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제안 방법
- L. paracasei KLB58이 가장 높은 편차를 나타낸 조건인 electroporation buffer No. 1, pulse voltage 2.5 kV, time constant 5 ms에서 4가지 전처리 방식에 따른 각 균주의 형질전환효율을 비교하였다(Fig. 1). KLB58은 세포벽 전처리를 하지 않았을 때 (untreatment) 87, 500 CFU/iig DNA, penicillin 처리시 320 CFU/pg DNA 등 270배 이상의 큰 차이를 보였고 다른 대부분의 균주도 각각의 전처리에 따라 그 효율이 다르고 그 차이 또한 크게 나타났다.
- 2 - 0.3)하여 대조군과 같은 방법으로 세척한 Penicillin treatment, ii) 16-18시간 배양한 균주를 1% glycine (w/v)이 첨가된 10 ml MRS broth에 2% 접종하여 3시간 배양 (OD60o = 0.2 - 0.3)하고 세척한 Glycine treatment, ⅲ) MRS broth 에 대조군과 같이 배양하고 회수한 세포를 세척 후 Egg white lysozyme을 최종 농도 10ug/ml가 되도록 첨가, 37 ℃ 에서 30분 추가배양하고 ice washing buffer로 1회 세척한 Lysozyme treatment 중에 하나를 처리하였다.
- 각 균주의 electroporation buffer에 따른 형질전환 효율을 비교하기 위해 untreatment, pulse voltage 2.5 kV, time constant 5 ms로 나머지 변수를 고정하였다(Fig. 2). KLB58의 경우 세포벽 전처리와 마찬가지로 electroporation buffer에 따라서도 형질전환 효율이 크게 차이가 나는 것을 보여주었다.
- 5 kV의 전압으로 electric pulse를 가하였다 (전기장 세기[E]는 각각 12, 18, 25 kV/cm). 각각의 전압에서 time constant를 default (약 5 ms)와 2.0ms로 설정하여 수행하였다. Electroporation 후 200 μ1의 MRS배지를 더하고 37℃에서 2시간 정치 배양한 후 5 ug/tnl의 erythromycin을 함유한 MRS agar plate에 도말하였다.
- 구하여 비교하였다(data not shown). 그 중 표준편차가 가장 높은, 즉 가장 큰 영향을 주는 조건을 균주별로 제시하였다(Table 3). 최고효율 형질전환 조건과 마찬가지로 균종에 따라 크게 영향을 받는 조건이 달랐으며 같은 L.
- 좋은 영향을 준다고 알려져 있다. 본 연구에서는 건강한 한국인 체내에서 분리하고 선별된 6개의 Lactobacillus 균주 (L. paracasei KLB58, L. fermentum MS79 and KLB282, L. plantarum KLB213, L. gasseri KLB238, and L. reuteri KLB270)를 플라스미드 pNCKH104로 electrotransformation 하였다. 최적 조건을 찾기 위해 pulse voltage, time constant, 세포벽 처리방법, 세포 현탁액을 다양하게 변화시켰으며, 그 결과 각각의 균주에 대해 최적의 형질전환 조건을 결정하였다.
- 세포생장은 분광광도계 (Phamacia. Biotech, ultrospec. 2000)를 이용해 탁도를 측정하여 관찰하였다(0。6两. 정지기 (16-18 h)의 균주를 10 pl MRS broth에 2% 접종, 37 ℃ 에서 정치배양 한 후 초기의 지수생장기 (OD60o = 0.
- Lactobacillus spp.에 공통적으로 적용할 수 있는 최적의 형질전환 조건을 찾기 위해 6 균주에 대한 각 조건에서의 효율을 비교하였다. 그 중 가장 높은 최소값이 나타난 조건의 조합은 I) untreatment, electroporation buffer No.
- Lactobacillus spp.에 대해 electrotransformation을 수행하여 각각의 형질전환에 최고효율을 갖는 최적 조건을 찾고, 다양한 유산균에 간편하게 적용할 수 있는 공통의 조건을 결정하였다.
- 1). 전기영동은 1.0% 아가로즈 젤을 이용하였고 1 kb DNA ladder로 크기를 추측하였다(5.7 Kb).
- reuteri KLB270)를 플라스미드 pNCKH104로 electrotransformation 하였다. 최적 조건을 찾기 위해 pulse voltage, time constant, 세포벽 처리방법, 세포 현탁액을 다양하게 변화시켰으며, 그 결과 각각의 균주에 대해 최적의 형질전환 조건을 결정하였다. 대체로 인체에서 분리한 Lactobacillus 균주는 전처리 없이 0.
- paracasei KLB58 형질전환체를 Anderson and Mckay(ll)의 ■방법으로 분리하고 전기영동 하였다. 형질전환 수율을 높이기 위해 필요에 따라 배양액의 양을 10배까지 높여 고농도로 분리 하였다.
- 형질전환 실험을 위해 정제된 pNCKH104플라스미드 DNA (50 ug/ml) 1 μ1를 50 μ1의 미리 얼음에 10분 이상 정치시킨 세포 현탁액 (4가지 조성, Table 1)과 함께 0.2cm gap Gene Pulser disposable cuvette (Bio-Rad) 에 넣고 Gene Pulser (Bio-Rad)를 이용해 1.2, 1.8, 2.5 kV의 전압으로 electric pulse를 가하였다 (전기장 세기[E]는 각각 12, 18, 25 kV/cm). 각각의 전압에서 time constant를 default (약 5 ms)와 2.
- 형질전환을 위한 유산균의 세포벽 약화를 위해 3가지 처리 방법을 시도하였다. Glycinee electroporation 전의 세포벽 처리제로 널리 쓰이며 다양한 박테리아의 성장 배지첨가 시, electrocompetence를 자극하는 것으로 알려져 왔고, 박테리아의 세포벽 펩타이드간 L-과 D-alanine을 포함하는 연결다리로 쉽게 들어가 세포벽의 합성을 저지한다고 알려져 있다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 인체 내에서 정상 세균총으로 분리된 Lactobacilli 중, 다양한 외부 환경 스트레스에 우수한 내성을 보이는 6개의 균주 (L. paracasei KLB58, L. fermentum MS79, L. fermentum KLB282, L. plant arum KLB213, L. gasseri KLB238과 乙 reuteri KLB270)가 이용되었다(9). 모두 MRS (de Man Rogosa Sharped)배지에서 정치 배양하고 배양온도는 37℃ 였다.
- 였으며, erythromycin (50 lig/ml)이 포함된 LB 배지에서 37℃로 교반 배양하였다. 형질전환을 위한 벡터 플라스미드로서 Escherihia coli - L. reuteri shuttle vector 인 pNCKH104를 사용하였다。0). 이 플라스미드의 크기는 5.
데이터처리
- 각 균주에 대해 어떠한 조건이 형질전환효율에 큰 폭의 변화를 주는가 알아보기 위해 각 조건별 결과 값의 표준편차를 구하여 비교하였다(data not shown). 그 중 표준편차가 가장 높은, 즉 가장 큰 영향을 주는 조건을 균주별로 제시하였다(Table 3).
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