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문제 정의
- , 우식유발균 억제에 대한 영향은 거의 논의되지 않았다. 따라서 본 논문에서는 국내 시판되는 유산균 발효유의 우식유발능 평가 차원에서 발효유가 우식유발 원인균인 S. mutans의 억제 및 biofilm 형성 억제 작용을 하는지 평가하였다.
- mutans의 증식이나 치태형성에 어떠한 영향을 주는지에 대한 연구는 거의 없었다. 이에 국내에서 시판되는 액상발효유 3종과 농후 발효유 2종 등 총 5종을 대상으로 유산균 발효유가 S. mutans의 증식이나 biofilm 형성에 미치는 영향을 평가하여 보고자, S. mutans를 접종 배양하고 생균수와 biofilm 형성량을 측정하였으며, 또한 각 유산균 발효유의 산도와 완충능, 산생성능 및 칼슘과 인 이온의 성분분석을 시행하여 각 제품의 우식유발능을 비교평가 하고자 하였다.
제안 방법
- 96 well plate에 유산균 발효유와 우유를 각각 0%, 2.5%, 5%, 10%가 되도록 TSB로 희석하여 0.1ml씩 첨가하고 S. mutans 0.1 ml(5.0×106 CFU/ml)를 접종하였다.
- 96 well plate에 유산균 발효유와 우유를 최종 농도가 0%, 2.5%, 5%, 10%가 되도록 TSB에 희석하여 각각 0.1 ml씩 넣고, S. mutans 0.1 ml (5.0×106 CFU/ml)를 접종하였다.
- S. mutans에 의한 biofilm 형성량을 비교하기 위해 crystal violet으로 염색 후 탁도(optical density)를 측정하였다. 10% 유산균 발효유 자체와 균 접종 후의 biofilm 형성량을 비교한 결과, 투티와 에이스는 균 접종 후 탁도가 증가했고, 이오는 유의한 변화가 없었다.
- 또한 유산균 발효유와 우유 자체의 biofilm 형성을 확인하기 위해 S. mutans를 넣지 않고 유산균 발효유와 우유가 0%, 2.5%, 5%, 10%가 되도록 TSB에 희석하여 0.2 ml를 넣어 같은 방법으로 실험을 시행하였다.
- 상온의 유산균 발효유 25 ml를 비커에 담아 초기 pH를 pH meter(Digital pH meter, Corning, USA)로 측정하였다. 완충능은 각 유산균 발효유를 pH 7까지 변화시키는데 필요한 1M NaOH의 양으로 정의하였으며, 25 ml의 유산균 발효유에 1M NaOH를 첨가하여 혼합용액이 pH 7에 도달할 때까지 주입된 NaOH 부피를 측정하였다.
- 시판되는 유산균 발효유 5종(투티, 에이스, 이오, 불가리스, 액티브 GG)과 우유를 선택하여 우식유발 원인균인 S. mutans에 대한 증식억제 및 biofilm 형성에 미치는 영향을 평가하고, 발효유의 산도 및 완충능, 산생성능, 칼슘과 인의 함량을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 앞의 결과를 구강 내에서 증명하기 위한 여러 연구가 진행되었는데 이때는 우리가 일상적으로 섭취할 수 있는 식품에 유산균을 넣거나 특정 유산균이 함유된 식품을 이용하여 그 결과를 관찰하였다. 요구르트에 Bifidobacterium DN-173 010을 첨가한 실험에서 Caglar 등14)은 타액 내 S.
- 유산균 발효유와 우유의 칼슘과 인의 농도는 ICP-Atomic Emission Spectrometer(OPTIMA 4300DV, Perkin Elmer)를 이용해 측정하였다.
- 자당이 첨가된 경우 유산균이 biofilm 형성에 미치는 영향을 조사하기 위해 유산균 발효유와 우유에 5% 자당을 첨가하여 1)과 같은 방법으로 시행하였다.
대상 데이터
- 동결 보관중인 S. mutans serotype c(Ingbritt strain)를 이용하였으며 2 ul를 TSB 20 ml에 접종하여 37℃ 배양기에서 배양하였다.
- 시중에 판매되는 유산균 발효유 중 유산균 수가 ml당 1천만 마리 이상이며 무지유고형분 함량이 3.0% 이상인 액상발효유 3종(한국야쿠르트 투티, 한국야쿠르트 에이스, 남양 이오)과 유산균 수가 ml당 1억마리 이상이며 무지유고형분 함량이 8.0% 이상인 농후 발효유 2종(남양 불가리스, 매일 액티브 GG)을 대상으로 하였고, 대조군으로는 우유(빙그레 참맛 우유)를 사용하였다. 각 제품의 주요 구성성분은 표 1에 표시되어 있다.
데이터처리
- 각 유산균 발효유의 biofilm 형성량은 Friedman test를 이용하여 유의성 검정을 시행하였으며, 각 발효유의 첨가 비율의 증가에 따른 차이검정은 Mann-Whitney U Test를 시행하였다.
성능/효과
- mutans에 의한 biofilm 형성량을 비교하기 위해 crystal violet으로 염색 후 탁도(optical density)를 측정하였다. 10% 유산균 발효유 자체와 균 접종 후의 biofilm 형성량을 비교한 결과, 투티와 에이스는 균 접종 후 탁도가 증가했고, 이오는 유의한 변화가 없었다. 반면에 액티브 GG와 불가리스는 균 접종 후 biofilm이 오히려 감소하였는데 이는 유산균이 S.
- S. mutans와 유산균 발효유 및 우유를 배양한 경우, S. mutans를 접종하지 않은 경우와 비슷한 양상을 나타냈으며, 8시간 이후에는 모든 제품이 pH 5.5 이하의 산도를 나타냈다. 우유도 시간이 경과함에 따라 pH가 감소하였으며 10시간 경과 후 pH 5.
- S. mutans의 생균수를 측정한 결과 우유는 변함이 없었으나 모든 발효유에서 발효유의 %가 증가함에 따라 S. mutans 수가 감소했다.
- pH 7로 중화시킨 각 발효유 및 우유를 TSB와 혼합하여 배양한 후 2시간 간격으로 산도를 측정하였을 때 2시간 경과 시 pH 5.5 이하로 감소한 제품은 불가리스였으며, 4시간 경과 시는 액티브 GG, 6시간 경과 시는 에이스가 pH 5.5 이하로 감소하였다. 우유는 변함이 없었다(Fig.
- 각 발효유에 S. mutans를 접종한 후 S. mutans의 생균수를 측정한 실험에서 우유와 발효유의 %가 증가함에 따라 우유에서는 생균수의 변화가 없었으나, 5종의 발효유에서는 S. mutans 생균수가 감소하였다. 역시 액티브 GG, 에이스, 불가리스, 투티, 이오 순으로 감소되어 유산균 함량이 많은 농후발효유가 액상발효유보다 S.
- 각 발효유와 우유의 칼슘과 인에 대한 성분 분석 결과 불가리스가 가장 많은 칼슘과 인 함량을 보였으며 우유에 함유된 양보다 더 많았다(Table 3, Fig. 8). 칼슘은 불가리스, 우유, 에이스, 액티브 GG, 투티, 이오 순으로, 인은 불가리스, 우유, 액티브 GG, 에이스, 투티, 이오 순으로 함유되어 있었다.
- 각 유산균 발효유만의 biofilm 형성량은 불가리스에서 가장 높았으며, 에이스, 액티브 GG, 투티, 이오 순으로 나타났다. 유산균 발효유에 S.
- mutans를 접종 후 10시간 배양한 결과 접종하지 않은 실험과 비교 시 우유가 큰 폭의 pH 감소를 나타내었으며 10시간 후 모든 발효유 및 우유의 산도가 pH 5 이하로 감소되어 치아의 탈회 임계점을 넘어섰다. 그러나 균 접종 전에도 낮은 pH 값을 보였던 농후발효유와 에이스의 산도는 크게 변하지 않았으며 투티, 이오, 우유의 pH가 감소하였다. 이는 유산균에 의한 S.
- mutans만을 접종한 발효유 0%에서와 모든 농도의 우유에 균을 접종한 경우, 생균수의 유의한 차이가 없었다. 그러나 모든 유산균 발효유는 농도가 증가함에 따라 S. mutans의 생균수가 감소하였으며, 액티브 GG, 에이스, 불가리스, 투티, 이오 순으로 S. mutans 감소 양상을 나타냈다(Fig. 1).
- 이상의 결과는 유산균 발효유가 초기산도 및 산생성능 측정 결과 우식유발 가능성이 있음을 나타냈다. 그러나 유산균 발효유 중에서 농후발효유가 우식유발균인 S. mutans를 억제하였고 biofilm 형성을 감소시켜 긍정적인 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 농도를 달리한 각 유산균 발효유에 S. mutans를 동량 접종하고 생균수를 측정한 결과 S. mutans만을 접종한 발효유 0%에서와 모든 농도의 우유에 균을 접종한 경우, 생균수의 유의한 차이가 없었다. 그러나 모든 유산균 발효유는 농도가 증가함에 따라 S.
- 또한 10% 유산균 발효유의 S. mutans 포함 여부에 따른 biofilm 형성 정도를 측정한 결과 S. mutans를 포함한 경우 액티브 GG, 불가리스는 biofilm 형성이 감소하였고, 이오는 유의한 변화가 없었으며, 투티, 에이스, 우유는 biofilm 형성이 증가하였다(P<0.05).
- 또한 5% 자당을 첨가한 실험에서 대부분의 발효유가 자당이 포함되지 않은 경우보다 더 많은 biofilm이 형성되었으나 각각의 발효유는 농도가 높아짐에 따라 유산균의 S. mutans 억제 작용에 의해 biofilm 형성량이 감소하였다. 반면에 유산균이 함유되지 않은 우유는 biofilm이 증가하였다.
- 발효유 및 우유의 성분 중 치질을 탈회로부터 보호하는 무기질인 칼슘은 불가리스에 가장 많이 함유되어 있었고 우유, 에이스, 액티브 GG, 투티, 이오 순으로 함유되었으며, 인은 불가리스에 가장 많이 함유되었고, 우유, 액티브 GG, 에이스, 투티, 이오 순으로 함유되어 있었다.
- 산생성능을 평가한 결과 모든 유산균 발효유가균을 접종하지 않았을 때에도 시간이 경과됨에 따라 산도가 증가 되었는데, 2시간 경과 시 불가리스는 pH 5.5 이하를 나타냈고, 배양 10시간 후 우유는 산도의 변화가 없었으며 투티와 이오는 pH가 낮아졌으나 탈회임계점(pH 5.5)까지 미치지 않았고, 유산균의 수가 많은 에이스, 불가리스, 액티브 GG는 탈회 임계점 이하로 감소되었다. 이는 유산균 자체가 유산을 생성하기 때문으로 생각된다21).
- 실험 유산균 발효유의 산도는 이오가 pH 3.48로 가장 낮았고, 불가리스가 pH 4.19로 가장 높았으며 우유는 pH 6.39였다. 액상발효유는 평균 pH 3.
- 39였다. 액상발효유는 평균 pH 3.62, 농후발효유는 평균 pH 4.12로 액상발효유의 평균 pH가 더 낮은 것으로 나타났다. 산도는 이오가 가장 낮았고 투티, 에이스, 액티브 GG, 불가리스 순으로 높아졌다(Table 2, Fig.
- mutans 생균수가 감소하였다. 역시 액티브 GG, 에이스, 불가리스, 투티, 이오 순으로 감소되어 유산균 함량이 많은 농후발효유가 액상발효유보다 S. mutans를 더 억제하는 것으로 생각되었다.
- 완충능은 중성의 pH를 만들기 위해 필요한 수산화나트륨의 부피로 액티브 GG, 투티가 좋은 결과를 나타냈고 불가리스가 가장 높은 값을 나타내어 결과적으로 산성 환경이 구강 내에서 오래 유지되고 중화되기 어려움을 나타냈다.
- 완충능을 측정한 결과 불가리스(2.47±0.05)가 가장 높아 산도를 중성으로 만들기가 어려우며 액티브 GG(1.43±0.30)가 유산균 발효유 중 완충능이 가장 낮아 중성으로 만들기가 쉬운 것으로 나타났다.
- 유산균 발효유 및 우유의 산도를 측정한 결과 이오(3.48±0.01)가 가장 낮았으며, 불가리스(4.19±0.02)가 가장 높았다.
- 유산균 발효유에 S. mutans를 첨가한 후 biofilm 형성 정도를 비교 측정한 결과 액티브 GG, 불가리스는 biofilm이 감소하였고, 이오는 유의한 변화가 없었으며, 투티, 에이스, 우유는 biofilm이 증가하였다(P<0.05)(Fig. 2).
- 유산균 발효유의 산생성능을 평가하기 위해 pH 7로 중화시킨 후 S. mutans를 접종하여 배양하고 2시간 간격으로 산도를 측정한 결과 불가리스가 가장 높은 산생성능을 보였으며 액티브 GG, 에이스, 투티, 이오, 우유 순으로 산도 하강 경향을 나타냈다.
- 이번 연구는 구강 건강을 증진시킬 수 있음을 광고하는 1종의 유산균 발효유(투티)와 위장관에 유익함을 내세우는 제품 4종을 선택하였는데, 모든 제품이 여러 종의 유산균을 함유한 시판 제품이고, 또한 여러 합성물이 첨가되어 있어 변수가 있었을 가능성이 있다. 향후 치태형성 및 우식발생에 대한 유산균 발효유의 영향을 조사하는 생체 내 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과는 유산균 발효유가 초기산도 및 산생성능 측정 결과 우식유발 가능성이 있음을 나타냈다. 그러나 유산균 발효유 중에서 농후발효유가 우식유발균인 S.
- 자당이 첨가되지 않은 실험과 비교하였을 때, 모든 농도의 이오와 2.5%, 5%의 액티브 GG를 제외한 나머지 유산균 발효유 및 우유는 자당 첨가 시 유의하게 높은 탁도(optical density)를 나타냈다(P<0.01).
- 한편 유산균 발효유에 S. mutans를 접종 후 10시간 배양한 결과 접종하지 않은 실험과 비교 시 우유가 큰 폭의 pH 감소를 나타내었으며 10시간 후 모든 발효유 및 우유의 산도가 pH 5 이하로 감소되어 치아의 탈회 임계점을 넘어섰다. 그러나 균 접종 전에도 낮은 pH 값을 보였던 농후발효유와 에이스의 산도는 크게 변하지 않았으며 투티, 이오, 우유의 pH가 감소하였다.
후속연구
- 또한 유산균 발효유는 건강 증진을 추구하는 현대에 그 소비량이 증가하고 있고 치아 맹출 단계의 어린이가 많이 섭취하는 음료이므로 칼슘과 인 등 치아 탈회를 막는 무기질의 함량을 개선하고, 우식유발균에 대한 억제효과가 분명한 유산균을 이용하여 위장관뿐만 아니라 구강건강까지 고려한 제품을 개발해 나가야 할 것으로 생각된다.
- 그러나 유산균 발효유의 침식효과에 대해 Wongkhantee 등16)과 Lussi 등17), 그리고 Kargul 등18)은 어떤 종류의 요구르트도 치아에 침식을 일으키지 않으며 이는 칼슘과 인의 영향 때문임을 인공타액 순환 실험으로 증명하였다. 유산균의 산생성이 치아의 탈회에 부정적인 영향을 미칠 수 있으나 유산균이 우식원균 억제 효과를 나타낼 수 있는 복잡한 관계가 되므로 유산균 발효유의 산도가 우식유발에 미치는 영향 및 유산균과 우식 유발균과의 상호작용 기전은 더 연구가 필요하다.
- 이번 연구는 구강 건강을 증진시킬 수 있음을 광고하는 1종의 유산균 발효유(투티)와 위장관에 유익함을 내세우는 제품 4종을 선택하였는데, 모든 제품이 여러 종의 유산균을 함유한 시판 제품이고, 또한 여러 합성물이 첨가되어 있어 변수가 있었을 가능성이 있다. 향후 치태형성 및 우식발생에 대한 유산균 발효유의 영향을 조사하는 생체 내 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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