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문제 정의
- 따라서 본 연구는 배양액 내 인간의 난포액과 성선자극호 르몬 첨가가 인간 미성숙란의 체외성숙과 수정, 배발달에 얼 마나 효과가 있는지 알아보고자 실시하였다.
- 본 실험은 시험관 아기 시술 프로그램에서 과배란 유도를 통한 난자 채취시 함께 채취된 중간난자와 미성숙 난자를 성숙 시켜 이용율을 높이고자 실시하였다. 일반적으로 난자 채취시 미성숙 난자가 약 20~30% 정도 얻어진다고 보고(Mandelbaum 등, 1996; De Vos 등, 1999)되었는데, 세포질내 정자 주입술을 시행하기 전까지 성숙된 난자를 보면 채취된 총 1,018개의 난 자 중 711개(553개 + 4시간 배양 후 158개 성숙)가 성숙되어 69.
- 본 연구는 시험관아기 프로그램에서 난자 채취시 발생하는 미성숙 난포란의 효과적인 이용을 위하여 배양액 내 인간의 난포액과 성선자극호르몬 첨가가 체외성숙율-, 수정율 및 배 발달율에 얼마나 효과가 있는지 알아보고자 실시하였다. 난자 채취 시 회수된 성숙난자는 54.
제안 방법
- 장기요법의 경우 월경주기 일주일 전부터 GnRH agonist를 이용하여 뇌하수체를 억제하고, 월경이 시작되면 월 경 주기 제 3일에 뇌하수체의 기능 억제 유무를 확인하기 위하여 혈 중 LH, estradiol, progesterone(Ri)을 측정 하고 LH < 5 mIU/ml, E2 < 50 pg/ml, P4 < 1 ng/ml인 경우 과배 란 유도를 시작하였고 그 후 과배란 과정은 단기 요법과 같았다. 길항 요 법은 월경 시작 3일째에 초음파 검사 및 위에서 언급한 호르 몬 검사를 실시하여 난소낭종이 없고, 호르몬 검사상 월경주 기 3일째에 합당한 수치의 결과가 보이면 단기요법에서 언급 한 성선자극호르몬을 투여하기 시작하고, 생리주기 6~8일째 다시 초음파 검사를 실시하여 난포의 크기가 14 mm에 도달 하면 조기 LH surge를 예방하기 위해 GnRH antagonist(Cetrotide, Serono, Switzerland) 0.25 mg를 매일 투여하였으며, 그 후 난자 채취를 위한 hCG 등의 주사는 위에서 언급한 바와 같이 시행하였다.
- 난구세포가 제거된 난자를 5% CO2 농도의 배양기에서 3- 4시간 체외배양 후, 극체가 방출된 성숙된 난자만을 선별하여 세포질내 정자주입술(ICSI)을 실시하였고, 10% SPS가 첨가된 Q-Cleavage(Sage BioPharma, USA)에서 배양하였으며, 중간 난자(Intermediate, MI)와 미성숙 난자(GV)는 각각 10% SPS, 10% hFF, 10% SPS + 1 IU/ml FSH(LG생명과학, Korea) + 10 IU/ml HCG(LG생명과학, Korea) + 10 ng/ml recombinant human epidermal growth factor(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)가 첨가된 Q-Fert(Sage BioPharma, USA)에 넣은 다음 37 ℃, 5% C6로 조절된 배양기에서 배양하면서 4, 24, 28시간 간 격으로 관찰하며 성숙이 된 난자는 ICSI를 실시하였다. 수정 후 18시간이 지난 뒤 실체현미경(Nikon, Japan) 하에서 두 개의 전핵이 관찰되는 경우 수정으로 판별하여 배양에 들어갔 다.
- 단기 요법은 월경 주기 제2일째부터 GnRH agonist(Lucrin, Laboratories Abbott, France)를 이용하여 뇌하수체를 억제하고 제3일부터 성선자극호르몬(Follitroph, LG생명과학, Korea)을 환자에 따라 적절한 용량을 주사하면서 초음파 및 혈 중 E2 농도를 지속적으로 측정하여 우성난포의 평균 직경이 18 mm 이상이거나 16 mm 이상인 난포가 3개 이상 관찰되면 서 혈중 E2 농도가 계속 상승하거나, 직경 10 mm 이상인 난 포당 혈중 E2 농도가 200 pg/ml 이상이면 hCG(ovidrel, Serono, Switzerland) 250 “g을 피하 주사하여 배란 촉발을 유도 한 후 35~36시간 뒤에 질식 초음파 유도하에 난자 채취를 시 행하였다. 장기요법의 경우 월경주기 일주일 전부터 GnRH agonist를 이용하여 뇌하수체를 억제하고, 월경이 시작되면 월 경 주기 제 3일에 뇌하수체의 기능 억제 유무를 확인하기 위하여 혈 중 LH, estradiol, progesterone(Ri)을 측정 하고 LH < 5 mIU/ml, E2 < 50 pg/ml, P4 < 1 ng/ml인 경우 과배 란 유도를 시작하였고 그 후 과배란 과정은 단기 요법과 같았다.
- 1처 럼 제 1극체 가 방출된 난자(MU) 를 성숙난자, 난핵포(germinal vesicle, GV)가 붕괴되어 보이지 않고 제 1극체가 방줄되지 않은 중간난자(Intermediate, MI)와 세포질 내 난핵포(GV)가 존재하는 난자는 미성숙 난자 로 구분하였다. 성숙된 MII 난자는 ICSI를 하였고 미성숙 난 자(MI, GV)는 계속 배양하면서 시간대 별로 관찰하여 제 1극 체가 방출되면 ICSI를 시행하였다.
- 시험관 아기 시술을 위해 과배란을 유도한 환자에서 hCG (ovidrel, Serono, Switzerland)를 투여한 후 36시간째 질식 초 음파 유도하에 17 gauge 난자 채취용 바늘(Cook, Eight Mile Plains, Queensland, Australia)을 사용하여 채취하였고, 채취용 흡입펌프의 음압은 80-100 mmHG로 유지하였다.
- 시험관아기 시술시 난자를 채취한 후 난구세포를 제거하고 실체 현미경 하에서 성숙난자와 미성숙난자를 분류하였는데, 각 단계 별 난자 분류는 Fig. 1처 럼 제 1극체 가 방출된 난자(MU) 를 성숙난자, 난핵포(germinal vesicle, GV)가 붕괴되어 보이지 않고 제 1극체가 방줄되지 않은 중간난자(Intermediate, MI)와 세포질 내 난핵포(GV)가 존재하는 난자는 미성숙 난자 로 구분하였다. 성숙된 MII 난자는 ICSI를 하였고 미성숙 난 자(MI, GV)는 계속 배양하면서 시간대 별로 관찰하여 제 1극 체가 방출되면 ICSI를 시행하였다.
- 시험관아기 시술을 받는 환자 중 과거 병력이 없고 간염, 매 독, HIV 검사 등 에서 음성 반응을 보인 환자를 선택하여 시 험관아기 시술시 난자와 함께 채취된 난포액 중 난자를 골라 내고 남은 난포액에서 육안적으로 혈액이 포함되지 않은 것 만을 골라 2,000xg로 30분 동안 원심분리를 하였다. 그 후 상 층액을 회수하여 56℃ 항온수조에서 30분간 inactivation을 시 킨 후 0.
- 제 1 극체가 방출되지 않은 중간난자(MI)와 미성숙난자(GV) 는 난포액과 성선자극호르몬이 첨가된 각각의 배양액에서 배 양하면서 시간대 별로 난자의 성숙율을 관찰하였는데 그 결과는 Table 1, 2와 같다.
- 질식 초음파를 통한 난자 채취 2시간 후, 0.1% hyalxironidase (Sage BioPharma, USA) 농도의 Q-HEPES(Sage BioPharma, USA) 용액에서 피펫을 이용하여 난구세포를 제거하고 실체 현미경(stereomicroscope)하에서 MII 단계에 나타나는 제 1극 체(polar body) 방출 여부와 세포질 내 난핵포(GV) 붕괴 여부 로성숙된 난자와 미성숙 난자를 구분하였다.
- 채취된 난자는 헤파린 40 IU/ml(Choongwae Pharmacology, Hwasung, Korea)와 10% Serum Protein Substitute(SPS; Sage BioPharma, USA)가 함유된 PBS(Sage BioPharma, USA)를 이용하여 2~3회 세척 후 난구세포를 벗겨내기 전 까지 10% SPS + Q-Fert(HTF)(Sage BioPharma, USA)에서 배 양하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 2007년 4월부터 2009년 4월까지 광주 미래와희 망 산부인과의원과 대전 서울여 성병 원에서 성선자극호르몬(gonadotropin)으로 과배란 유도를 하고 체외수정 시술 방법 중 세 포질내 정자 주입 법(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)을 실시한 70명의 환자들을 대상으로 하였으며, 이때 불임의 원 인 및 환자의 연령은 고려하지 않았다.
데이터처리
- 통계적 유의성 검정은 SAS(statistical analysis system)를 이용한 x2-text를 실시하여 유의성 검정을 하였고 ,<0.05 일 때 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 10% SPS가 첨가된 배양액에서 성숙시킨 난자가 80.0%의 수정율을 보였고 10% 난포액이 첨가된 배양액에서 성숙된 난 자는 78.2%, gonadotropins0) 첨가된 배양액에서 성숙된 난자 는 76.9%의 수정율을 보였다.
- 본 연구는 시험관아기 프로그램에서 난자 채취시 발생하는 미성숙 난포란의 효과적인 이용을 위하여 배양액 내 인간의 난포액과 성선자극호르몬 첨가가 체외성숙율-, 수정율 및 배 발달율에 얼마나 효과가 있는지 알아보고자 실시하였다. 난자 채취 시 회수된 성숙난자는 54.3%, 중간난자(MI) 25.6%, 미성 숙 난자(GV)가 20.0%였고 중간난자를 세포질내 정자주입술 을 시행하기 전까지 체외에서 4시간 배양했을 때 69.8%의 성 숙율을 보였다. 체외배양 28시간 째 중간단계 난자는 세 구에서 모두 성숙율 100%를 보였고 미성숙 난자는 각각 75.
- 7%의 성숙율을 보였고, 28시간 후 세가지 배양액 모두에서 100%의 성숙율을 보이며 유의적인 차이를 보이지 않았다. 미성숙 난 자(GV)의 체외 성숙율은 각각 채취 후 28시간째 75.5%, 70.5% 및 71.2%가 성숙이되어 세포질내 정자주입술을 실시할 수가 있었는데 각 구간 유의적인 차이는 보이지 않았고 오히려 기본 배양액에 10% SPS가 첨가된 구에서 조금 더 좋은 발달율 을 보였다. 이는 배양액내에 난포액과 성선자극호르몬 및 EGF를 첨가하여 유의적으로 높은 성숙율을 보였다는 결과와 다른 결과를 나타내었다.
- 미성숙난자를 각각의 배양액에 시간대 별로 배양시 4시간 후 중간난자로의 발달율은 10% hFF가 첨가된 배양액이 29.5% 로 약간 높았고, 28시간 째 배 양시 각각75.5%, 70.5%, 71.2% 의 성숙율을 보였으나 유의적인 차이는 없었다.
- 또한 배양액 내 성선자극호르몬을 첨가여 인간 미성숙 난포란 의 체외 성숙을 유도하기도 하였는데(Nagy 등, 1996; Russell 등, 1997), Son 등은 EGF(epidermal growth factor)를 추가하여 체외성숙을 하였다(Son 등, 2006; Jurenma와 Nogueira 등, 2006). 본 실험에서는 기본 배양액에 10%의 SPS, 10% hFF 및 10% SPS와 성선자극호르몬을 첨가하여 중간난자와 미성숙 난자를 배 양하면서 시간대 별로 살펴보았는데, 중간난자(MI) 를 ICSI 전 4시간 동안 배 양시 각각 24.5%, 29.5% 및 24.7%의 성숙율을 보였고, 28시간 후 세가지 배양액 모두에서 100%의 성숙율을 보이며 유의적인 차이를 보이지 않았다. 미성숙 난 자(GV)의 체외 성숙율은 각각 채취 후 28시간째 75.
- 또한 체외성숙시킨 미성숙 난자는 MⅡ의 방추사가 빨리 퇴화되고 불안정하여 핵의 질(quality)이 더 저하된다고 하였고(Combeiles 등, 2002), 장시간 체외배양조건에 노출되어 투명대(zona pellucida)경화현상이 일어나 일반적인 체외수정법은 수정율 감소 로 이어진다고 하였다(De Vos와 Van Steirteghem, 2000). 본 실험에서는 체외에서 성숙된 난자를 이용하여 세포질내 정자 주입술을 실시한 결과 수정율은 각각 80.0%, 78.2% 및 76.9% 로 오히려 10% SPS만 첨가한 배양액에서 좀 더 높은 수정율 을 보였는데, 이것은 아마도 상업적으로 판매되고 있는 기본 배양액 품질이 점점 좋아지고, 체외배양 기술이 발달하여 좀 더 높은 수정율을 보였을 거라고 생각된다. 체외성숙 난자 중 정상적으로 수정이 된 배아를 선별하여 체외배양 결과 48시 간째 6~8 세포기까지의 배 발달율은 각각 65.
- 본 연구는 대상수가 적고 환자의 연령 및 불임 원인을 고려 하지 않았으며, MI과 GV 단계 난자의 특성 과 능력에 차이를 구분하지 않고 시행을 했지만 상업적으로 판매되는 배양액 내에 합성 단백질의 첨가만으로도 충분히 미성숙 난자의 체 외성숙이 가능함을 알 수 있었다.
- 수정된 배아를 체외배양시 발달율은 표 4와 같은데 8시간 째 2세포기로 발달율은 각각 78.1%, 76.7%, 77.5%로 비슷한 발달율을 보였고 48시간째 6~8세포기로의 발달율은 각각 65.6%, 65.9%, 66.7%로 유의적인 차이가 없었다.
- 전체 1,018개의 채취된 난자를 성숙 단계별로 구분했을 때 결과는 Fig. 2와 같이 각각 성숙난자(MII) 54.3%(553개), 중간 난자(MI) 25.6%(261개), 미성숙난자(GV) 20.0%(204개)의 분포를 보였다.
- 정상적인 수정이 확인된 배아(2PN)를 체외에서 48시간 배양 했을 때 6~8세포기로의 발달율은 각각 65.6%, 65.9% 그리고 66.7%로 비슷한 발달율을 보였다.
- 채취된 중간난자를 각각의 배양액에 배양했을 때 4시간 후 각각 60.5%, 61.5%, 59.2%가 성숙난자로 발달을 하였고, 28 시간 배양 시, 세 군 모두 100% 성숙난자로 발달을 하였으며 유의적인 차이는 없었다.
- 8%의 성 숙율을 보였다. 체외배양 28시간 째 중간단계 난자는 세 구에서 모두 성숙율 100%를 보였고 미성숙 난자는 각각 75.5%, 70.5%, 71.2% 의 성숙율(MII)을 보였다.
- 9% 로 오히려 10% SPS만 첨가한 배양액에서 좀 더 높은 수정율 을 보였는데, 이것은 아마도 상업적으로 판매되고 있는 기본 배양액 품질이 점점 좋아지고, 체외배양 기술이 발달하여 좀 더 높은 수정율을 보였을 거라고 생각된다. 체외성숙 난자 중 정상적으로 수정이 된 배아를 선별하여 체외배양 결과 48시 간째 6~8 세포기까지의 배 발달율은 각각 65.6%, 65.9%, 66.7% 로 세 군 모두 비슷한 결과를 보였다.
- 체외성숙된 미성숙 난자에게 세포질내 정자주입술을 시행하여 18시간 후 수정율을 살펴봤을 때 10% SPS 가 첨가된 배양 액에서 80.0%의 수정율을 보였으나 각 처리구(78.2%, 76.9%) 간 유의적인 차이는 보이지 않았다.
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