김치에서 분리한 세균인 Lactobacillus plantarum YK-9의 식중독 원인세균에 대한 항균활성 및 특성 Antibacterial Activity against Food-poisoning Causing Bacteria and Characterization of Lactobacillus plantarum YK-9 Isolated from Kimchi원문보기
본 연구는 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum YK-9의 다양한 특성을 조사하기 위하여 실시되었다. 형태학적 관찰 및 생리화학적 특성에 대하여 조사하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 Lactobacillus plantarum로 확인되었고, L. plantarum YK-9으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [FJ669130]로 등재하였다. 배양 시간에 따른 L. plantarum YK-9의 생장과 pH의 변화를 조사하였으며, 대사산물로서 유기산 (lactic acid와 acetic acid)의 생성은 HPLC를 통하여 확인하였다. 유기산의 생성은 L. plantarum YK-9의 생장에 따라 증가 하는 것을 확인하였다. 초기 pH 7.0은 배양 기간동안 3.6으로 감소하였고, 배양 72시간이 지난 후 생성된 lactic acid와 acetic acid의 농도는 각각 588.7 mM과 255.5 mM이었다. 식중독 원인균인 S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes, E. coli, E. faecalis, S. enteritidis에 대하여 20배로 농축된 YK-9 배양 상등액에 처리하여 항균력을 조사하였으며, 실험에 사용된 6가지 식중독 원인세균 모두에 대한 항균효과가 있는 것이 관찰되었고, 이는 유기산 생성에 기인하는 것으로 나타났다.
본 연구는 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum YK-9의 다양한 특성을 조사하기 위하여 실시되었다. 형태학적 관찰 및 생리화학적 특성에 대하여 조사하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 Lactobacillus plantarum로 확인되었고, L. plantarum YK-9으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [FJ669130]로 등재하였다. 배양 시간에 따른 L. plantarum YK-9의 생장과 pH의 변화를 조사하였으며, 대사산물로서 유기산 (lactic acid와 acetic acid)의 생성은 HPLC를 통하여 확인하였다. 유기산의 생성은 L. plantarum YK-9의 생장에 따라 증가 하는 것을 확인하였다. 초기 pH 7.0은 배양 기간동안 3.6으로 감소하였고, 배양 72시간이 지난 후 생성된 lactic acid와 acetic acid의 농도는 각각 588.7 mM과 255.5 mM이었다. 식중독 원인균인 S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes, E. coli, E. faecalis, S. enteritidis에 대하여 20배로 농축된 YK-9 배양 상등액에 처리하여 항균력을 조사하였으며, 실험에 사용된 6가지 식중독 원인세균 모두에 대한 항균효과가 있는 것이 관찰되었고, 이는 유기산 생성에 기인하는 것으로 나타났다.
The purpose of this work was to investigate the antibacterial activity of Lactobacillus plantarum YK-9 isolated from fermented Kimchi. Morphological and biochemical characteristics of L. plantarum YK-9 were examined. Phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing was performed to identify the strai...
The purpose of this work was to investigate the antibacterial activity of Lactobacillus plantarum YK-9 isolated from fermented Kimchi. Morphological and biochemical characteristics of L. plantarum YK-9 were examined. Phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing was performed to identify the strain, and the strain could be assigned to Lactobacillus plantarum, designated as L. plantarum YK-9. The strain was registered in GenBank as [FJ669130]. During the incubation period of L. plantarum YK-9, the changes of bacterial growth and residual organic acids were monitored. HPLC was used to confirm the organic acids produced in the cultures as metabolites. L. plantarum YK-9 produced both lactic acid and acetic acid, which were responsible for the pH decrease during growth. Initial pH 7.0 of the cultures decreased to 3.6 at the incubation after 72 hours, and concentrations of lactic acid and acetic acid increased to approximately 588.7 mM and 255.5 mM, respectively. The antibacterial activities against food-poisoning causing bacteria were examined with 20-fold concentrated culture supernatants from L. plantarum YK-9, and the antibacterial effects were clearly observed against all the bacteria tested in this work.
The purpose of this work was to investigate the antibacterial activity of Lactobacillus plantarum YK-9 isolated from fermented Kimchi. Morphological and biochemical characteristics of L. plantarum YK-9 were examined. Phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing was performed to identify the strain, and the strain could be assigned to Lactobacillus plantarum, designated as L. plantarum YK-9. The strain was registered in GenBank as [FJ669130]. During the incubation period of L. plantarum YK-9, the changes of bacterial growth and residual organic acids were monitored. HPLC was used to confirm the organic acids produced in the cultures as metabolites. L. plantarum YK-9 produced both lactic acid and acetic acid, which were responsible for the pH decrease during growth. Initial pH 7.0 of the cultures decreased to 3.6 at the incubation after 72 hours, and concentrations of lactic acid and acetic acid increased to approximately 588.7 mM and 255.5 mM, respectively. The antibacterial activities against food-poisoning causing bacteria were examined with 20-fold concentrated culture supernatants from L. plantarum YK-9, and the antibacterial effects were clearly observed against all the bacteria tested in this work.
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문제 정의
본 연구는 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum YK-9의 다양한 특성을 조사하기 위하여 실시되었다. 형태학적 관찰 및 생리화학적 특성에 대하여 조사하였다.
형태학적 관찰 및 생리화학적 특성에 대하여 조사하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 Lactobacillus plantarumS.
제안 방법
0)로 희석한 1% osmium tetroxide를 균체가 잠길 정도로 첨가한 후, 1시간 동안 고정을 실시하였다. 13, 000 rpm에서 1분간 원심분리를 실시하여 균체를 회수하고, 준비된 다양한 농도 (50%, 60%, 70%, 80%, 95%)의 ethanol로 10분씩 연속적으로 탈수시켰다. 100% ethanol에 30분씩 2회 최종 탈수하고, 100% HMDS (hexamethyldisilazane) 에 20분 간 2회 반응시킨 후 slide 읺ass 위에 떨어뜨리고 공기 중에서 건조시켰다.
대상으로 정량분석하였다. Lactic acid와 acetic acid를 각각 1 : 1의 비율로 혼합하여 표준품을 만들었으며, 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 후 20 成 Hamilton syringe를 사용하여 HPLC injector 내에 주입하여 정 량분석을 위한 표준곡선을 작성하였다 배양액 내에 생성된 유기산을 정량하기 위하여 채취한 시료는 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 0.45 jum syringe filter로 여과하여 분석하였다(16).
MRS 액체 배지에 분리 세균인 YK-9를 접종하고 30℃ 에서 분당 160회로 회전하는 진탕배양기에 배양시키면서 세균의 생장과 배양 기간 중에 생산되는 유기산의 양을 12시간간격으로 측정하였다. 세균의 생장은 분광광도계 (UV/Vis Spectrophotometer, Jenway, UK)를 이용하여 파장 660 nm 에서의 흡광도를 측정하여 생장곡선을 작성하였다.
PCR의 수행조건은 denaturation (94 ℃, 30초), annealing (60 ℃, 30초), elongation (72 ℃, 45초) 단계를 33회 반복한 후, 72 ℃ 에서 15분동안 유지하였다. PCR에 의하여 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 다음 agarose gel extract kit (Intron, Korea)를 이용하여 gel상에서 회수하고, sequencing하여 1, 099 bp의 부분적인 염기서열을 결정하였으며, 이 결과를 GenBank database에 등록하였다(13).
16S rRNA PCR을 수행하였다. YK-9 균주로부터 genomic D* NA 추출하여 16S rRNA 유전자를 PCR을 통하여 증폭하였다 16S rRNA 유전자의 증폭을 위하여 8F와 1492R primer를 사용하였다 Genomic DNA> 주형으로 하여 PCR Premix (GenDEPOT, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 수행조건은 denaturation (94 ℃, 30초), annealing (60 ℃, 30초), elongation (72 ℃, 45초) 단계를 33회 반복한 후, 72 ℃ 에서 15분동안 유지하였다.
YK-9 균주의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rRNA PCR을 수행하였다. YK-9 균주로부터 genomic D* NA 추출하여 16S rRNA 유전자를 PCR을 통하여 증폭하였다 16S rRNA 유전자의 증폭을 위하여 8F와 1492R primer를 사용하였다 Genomic DNA> 주형으로 하여 PCR Premix (GenDEPOT, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
가정에서 담근 발효가 잘 된 김치로부터 발효에 관여하는 세균들을 농화 (enrichment)시켜, 6개의 세균을 분리하였다. 이들 세균 가운데 0.
002% BPB(bromophenol blue)가 첨가된 MRS 고체 평판 배지에 도말하고 30。。에서 24시간 배양하였다(12). 균주의 생육 과정에서 산을 형성하여 노란색을 띄는 균주를 선별하여 MRS 고체 평판 배지에 도말 평판법을 통한 순수배양으로 세균 YK-9를 분리하였다. 이 분리 세균 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하고 진탕배양기 (30℃, 160 rpm)에 배양유지시키면서 본 연구에 이용하였다.
김치에서 분리한 균주 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하고 세균의 생장과 배양기간 중의 pH 변화를 12시간 간격으로 측정하였다(Fig. 3). 분리 균주는 배양 이후부터 60시간까지 지속적으로 생장하였으며, 이와 관련하여 pH도 감소되었다.
염기서열 분석을 실시하였다. 또한 이 분리세균을 이용하여 식중독을 일으키는 여러가지 병원체에 대한 항균력을 조사하였으며, HPLC를 통하여 이 항균활성에 기여하는 물질을 확인하였다.
배양 상등액의 다른 병원성 세균에 대한 항균력을 조사하기 위하여 분리 세균 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃ 에서 48시간 동안 배양한 후 4, 000 rpm에서 10분간 원심분리흐卜고, 상등액을 취하여 0.2 ㎛ syringe filter로 여과하여 완전히 균을 제거하였다. 이 배양상등액을 동결건조기를 사용하여 20배로 농축하였다(17).
plantarum YK-9 으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [FJ66913이로등재하였다. 배양 시간에 따른 L. plantarum YK-9의 생장과 pH의 변화를 조사하였으며, 대사산물로서 유기산 (lactic acid와 acetic acid)의 생성은 HPLC를 통흐卜여 확인하였다. 유기산의 생성은 L.
본 연구에서는 김치의 발효에서 생성되는 젖산 세균을 분리하여, 여러가지 생화학적 특성 조사와 16S rRNA의 부분 염기서열 분석을 실시하였다. 또한 이 분리세균을 이용하여 식중독을 일으키는 여러가지 병원체에 대한 항균력을 조사하였으며, HPLC를 통하여 이 항균활성에 기여하는 물질을 확인하였다.
그람염색을 실시하여 위상차 현미경으로 관찰한 결과, 그람 양성으로 나타났다. 분리 세균 YK-9에 대한 여러가지 생화학적 특성조사를 실시하였다. 인돌(indole) 생성 시험에서는 음성반응을 나타내는 초록색의 고리를 형성하였으며, glucose를 발효하여 배지의 색이 노랗게 변했다.
HPLC에 의한 유기산 분석
분리 세균 YK-9에 의해 생성되는 유기산을 분석하기 위하여 HPLC를 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC system은 SPD-10A UV/Vis detector가 부착된 Shimazu사의 LC-10AT 제품을 사용하였으며, Supelco 사의 Supelcogel C-610H 컬럼 (300 mm 乂 7.
분리 세균의 세포 외부 형태를 알아보기 위하여 주사전자현미경을 이용한 세포의 관찰 실험을 하였다. 대수생장기인 배양액에서 원심분리하여 얻어진 균체에 100 mM phosphate buffer (pH 7.
분리된 세균인 YK-9을 고체 영양배지 (nutrient agar)에 도말하여 단일 집락의 형태를 관찰하였고, 그람염색 후 위상차현미경을 사용하여 세균의 형태학적 특성을 관찰하였다. 분리 세균의 생리 화학적 특성은 알려진 방법(14)에 의하여 실시흐卜였다.
HPLC에 의한 유기산 분석
분리세균인 YK-9의 배양 기간 동안 대사물질로서 배양액에서 생성되는 유기산을 분석하였다. 배양초기에는 거의 존재하지 않았던 유기산이 배양이 진행됨에 따라 YK-9 균주의 생장과 비례하여 생성되었다.
100% ethanol에 30분씩 2회 최종 탈수하고, 100% HMDS (hexamethyldisilazane) 에 20분 간 2회 반응시킨 후 slide 읺ass 위에 떨어뜨리고 공기 중에서 건조시켰다. 완전히 건조가 되면 sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 2 mA로 3 분간 gold coating흐卜 여 주사전자현미경 (Hitachi, Japan)으로 관찰하였다(15).
유기산은 분석용 표준품과 배양액으로부터 채취한 시료를 대상으로 정량분석하였다. Lactic acid와 acetic acid를 각각 1 : 1의 비율로 혼합하여 표준품을 만들었으며, 0.
균주의 생육 과정에서 산을 형성하여 노란색을 띄는 균주를 선별하여 MRS 고체 평판 배지에 도말 평판법을 통한 순수배양으로 세균 YK-9를 분리하였다. 이 분리 세균 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하고 진탕배양기 (30℃, 160 rpm)에 배양유지시키면서 본 연구에 이용하였다.
균주의 생육 과정에서 산을 형성하여 노란색을 띄는 균주를 선별하여 MRS 고체 평판 배지에 도말 평판법을 통한 순수배양으로 세균 YK-9를 분리하였다. 이 분리 세균 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하고 진탕배양기 (30℃, 160 rpm)에 배양유지시키면서 본 연구에 이용하였다.
대상세균들은 각각 액체 영양배지(nutrient broth)에 접종한 후 24시간 배양하여 사용하였다. 이들 세균배양액을 멸균된 면봉을 사용하여 각각 고체 영양배지 (nutrient agar)에 도말하paper disc를 올려놓은 후, 농축 배양상등액 20 以를 흡수시켜 37℃에서 24시간 배양시킨 후 disc 주변에 생성된 투명대의 크기를 측정하였다.
대상 데이터
HPLC를 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC system은 SPD-10A UV/Vis detector가 부착된 Shimazu사의 LC-10AT 제품을 사용하였으며, Supelco 사의 Supelcogel C-610H 컬럼 (300 mm 乂 7.8 mm, 입자크기 9 ㎛)을 이용하였다. Mobile phase는 0.
이용하여 확인하였다. 항균력을 조사하기 위해 식중독의 원인이 되는 세균으로 잘 알려진 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonella enteritidis 세균을 본 실험에 사용하였다(18-21). 대상세균들은 각각 액체 영양배지(nutrient broth)에 접종한 후 24시간 배양하여 사용하였다.
이론/모형
농축 배양상등액의 항균력은 plate diffusion assay 방법 (16)을 이용하여 확인하였다. 항균력을 조사하기 위해 식중독의 원인이 되는 세균으로 잘 알려진 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonella enteritidis 세균을 본 실험에 사용하였다(18-21).
분리 세균의 생리 화학적 특성은 알려진 방법(14)에 의하여 실시흐卜였다.
성능/효과
5 mM이 생성되었다 Ma 등(23)은 새우양^장에서 분리한 Lactobacillus sp. JK-8에서 배양기간 중에 192 mM lactic acid와 43.6 mM acetic acid를 생성하는 것으로 보고하였는데, 본 연구에서 얻어진 유기산 생산은 이와 비교하여 볼 때, 매우 탁월한 것임이 확인되었다.
인돌(indole) 생성 시험에서는 음성반응을 나타내는 초록색의 고리를 형성하였으며, glucose를 발효하여 배지의 색이 노랗게 변했다. Methyl red (MR) 시험에서는 양성을 나타내었으며, Voges-Proskauer (VP) 시험에서는 음성을 나타내었다 Gelatin과 녹말 분해 여부는 투명대가 형성되지 않았으므로 모두 음성임을 확인할 수 있었다. Oxidase와 catalase 시험의 결과도 모두 음성을 나타내었고, Simmon's citrate의 이용여부에서는 양성을 나타내었다.
4로 각각 감소시킨다고 보고한 바 있다. 본 연구에서 분리된 YK-9도 생장기간 중에 다량의 유기산을 생산하여 pH가 3.6으로 낮아지는 것으로 나타났다.
있다(13, 24). 본 연구에서는 다양한 식중독 감염의 원인이 되는 세균을 대상으로 하여 항균 활성을 확인한 결과, 그람양성이나 그람음성에 관계없이 모든 식중독 원인세균들에 대하여 뚜렷한 항균 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 우리나라의 대표적인 전통적 발효 식품인 김치가 식중독 예방에 매우 효과적일 것이라 사료된다.
3). 분리 균주는 배양 이후부터 60시간까지 지속적으로 생장하였으며, 이와 관련하여 pH도 감소되었다. 배양초기의 pH는 7.
분리 세균 YK-9의 항균력 확인은 plate diffusion assay 방법(17)을 이용하여 농축된 배양 상등액을 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coll, Enterococcus faecalis, Salmonella enteritidis 등의 6 가지 대상세균에 노출시켜 배양 24시간 후에 disc 주변에 형성되는 투명대를 통하여 항균 활성 여부를 확인하였다 본 연구에서 사용된 모든 대상에 대하여 항균 활성을 나타내었으며, 각 균주마다 항균 활성의 정도가 다르게 나타났다(Fig. 5). 본 논문에 그림으로 제시하지 않았지만, YK-9의 농축 배양 상등액의 pH를 중성으로 조절하여 대상 세균들에 대한항균력을 측정한 실험에서 pH가 조절된 농축 배양상등액에서는 아주 작은 크기의 투명대가 생성되거나 거의 형성되지 않았다.
16S rRNA 염기서열의 계통수 분석
분리균주인 YK-9의 phylogenetic tree를 작성하기 위하여, PCR을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 1099 bp의 부분적인 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 GenBank database에 [円66913이로 등록하였다. 이 균주는 Lactobacillus 속 (genus)에 속하는 Lactobacillus plantarume\ 99%의 유사성을 나타내었다.
분리된 세균의 세포 외부 형태를 주사전자현미경을 통하여 긴 막대형으로 관찰되었다(Fig. 2). 그람염색을 실시하여 위상차 현미경으로 관찰한 결과, 그람 양성으로 나타났다.
5 mM이었다. 식중독 원인균인 S. aureus, B. cereuse L. monocytogenese E. coli, E. faecalise S. 曲t아, itidis에 대하여 20배로 농축된 YK-9 배양 상등액에 처리하여 항균력을 조사하였으며, 실험에 사용된 6가지 식중독 원인세균 모두에 대한 항균효과가 있는 것이 관찰되었고, 이는 유기산 생성에 기인하는 것으로 나타났다.
이 균주는 Lactobacillus 속 (genus)에 속하는 Lactobacillus plantarume\ 99%의 유사성을 나타내었다. 얻어진 결과를 바탕으로 분리 세균을 L. plantarum YK-9으로 명 명하였다. 이 균주와 L.
plantarum YK-9의 생장과 pH의 변화를 조사하였으며, 대사산물로서 유기산 (lactic acid와 acetic acid)의 생성은 HPLC를 통흐卜여 확인하였다. 유기산의 생성은 L. plantarum YK-9의 생장에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 초기 pH 7.
[円66913이로 등록하였다. 이 균주는 Lactobacillus 속 (genus)에 속하는 Lactobacillus plantarume\ 99%의 유사성을 나타내었다. 얻어진 결과를 바탕으로 분리 세균을 L.
이들 세균 가운데 0.002% BPB (bromophenol blue)가 첨가된 MRS 배지에서 3회에 걸친 도말 평판법을 통한 순수배양으로 생장이 탁월한 세균인 YK-9을 분리하였다. 이 분리 세균 YK-9를 MRS 액체 배지에 접종하고 진탕배양기 (30℃, 160 rpm)에 배양 유지시키면서 본연구에 이용하였다.
16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 Lactobacillus plantarumS. 확인되었고, L. plantarum YK-9 으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [FJ66913이로등재하였다. 배양 시간에 따른 L.
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