - 심리적 스트레스를 부하하면서 증류수를 투여하였고, 실험군은 사회 . 심리적 스트레스를 부하하면서 半夏 추출물을 100 ㎎/㎏로 투여하였다.
- 이후의 모든 분석은 표준화된 수치를 이용하여 수행하였다. 신호가 미약한 bad spot을 제거하기 위하여 모든 신호의 강도는 배경의 신호보다 최소 1.4배 이상인 spot 만을 사용하였다. 유전자의 패턴분석은 순차적클러스트링 기법을 이용하였으며 Cluster와 Treeview(M.
- 실험동물은 신체적 스트레스군, 정상군, 대조군 및 실험군의 4 개 그룹으로 나누었다. 신체적 스트레스군은 하루 1 시간의 전기적 충격을 부하하였고, 정상군은 아무 처치도 안하였으며, 대조군은 신체적 스트레스 군을 옆에서 지켜보는 것으로써 사회 - 심리적 스트레스를 부하하면서 증류수를 투여하였고, 실험군은 사회 .
- 실험을 시작할 때 생쥐는 maze의 open arm에 머리를 밖으로 향하게 놓은 다음 maze 를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 생쥐가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 측정하였다.
- 심리적 스트레스를 대신할 수 있도록 고안 - 제작된 communication box를 사용하여 ICR 계 생쥐를 실험동물로 하여 사회 . 심리적 스트레스 상태를 유발한 다음 半夏 추출물을 실험군에 투여하여 스트레스의 해소에 어느 정도 영향을 미치는가를 평가하였다.
- 동물 실험을 통해서도 사람의 일상적인 사회 . 심리적 스트레스를 대신할 수 있도록 고안 - 제작된 communication box를 사용하여 ICR 계 생쥐를 실험동물로 하여 사회 . 심리적 스트레스 상태를 유발한 다음 半夏 추출물을 실험군에 투여하여 스트레스의 해소에 어느 정도 영향을 미치는가를 평가하였다.
- 심리적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여 사회 . 심리적 스트레스를 부하하면서 半夏 추출물을 100 ㎎/㎏로 5 일간 투여한 후 스트레스 및 이로 인한 병리적 지표들을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 신체적 스트레스군은 하루 1 시간의 전기적 충격을 부하하였고, 정상군은 아무 처치도 안하였으며, 대조군은 신체적 스트레스 군을 옆에서 지켜보는 것으로써 사회 - 심리적 스트레스를 부하하면서 증류수를 투여하였고, 실험군은 사회 . 심리적 스트레스를 부하하면서 半夏 추출물을 100 ㎎/㎏로 투여하였다. 투여 시기와 방법은 각각 1일 1 회 5 일간 스트레스 부하 30 분 전에 경구 투여하였다.
- 약물 투여가 종료된 후 항 불안 효과의 측정은 합판으로 제작된 elevated plus-maze 를 이용하였다. 이 장치는 바닥에서 50 cm 높이에 설치된 십자형 미로로서, 길이 50 cm 폭 10 cm의 4개의 통로 가운데 마주 보는 2 개는 개방되어 있고, 크기가 동일한 다른 2개의 통로는 높이 40 cm의 벽으로 둘러싸여 있다.
- 유사도가 높은 유전자 군끼리 서로 뭉치도록 하는 순차적 클러스터링 기법을 이용하였다. 적색은 발현이 증가된 유전자를, 청색은 발현이 감소된 유전자를 나타내며, 그 색의 강도는 발현비율과 비례한다.
- 사용한 표준화 작업 방법은 Lowess 회귀 분석 방법으로 전체 RNA 발현 비율을 균일하게 유지하였다. 이후의 모든 분석은 표준화된 수치를 이용하여 수행하였다. 신호가 미약한 bad spot을 제거하기 위하여 모든 신호의 강도는 배경의 신호보다 최소 1.
- 2)를 이용하여 항 불안 효과를 측정하였다. 최종 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였다. 대조군은 증류수를 경구투여 하였으며 각 군은 10 마리 내외로 하였다.
- 심리적 스트레스를 부하하면서 半夏 추출물을 100 ㎎/㎏로 투여하였다. 투여 시기와 방법은 각각 1일 1 회 5 일간 스트레스 부하 30 분 전에 경구 투여하였다.
- 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 생쥐가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 측정하였다.
대상 데이터
- Sociopsychological mice were placed in the eight solid areas(nonfoot shock compartment). Foot shocks were delivered in shaded areas.
- 4 : 1)을 가하고 진탕한 뒤, 800xg에서 5 분간 원심분리하고 chloroform 층을 제거하고 잔류액을 2 시간 동안 실온에방치한 다음 형광광도계를 사용하여 excitation 470 nm, emission 520 nm에서 측정하였다. 검량선은 표준 코티코스테론을 99% 에탄올에 용해시켜 표준 용액으로 사용하였다.
- 10ug 의 분리된 RNA를 이용하여 cy3 또는 cy5 형광 물질이 부착된 cDNA로 변환 시킨 뒤 chip과 hybridization 시켰다. 공통 reference 로 사용할 정상 mouse 뇌로부터 얻은 RNA 는 cy3 UTP를 이용하였으며, 각 실험군으로부터 얻은 RNA는 cy5-UTP를 이용하여 형광 부착 하였다. 각 실험군의 microarray 실험 조건은 Table I 과 같다.
- 최종 약물 투여는 실험 시작 1 시간 전에 투여가 종료되도록 하였다. 대조군은 증류수를 경구투여 하였으며 각 군은 10 마리 내외로 하였다.
- 동물은 체중 20±2 g의 ICR 계 수컷 생쥐를 대한실험동물(대한실험동물, 한국)에서 구입하여 본 대학 동물 사육실에서 고형사료 (삼양사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 2 주일 이상 실험실 환경(22℃, 12 시간 간격 조명)에 적응시킨 후 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 半夏는 동신대학교 부속 순천 한방 병원에서 사용하고 있는 제품을 구입하여 엄선한 것을 사용하였다.
- 실험에 사용한 microarray는 Agilent사에서제조한 Mouse 4_Plex chip으로 약 45, 000 oligo-nucleotide가 부착되어 있다. Probe 준비 와 hybridizatione 3DNA array detection system(Genisphere, PA)을 이용하였다.
데이터처리
- )를 이용하였다. 실험 성적은 평균士표준오차(mean士S.E.) 로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 student's f-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균士표준오차(mean士S.
이론/모형
- 뇌 세포에서 노르아드레날린의 분비는 Kohno 의 방법14)에 따라 측정하였다. 뇌 조직 중 dorsal cortex 쪽을 분리하여 0.
- 사용한 표준화 작업 방법은 Lowess 회귀 분석 방법으로 전체 RNA 발현 비율을 균일하게 유지하였다. 이후의 모든 분석은 표준화된 수치를 이용하여 수행하였다.
- 4배 이상인 spot 만을 사용하였다. 유전자의 패턴분석은 순차적클러스트링 기법을 이용하였으며 Cluster와 Treeview(M.B. Eisen, http://rana.lbl.gov) 프로그램을 사용하였다.
- 혈청 내 지질 과산화물 함량은 Uchiyama 와 Mihara의 방법15)에 준하여 측정하였다.
- 0 ml 취하여 실온에 30 분 방치한 후 냉장원심분리기(VS6000CFN, Vision, 한국)로 1300xg로 20 분간 원심 분리시켜 상층의 혈청을 얻었다. 혈청 중 코티코스테론 함량은 Zenker와 Bernstein 방법13) 에준해 측정하였다. 즉 혈청 0.
성능/효과
- 1. 半夏 추출물 투여로 혈청 중 코티코스테론이 유의하지 않지만 감소의 경향을 보였다.
- 2. 半夏 추출물 투여로 뇌의 dorsal cortex 부분의 노르아드레날린 함량은 유의하게 증가하였다.
- 3. 半夏 추출물 투여로 혈청 내 지질 과산화물의 함량은 유의하지 않지만 감소의 경향을 보였다.
- 4. 半夏 주출물 투여로 elevated plus-maze 에서 open arm에 머무는 시간이 실험군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 그러나 open arm과 close-arm 과의 이동 횟수에는 유의한 변화가 없었다.
- Elevated plus-maze를 이용한 반하 추출물의 항 불안 효과를 관찰한 결과 open arm에서 머무는 시간이 신체적 스트레스군, 정상군, 대조군 및 실험군에서 각각 71.7±4.5 초, 132.7±7.4 초, 59.7±7.1 초 및 101.7±5.6 초로 나타나 대조군의 경우 정상군에 비해 유의한 감소를 보였으며, 실험군에서는 다시 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 6). Elevated plus-maze를 이용하여 open arm 과 closed arm 사이의 이동 횟수를 5 분 동안 측정한 결과 신체적 스트레스군, 정상군, 대조군 및 실험군에서 각각 12.
- 추출물투여가 혈청 내 지질 과산화물 생성량에 영향을 미치는가를 조사하였는데, 대조군과 실험군과의 차이가 유의하지 않았으며 다만 감소의 경향을 보였다(Fig. 5).
- 대조군에서 발현이 증가된유전자의 수는 89개로 크게 증가하였으며, 실험군에서는 107개로 더욱 증가하였다. 개별 유전자의 종류를 비교하여 보면, 신체적 스트레스 군에서 발현이 감소된 유전자 17개 중에서 대조군에서는 4개만이 여전히 발현이 감소되어 있고, 실험군에서도 4개만이 발현이 감소되어 있었다. 신체적 스트레스 군에서 발현이 증가한 유전자 32개의 경우, 대조군과 실험군에서 전부 혹은 대부분의 유전자 발현이 정상으로 회복되었다(Table II).
- 사람이 스트레스를 받으면 신경 전달 물질이나 일부 호르몬의 분비에 이상을 가져오는 것으로 알려져 있으며28七 특히 노르아드레날린이란 호르몬이 대뇌 dorsal cortex, hypothalamus 등에서 분비가 억제되는 것으로 보고되고 있다쯔) 또한 시행방법에 있어 실험 개체에 shock을 주면서 이를 실험 개체가 피할 수 없도록 조작된 uncontrollable군에서는 대뇌 노르아드레날린의 수준이 감소되게 되며, 이는 노르아드레날린의 이용과 요구가 합성을 능가하기 때문인 것으로 설명되고 있다30). 노르아드레날린의 분비량에 미치는 半夏 추출물의 영향을 분석한 결과 대조군의 노르아드레날린 분비량에 비해 실험군에서 유의하게 증가하여 半夏의 항 stress 효과 가능성을 보여주었다(Fig. 4).
- 발현이 2 배 이상 증가된 유전자를 기준으로 보면, 신체적 스트레스군에서 32개의 유전자가 발현이 증가하였다. 대조군에서 발현이 증가된유전자의 수는 89개로 크게 증가하였으며, 실험군에서는 107개로 더욱 증가하였다. 개별 유전자의 종류를 비교하여 보면, 신체적 스트레스 군에서 발현이 감소된 유전자 17개 중에서 대조군에서는 4개만이 여전히 발현이 감소되어 있고, 실험군에서도 4개만이 발현이 감소되어 있었다.
- 개별 유전자 수의 분포를 보면, 신체적 스트레스에 의해 발현이 감소한 유전자의 수는, 대조군 및 실험군에서도 거의 비슷한 개수의 유전자에서 발현이 감소되어 있다. 반면 신체적 스트레스에 의해 발현이 증가된 유전자 수는 대조군에서 약 3 배가량 그 수가 증가하였으며, 실험군에서 더욱 증가하는 결과를 확인할 수 있다. 이는 신체적 스트레스와 사회 .
- 실험군에서의 발현이 감소된 유전자의 수는 19개로 이전과 마찬가지로 유의한 차이를 보이지 않았다.발현이 2 배 이상 증가된 유전자를 기준으로 보면, 신체적 스트레스군에서 32개의 유전자가 발현이 증가하였다. 대조군에서 발현이 증가된유전자의 수는 89개로 크게 증가하였으며, 실험군에서는 107개로 더욱 증가하였다.
- 쥐는 본능적으로 밝은 곳에서 두려움을 느끼므로 open arm에서 머무르는 시간이 길수록 불안에 대한 내성이 있다고 할 수 있다.본 실험에서는 실험군에서 대조군에 비해 유의한 증가를 보여 항 불안효과에 대한 가능성도 보여주었다(Fig. 6).
- 신체적 스트레스군, 정상군, 대조군 및 실험군에서의 수치는 각각 75.2+8.3 ug/g brain, 206.3+13.6 ug/g brain, 130.7+9.6 ug/g brain 및 173.3+5.8 ug/g brain으로 나타나 정상군에 비해 대조군에서의 수치가 유의하게 감소하였으며, 半夏 추출물을 투여한 실험군에서는 노르아드레날린 분비량이 대조군에 비해 다시 유의하게 증가하였다(Fig. 4).
- 신체적 스트레스군/ 정상군/ 대조군 및 실험군에서 각각 3.95±0.11 pmole MDA/mg protein, 3.17+0.16 pmole MDA/mg protein, 3.73+0.12 pmole MDA/ mg protein 및 3.42+0.11 pmole MDA/mg protein으로 나타나 대조군의 경우 정상군에 비해 유의한 증가를 보였다. 그러나 실험군에서는 대조군과의 유의한 차이가 나타나지 않았으며 다만 감소의 경향을 보였다(Fig.
- 신체적 스트레스군에서의 경우 646.3+18.4 ng/ml 이고, 정상군에서의 수치가 164.3+16.3 ng/ml 인데 비해 대조군에서는 387.5+52.1 ng/ml 으로 유의하게 증가하였으며, 이에 비해 실험군에서는 304.33+24.04 ng/ml로 나타나 대조군에 비하여 실험군에서 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 3).
- 개별 유전자의 종류를 추적한 결과에서도 비슷한 결론을 얻을 수 있다. 신체적 스트레스에 의해 발현이 증가 혹은 감소된유전자들은 대조군과 실험군에서는 대부분 정상 수준으로 회복되어 있음을 확인할 수 있다. 즉 사회 .
- 증가된다27). 실험에서 신체적 스트레스 군은 수치가 크게 증가하였고, 대조군은 정상군보다 증가하였으며, 실험군은 대조군에 비해 감소하였으나 유의하지는 않았다(Fig. 3). 사람이 스트레스를 받으면 신경 전달 물질이나 일부 호르몬의 분비에 이상을 가져오는 것으로 알려져 있으며28七 특히 노르아드레날린이란 호르몬이 대뇌 dorsal cortex, hypothalamus 등에서 분비가 억제되는 것으로 보고되고 있다쯔) 또한 시행방법에 있어 실험 개체에 shock을 주면서 이를 실험 개체가 피할 수 없도록 조작된 uncontrollable군에서는 대뇌 노르아드레날린의 수준이 감소되게 되며, 이는 노르아드레날린의 이용과 요구가 합성을 능가하기 때문인 것으로 설명되고 있다30).
- 심리적 스트레스가 부하된 5일 동안 半夏 추출물을 함께 투여하면 그 결과로 스트레스를 효과적으로 해소할 수 있다는 것을 알 수 있으며 아울러 스트레스로 인해 발생하는 여러 병리적인 지표들의 증가도 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. Microarray 상에서는 신체적 스트레스에 관련된 유전자와 정신적 스트레스와 관련된 유전자 사이에 공통점이 크지 않다는 것을 알 수 있었으며 앞으로 半夏의이러한 작용에 어떠한 기전들이 관여하는지 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 심리적 스트레스에 관련된 유전자와 신체적 스트레스에 관련된 유전자 사이에는 공통점이 크지 않다는 결론을 내릴 수 있었으며, 半夏 추출물 투여시 사회.심리적 스트레스와 관련된 유전자들의 분포에 변화가 있지만 정상수준으로 회복시키는 수준은 아닌 것으로 판단되었다.
- 심리적 스트레스 유발이 뇌세포의 전체 유전자 발현에는 거의 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다. 유전자의 발현 패턴을 본 결과, 각각의 실험군에서 유전자의 발현 정도가 유사함을 확인할 수 있었고, 특히 발현이 증가한 유전자의 수가 발현이 감소한 유전자의 수보다 많음을 확인할 수 있다. 이런 결과는 Table Ⅱ 의 유전자 수의 분포와 일치하는 것으로써, 각 실험군에서 유전자 발현의 비대칭성이 형성 되어 있다는 것을 의미한다.
후속연구
- 심리적 스트레스가 부하된 5일 동안 半夏 추출물을 함께 투여하면 그 결과로 스트레스를 효과적으로 해소할 수 있다는 것을 알 수 있으며 아울러 스트레스로 인해 발생하는 여러 병리적인 지표들의 증가도 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. Microarray 상에서는 신체적 스트레스에 관련된 유전자와 정신적 스트레스와 관련된 유전자 사이에 공통점이 크지 않다는 것을 알 수 있었으며 앞으로 半夏의이러한 작용에 어떠한 기전들이 관여하는지 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이런 결과는 Table Ⅱ 의 유전자 수의 분포와 일치하는 것으로써, 각 실험군에서 유전자 발현의 비대칭성이 형성 되어 있다는 것을 의미한다. 이런 발현도의 비대칭성은 각 실험군에서 일어나는 유전자의 발현조절이 어떤 특정한 패턴을 통해 이루어지고 있다는 것으로 추정되는데, 차후 이 부분에 대한 자세한 연구가 진행되어야 할 것이다. 개별 유전자 수의 분포를 보면, 신체적 스트레스에 의해 발현이 감소한 유전자의 수는, 대조군 및 실험군에서도 거의 비슷한 개수의 유전자에서 발현이 감소되어 있다.
- 이상의 내용으로 미루어 半夏 추출물이 스트레스를 효과적으로 해소시킬 뿐만 아니라 스트레스로 인한 생체의 각종 질병 발생 억제에도 작용함을 알 수 있어 불안, 긴장, 불면, 두통 등의 스트레스 관련 질환에 치료약물로 개발 가능할 것으로 생각되며, 추후더 체계적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
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