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문제 정의
- 따라서 위 연구에서는 당 성분을 에너지원으로 사용하며 알코올 발효 균주로 사용되고 있는 식품미생물인 효모 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053)를 통하여 이전 연구에서 보고되어진 대로(12,19) 소화가 용이하도록 발효시킴과 동시에 당유자 과피에 함유하고 있는 플라보노이드 성분을 새로운 형태로 전환시킴으로써 이에 따른 생리활성 변화와 성분 변화를 보았으며, 기능성식품 및 건강보조식품 등의 식품용 신소재 개발 원료로서의 이용 가능성을 탐색하였다.
- 지질과산화물과 그것의 분해산물 중에는 생체에 유해한 성분들이 있으며 대식세포 기능의 억제, 단백합성 억제, thrombin 과다생산 등과 같은 유해 작용들이 보고되어 왔다. 이에 따라 지질과산화의 시발점이라 할 수 있는 alkyl radical의 소거활성을 통해 그 생리활성물질로서 가능성을 확인하고자 하였다. Fig.
제안 방법
- 14중에서 7종은 현재 보유하고 있는 플라보노이드 표준품(naringin: 580 m/z, hesperidin: 610 m/z, neohesperidin: 610 m/z, 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone: 372 m/z, nobiletin: 402 m/z, 3',4',5,5',6,7- hexamethoxyflavone: 402 m/z, tangeretin: 372 m/z)의 LC/MS 값과 MS2을 통하여 비교하여 확인하였다.
- 60 μL 시료 용액에 60 μL DPPH 용액(60 μM)을 첨가하여 10초 동안 교반한 다음 혼합 용액을 quartz capillary tube에 옮긴 후 2분 후에 electron spin resonance(ESR) spectrometer(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하였다.
- 위의 결과를 보면 효모를 이용하여 당유자 과피를 발효하였을 때, 당유자 과피 본래의 생리활성 성분보다는 효모 발효를 통하여 생리활성 성분이 증가 및 전환되었으리라 보며 이를 확인하기 위하여 DPPH, hydroxyl, alkyl radical 및 hydrogen peroxide에 대한 항산화능을 측정한 결과, 모든 항산화실험에서 발효 추출물인 FCGP가 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 FCGP의 생리활성 성분의 변화 및 증가를 알아보기 위하여 LC/MS을 이용하여 성분 분석을 하였다.
- 당유자 과피를 식품미생물인 효모를 이용하여 발효 후 80% 에탄올로 추출하여 발효 전과 후의 플라보노이드 함량 및 성분 변화와 항산화 활성의 차이를 비교 분석하였다. LC/MS를 통한 플라보노이드 분석 결과, 발효 후 추출물에서 neohesperidin과 naringin의 함량 변화는 큰 차이가 없었 으나, hesperidin과 일부 플라보노이드 성분은 감소하였으며, 특히 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone은 발효 후에 그 함량이 크게 감소하였다.
- 당유자 과피의 발효과정은 다음과 같다. 멸균된 삼각 플라스크에 당유자 과피 분말 6.25%, yeast extract 1%와 glucose 1%를 각각 넣은 후 증류수를 채워서 1 L를 제조하였으며3 N NaOH을 이용하여 전체 혼합액의 pH를 7.0으로 조절한 후, 가압멸균(121℃, 15분)하였다. 발효 균주로 사용되어진 효모, Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053)의 전배양은 YM broth 배지에서 25℃, 5일간 호기, 교반조건(120 rpm) 하에서 배양하였다.
- 6 mm×250 mm)을 사용하였고, 이동상은 A: 메탄올, B: 물을 사용하였다. 이동상구배는 메탄올/물을 10/90의 비율로 시작하여 40분에 100/0의 비율로 분석하였다. 이동상 유속은 0.
- 항산화시료의 DPPH radical 소거활성은 Nanjo 등의 방법(21)을 변형하여 측정하였다. 60 μL 시료 용액에 60 μL DPPH 용액(60 μM)을 첨가하여 10초 동안 교반한 다음 혼합 용액을 quartz capillary tube에 옮긴 후 2분 후에 electron spin resonance(ESR) spectrometer(JEOL Ltd.
대상 데이터
- 본 실험에서는 당유자 과피에 많이 함유되어졌다고 보고되어진 neohesperidin, naringin, nobiletin 등 여러 종류의 플라보노이드 표준품을 같은 조건에서 동시에 분석하였으며 이때 HPLC의 column은 YMC C18 column(5 μm, 4.6 mm×250 mm)을 사용하였고, 이동상은 A: 메탄올, B: 물을 사용하였다.
- 분석에 사용된 HPLC/MS는 ThermoFisher Scientific사의 LXQ(San Jose, USA) 모델을 사용하였다. 본 실험에서는 당유자 과피에 많이 함유되어졌다고 보고되어진 neohesperidin, naringin, nobiletin 등 여러 종류의 플라보노이드 표준품을 같은 조건에서 동시에 분석하였으며 이때 HPLC의 column은 YMC C18 column(5 μm, 4.
- 분석에 사용된 플라보노이드 표준품 중 neohesperidin, naringin은 Sigma사(St, Louis, USA)에서 구입하였고, hesperidin, nobiletin, tangeretin, 3',4',5,5',6,7-hexamethoxyflavone, 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone, 3',4',7,8-tetramethoxyflavone은 Extrasynthese사(Genay Cedex, France)로부터 구입하였으며, 기타 분석 및 정량 시약은 HPLC급 시약을 사용하였다.
- 제주 재래 감귤인 당유자(Citrus grandis Osbeck)는 2009년 3월에 채집한 과피를 제주도 서귀포시 대정읍에 있는 금산건강원에서 구입하였다. 분석에 사용된 플라보노이드 표준품 중 neohesperidin, naringin은 Sigma사(St, Louis, USA)에서 구입하였고, hesperidin, nobiletin, tangeretin, 3',4',5,5',6,7-hexamethoxyflavone, 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone, 3',4',7,8-tetramethoxyflavone은 Extrasynthese사(Genay Cedex, France)로부터 구입하였으며, 기타 분석 및 정량 시약은 HPLC급 시약을 사용하였다.
이론/모형
- Hydrogen peroxide 소거활성은 Müller(24)의 방법인 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS)- peroxidase system에서 H2O2 소거활성을 측정하였다.
- 총 플라보노이드는 Zhuang 등의 방법(20)에 따라 당유자 과피 추출물 0.5 mL에 1.5 mL의 증류수와 0.5 mL의 5% NaNO2를 넣고 혼합한 후 6분간 반응시켰다. 그 후 10% AlCl3 0.
- 항산화 시료의 alkyl radical 소거활성은 Hiramoto 등의 방법(23)에 준하여 측정하였다. 항산화 시료 20 μL에 증류수 20 μL을 혼합한 후 40 mM 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH) 20 μL을 넣고 40 mM α-(4-pyridyl N-oxide)-N-tert-butylnitrone(POBN) 20 μL을 혼합한 다음 37℃에서 30분간 반응 후 quartz capillary tube에 옮겨 ESR spectrophotometer로 측정하였다.
- 항산화시료의 hydroxyl radical 소거활성은 Rosen과 Rauckman의 방법(22)에 준하여 측정하였다. 즉, 일정한 농도의 시료 20 μL를 e-tube에 넣은 후 여기에 0.
성능/효과
- 2에 당유자 과피 CGP와 발효물인 FCGP의 HPLC에 의한 분석크로마토그램을 나타내었다. CGP보다 FCGP에서 많은 peak들이 나타났으며 몇 가지 플라보노이드 성분이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그 내용은 다음과 같다.
- CGP와 FCGP 모두 500 μg/mL에서 4,000 μg/ mL까지 농도별로 활성이 크게 증가하진 않았지만 농도 의존적으로 증가하였고 IC50 값을 보면 FCGP가 1,195 μg/mL로 CGP 4,355 μg/mL보다 명확히 hydrogen peroxide 소거활성이 높다는 것을 알 수 있었다(Table 3).
- CGP와 FCGP 모두 625 μg/mL에서 5,000 μg/mL까지 농도 의존적으로 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었으나 다른 라디칼 소거활성에 비해 다소 약한 소거능을 보였다.
- LC/MS를 통한 플라보노이드 분석 결과, 발효 후 추출물에서 neohesperidin과 naringin의 함량 변화는 큰 차이가 없었 으나, hesperidin과 일부 플라보노이드 성분은 감소하였으며, 특히 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone은 발효 후에 그 함량이 크게 감소하였다.
- 결과에 따르면 CGP와 FCGP 모두 150 μg/mL에서 1,250 μg/mL까지 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 특히, FCGP 소거활성은 35%에서 83%까지 높은 DPPH radical 소거활성을 보였다.
- 3 μg/mL보다 높은 IC50 값을 확인할 수 있었다. 당유자 과피 추출물보다는 발효를 통한 추출물이 강력한 alkyl radical 소거활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- 당유자과피에 함유된 플라보노이드 성분중에서 naringin과 neohesperidin은 이전 연구 보고(28)에서와 같이 가장 많은 양을 함유하고 있었다. 당유자 과피의 플라보노이드 분석은 표준 품의 분석크로마토그램 상에 RT와 LC/MS을 통하여 확인하였으며 CGP와 FCGP 모두에서 neohesperidin, hesperidin 및 naringin은 유사한 함량이 함유되어 있는 것을 알 수 있었다. 하지만 9, 11, 12, 13, 14의 성분들은 발효과정 중에 함량의 일부가 감소하고 있는 것을 알 수 있으며, 그중에 11번째 성분인 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone은 FCGP에서 그 성분을 확인할 수 없을 만큼의 적은 양만이 측정되었다.
- 따라서 당유자 과피에 함유된 플라보노이드가 효모의 발효과정을 통하여 일부의 플라보노이드가 감소하여 다른 형태의 새로운 화합물로 전환되어진 것을 LC/MS을 통하여 확인할 수 있었고 이렇게 전환된 성분들은 항산화 활성을 증가시키는데 기여한 것으로 판단된다. 본 연구결과에서 보면 당유자 과피를 식품미생물인 효모를 이용하여 발효한 경우 항산화 활성들이 증가되는 사실을 알 수 있어 기능성 증대가 가능한 것으로 판단된다.
- 이와 같은 폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포하는 2차 대사산물로서 수산기를 가지는 방향성 화합물을 총칭하는 것으로, hydroxycinnamic acid를 비롯한 대부분의 폴리페놀 화합물은 세포벽, 다당류, 리그닌 등과 에스테르 결합되어 있거나 중합체로 존재하며, 수산기를 통한 수소공여와 페놀 고리구조의 공명안정화에 의해 항산화 능력을 나타낸다고 보고되었다(25,26). 따라서 폴리페놀류의 하나인 플라보노이드 함량의 증가는 항산화력에 영향을 미치는 주된 인자라고 보이며 이 실험에서도 FCGP의 플라보노이드 함량의 증가는 항산화 능력에 영향을 미치는 주된 요인이 될 것으로 생각된다.
- 또한 당유자 과피 추출물에 대한 IC50 값을 보았을 때에도 FCGP 가 261.3 μg/mL로 CGP 485.3 μg/mL보다 강력한 DPPH radical 소거활성을 보였다(Table 3).
- 따라서 당유자 과피에 함유된 플라보노이드가 효모의 발효과정을 통하여 일부의 플라보노이드가 감소하여 다른 형태의 새로운 화합물로 전환되어진 것을 LC/MS을 통하여 확인할 수 있었고 이렇게 전환된 성분들은 항산화 활성을 증가시키는데 기여한 것으로 판단된다. 본 연구결과에서 보면 당유자 과피를 식품미생물인 효모를 이용하여 발효한 경우 항산화 활성들이 증가되는 사실을 알 수 있어 기능성 증대가 가능한 것으로 판단된다.
- 위의 결과를 보면 효모를 이용하여 당유자 과피를 발효하였을 때, 당유자 과피 본래의 생리활성 성분보다는 효모 발효를 통하여 생리활성 성분이 증가 및 전환되었으리라 보며 이를 확인하기 위하여 DPPH, hydroxyl, alkyl radical 및 hydrogen peroxide에 대한 항산화능을 측정한 결과, 모든 항산화실험에서 발효 추출물인 FCGP가 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 FCGP의 생리활성 성분의 변화 및 증가를 알아보기 위하여 LC/MS을 이용하여 성분 분석을 하였다.
- 1～7번까지의 성분은 감귤유래 플라보노이드 표준품들과의 MS 및 MS2를 이용하여 비교하였으나 다른 값을 가지고 있어 확인할 수 없었다. 이로서 당유자 과피를 효모를 통하여 발효하였을 때 당유자 과피에 함유된 플라보노이드 일부 성분이 감소되었으며 효모의 발효과정을 통하여 다른 형태의 화합물로 전환되었다는 것을 알 수 있었고 이 화합물은 비당체 형태의 naringenin과 hesperetin이 아닌 새로운 형태의 화합물로 전환되어진 것을 알 수 있었다. 이 화합물들의 특성을 크로마토그램에서 보면 전환되어진 성분들이 다른 플라보노이드보다 먼저 측정된 것을 확인할 수있 었다.
- 추출수율은 CGP 추출물이 좀 더 높은 22%로 FCGP 추출물 17%보다 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량은 FCGP가 3.768 g/100 g으로 CGP 3.395 g/100 g보다 약간 높은 함량을 함유하고 있었다. 추출수율에 따른 플라보노이드 함량을 비교해 본 결과 FCGP 추출물이 22.
- 395 g/100 g보다 약간 높은 함량을 함유하고 있었다. 추출수율에 따른 플라보노이드 함량을 비교해 본 결과 FCGP 추출물이 22.02%로 CGP 추출물 16.43%보다 약 6% 정도의 높은 플라보이드 함유 함량을 확인할 수 있었다. 이와 같은 폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포하는 2차 대사산물로서 수산기를 가지는 방향성 화합물을 총칭하는 것으로, hydroxycinnamic acid를 비롯한 대부분의 폴리페놀 화합물은 세포벽, 다당류, 리그닌 등과 에스테르 결합되어 있거나 중합체로 존재하며, 수산기를 통한 수소공여와 페놀 고리구조의 공명안정화에 의해 항산화 능력을 나타낸다고 보고되었다(25,26).
- 당유자 과피(Citrus grandis Osbeck peel, CGP)와 당유자 과피 발효물(Fermented Citrus grandis Osbeck peel, FCGP)의 80% 에탄올 추출물 수율 및 플라보노이드 화합물의 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 추출수율은 CGP 추출물이 좀 더 높은 22%로 FCGP 추출물 17%보다 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량은 FCGP가 3.
- 하지만 9, 11, 12, 13, 14의 성분들은 발효과정 중에 함량의 일부가 감소하고 있는 것을 알 수 있으며, 그중에 11번째 성분인 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone은 FCGP에서 그 성분을 확인할 수 없을 만큼의 적은 양만이 측정되었다. 한편 FCGP에서는 3번을 제외한 1, 2, 4, 5, 6번 화합물들의 함량이 수배에서 수십 배까지 크게 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 1～7번까지의 성분은 감귤유래 플라보노이드 표준품들과의 MS 및 MS2를 이용하여 비교하였으나 다른 값을 가지고 있어 확인할 수 없었다.
후속연구
- 이는 효모를 통한 발효과정 중에 플라보노이드 성분이 다른 형태로 전환되었으며, 이렇게 전환되어진 성분들을 함유한 FCGP는 CGP보다 DPPH, hydroxyl, alkyl 및 hydrogen peroxide 소거활성 등과 같은 항산화 활성을 크게 증가시켰다. 결론적으로 효모를 이용하여 당유자 과피를 발효시킴으로써 생리활성 성분의 일부를 전환시킴으로써 항산화 활성 등과 같은 기능성을 향상시킬 수 있어, 향후 당유자 과피의 발효에 의한 다양한 건강기능식품으로서의 개발이 가능한 것으로 사료된다.
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