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문제 정의
- Guaiac 혼합물 시약이 DNA 정제 및 유전자형 분석에 미치는 영향을 보기 위해 Guaiac 혼합물 시약을 처리한 희석혈흔과 처리하지 않은 희석혈흔을 준비하였다. 이는 DNA 정제부터 유전자형 분석까지 전 과정을 국립과학수사연구소 유전자분석과에 의뢰하여 실시하였다.
- 이에 본 연구에서는 LMG와 루미놀과 같은 퍼옥시다제 활성물질을 함유하고 있고 향수 등 화장품, 의약품, 진단검사시약 등의 제조에 첨가원료로 사용되어지며, 버섯 자실체 검사시약의 제조에 사용되어지고 있는 남아메리카 지역에서 자생하는 유창목 (학명 : Bulnesia sarmienti)에서 추출한 천연수지 물질인 guaiac resin 분말을 첨가하여 제조한 Guaiac 혼합물시약을 이용하여, 법의학 실험실은 물론 사건현장에서 일반적으로 사용하고 있는 LMG 시약과 민감도 특이성, 그리고 DNA 정제 및 유전자형 분석에 미치는 영향 등을 비교, 분석하여 기존 혈흔예비검사 시약들의 문제점을 해결하고자 하였다.
- 혈흔예비검사 시약과 Guaiac 혼합물 시약이 DNA 정제및 유전자형 분석에 미치는 영향을 알아보았다. 최근의 연구결과를 보면 암실 조건 하에 형광반응을 이용하여 혈흔을 검출하는 루미놀 등의 경우 아무런 시약도 처리하지 않은 혈액에 비해 50% 정도 DNA 정제 및 유전자형 분석에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었으며(Walsh 등 1992; Nussbaumer 등, 2006; Zubakov 등, 2008; Marrone 등, 2009), Lim 등 (2004)은 루미놀 등을 제외한 LMG 등 대부분의 혈흔예비검사 시약의 경우 DNA 정제 및 유전 자형 분석이 불가능하다는 연구결과를 보고하였다.
제안 방법
- 2009년 1월에 채취하여 상온에서 4개월간 혈액반이 아닌 액체상태로 보관하여 부패시킨 100배 희석한 혈액과 균액을 1:1 비율로 혼합한 검체와 혼합하지 않은 균 부유액 두 가지를 각각 LMG와 Guaiac 혼합물 시약에 적용하여 미생물의 영향을 평가하였다.
- 혈흔의 보관온도 및 시간에서의 안전성을 관찰하기 위해 혈액을 100배 희석하여 다양한 온도(-20℃, 4℃, 상온, 37℃, 56℃)에서 보관하면서 1주와 2주 후 LMG와 Guaiac 혼합물 시약에 적용, 반응 결과를 비교하였다. 96℃에서 5분, 10분, 15분, 20분간 끓인 후 두 시약에 적용하여 열 안전성을 평가하였다. 오염세균에 대한 안전성을 평가하기 위하여 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli를 멸균증류수에 0.
- 혈흔예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약의 비특이적반응(위양성 반응)을 알아보기 위해 채소류(무, 시금치, 양배추 등) 및 과일류(오렌지, 참외 등) 25종의 조각 및 채소즙과 과일즙 원액, 상품화된 주방 및 세탁세제 8종, 화학약품 및 금속류(CuSO4 등 14종), 부패미생물(Staphylococcus aureus 등 3종)을 준비하였다. 또한 Guaiac 혼합물 시약이 DNA정제 및 유전자형 분석에 미치는 영향을 보기 위해 Guaiac 혼합물 시약을 처리한 희석혈흔과 처리하지 않은 희석혈흔을 준비하였다.
- Guaiac 혼합물 시약이 DNA정제와 유전자감식에 미치는 영향을 보고자 혈흔(5 μL, 10 μL) 및 K562 DNA 10 μL에 Guaiac 혼합물 시약 30 μL를 첨가한 후 상용 DNA 분리 키트(QIA quick micro kit, Qiagen Co.)를 이용해 DNA를 정제하였다.
- 대조로 Guaiac 혼합물 시약을 처리하지 않은 혈흔(5 μL, 10 μL)을 이용하였다.
- 혈흔예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약의 비특이적반응(위양성 반응)을 알아보기 위해 채소류(무, 시금치, 양배추 등) 및 과일류(오렌지, 참외 등) 25종의 조각 및 채소즙과 과일즙 원액, 상품화된 주방 및 세탁세제 8종, 화학약품 및 금속류(CuSO4 등 14종), 부패미생물(Staphylococcus aureus 등 3종)을 준비하였다. 또한 Guaiac 혼합물 시약이 DNA정제 및 유전자형 분석에 미치는 영향을 보기 위해 Guaiac 혼합물 시약을 처리한 희석혈흔과 처리하지 않은 희석혈흔을 준비하였다.
- 본 연구에서는 대변 내 잠혈을 검출하는 시약(Johne 등, 2001; Kronborg, 2002; Gondal 등, 2003; Hoff 등, 2004)등에 이용되고 있는 Guaiac resin을 첨가하여 제조한 혼합물 시약으로 LMG와 루미놀 등 기존 시약들의 문제점을 해결하여 법의학적 혈흔검사 시약으로 적용하였다.
- 정제된 DNA는 2% agrose gel에서 control DNA(K562)와 함께 전기영동 및 EtBr(ethidium bromide) 염색 후 image analyzer를 이용해 육안으로 확인한 후, 인간 DNA 정량키트(Quantifiler Human DNA Quantification kit, Applied Biosystems) 및 실시간 PCR 장비(7500 Real-time PCR system, Applied Biosystems)을 이용하여 정량하는 방법을 병행하였다.
- 정제된 DNA의 유전자형 분석은 AmpFISTR identifiler kit(Applied Biosystems)을 GeneAmp 9700 system(Applied Biosystems)으로 PCR하고, ABI prism Genetic analyzer 3730(Applied Biosystems)으로 분석하였으며, 그 결과를 GeneMapper Softwear(Applied Biosystems)를 이용해 유전자형의 결과를 관찰하였다.
- 혈흔예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약의 민감도 측정을 위해 먼저 신선한 전혈을 1/10배씩 계단 희석해 직경 5 mm의 거름종이 등 6종에 10 μL씩 떨어뜨린 후 건조하였다.
- 혈흔예비검사 시약의 혈흔 특이성을 알아보기 위하여 채소 및 과일류의 조각 및 원액즙, 상품화된 주방세제 및 세탁세제, 화학물질류, 금속류를 동량으로 100배 희석된 혈흔과 혼합한 시료와 혼합하지 않은 시료를 거름종이 위에 놓고 LMG와 Guaiac 혼합물 시약을 떨어뜨려 육안으로 색의 변화를 관찰하였으며, 위음성이나 위양성의 결과를 보인 경우 FOB test kit(Asan Pharm Co. Ltd, Seoul, Korea)로 확인 시험을 하였다.
- 혈흔의 보관온도 및 시간에서의 안전성을 관찰하기 위해 혈액을 100배 희석하여 다양한 온도(-20℃, 4℃, 상온, 37℃, 56℃)에서 보관하면서 1주와 2주 후 LMG와 Guaiac 혼합물 시약에 적용, 반응 결과를 비교하였다. 96℃에서 5분, 10분, 15분, 20분간 끓인 후 두 시약에 적용하여 열 안전성을 평가하였다.
- 혈흔의 유류대상 별 검출 감도를 보기 위해 100배 희석된 혈흔 10 μL를 떨어뜨려 건조한 시료(여과지 등 7종)와 신선한 혈액에 증류수를 이용하여 연속적으로 10배씩 계단 희석하여 준비한 혈흔 시료에 혈흔 예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약을 처리하고 육안으로 색의 변화를 관찰하여 각 시약별 검출 한계를 결정하였다.
대상 데이터
- 96℃에서 5분, 10분, 15분, 20분간 끓인 후 두 시약에 적용하여 열 안전성을 평가하였다. 오염세균에 대한 안전성을 평가하기 위하여 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli를 멸균증류수에 0.5 McFaland 탁도로 부유하여 사용하였다(신 등, 1999). 2009년 1월에 채취하여 상온에서 4개월간 혈액반이 아닌 액체상태로 보관하여 부패시킨 100배 희석한 혈액과 균액을 1:1 비율로 혼합한 검체와 혼합하지 않은 균 부유액 두 가지를 각각 LMG와 Guaiac 혼합물 시약에 적용하여 미생물의 영향을 평가하였다.
- 이 연구에 사용된 혈흔예비검사 시약 제조에 필요한 LMG(Sigma-Aldrich Corp., Louis, USA) 및 glacial acetic acid(Sigma-Aldrich Corp), 30% H2O2(Sigma-Aldrich Corp), Gum guaiac 분말시약(Hayashi Inc. Osaka, Japan) 그리고 ethanol(Samchun Inc. Sungnam, Korea)을 사용하여 제조하였으며, 각 시약의 사용설명서에 따라 제조하였으며, 전개액으로 0.1% Tween 20을 사용하였다, 어떠한 반응도 나타나지 않은 경우나, 후크(hook) 효과에 의해 위음성이나 위양성의 결과를 보인 경우 FOB test kit(Asan Pharm Co. Ltd, Seoul, Korea)로 확인 시험을 하였다(Table 1).
- 혈흔예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약의 민감도 측정을 위해 먼저 신선한 전혈을 1/10배씩 계단 희석해 직경 5 mm의 거름종이 등 6종에 10 μL씩 떨어뜨린 후 건조하였다. 혈흔예비검사 시약 LMG와 Guaiac 혼합물 시약의 비특이적반응(위양성 반응)을 알아보기 위해 채소류(무, 시금치, 양배추 등) 및 과일류(오렌지, 참외 등) 25종의 조각 및 채소즙과 과일즙 원액, 상품화된 주방 및 세탁세제 8종, 화학약품 및 금속류(CuSO4 등 14종), 부패미생물(Staphylococcus aureus 등 3종)을 준비하였다. 또한 Guaiac 혼합물 시약이 DNA정제 및 유전자형 분석에 미치는 영향을 보기 위해 Guaiac 혼합물 시약을 처리한 희석혈흔과 처리하지 않은 희석혈흔을 준비하였다.
성능/효과
- DNA를 분리 후 2% agarose 전기영동과 real-time PCR로 DNA를 정량하였을 때 Guaiac 혼합물 시약을 처리한 혈흔 시료가 처리하지 않은 시료에 비해 약 10% 정도 회수율이 감소하였으나, 이는 PCR에 있어서는 별다른 차이를 보이지 않았으며(Fig 3), DNA profiling에 있어서도 별다른 차이 없이 유전자형이 검출 및 분석 가능하여 Guaiac 혼합물 시약은 범죄현장에서 채취한 혈흔에 대해 예비검사 시약으로 사용하여도 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig 4).
- Guaiac 혼합물 방법에서는 락스를 제외한 6종류의 주방 및 세탁세제 자체는 모두 음성의 결과를 보였으며, 혈액이 혼합된 경우에는 모두 양성이 보여 이 주방 및 세탁 세제들이 반응에 영향을 주지 않음이 관찰되었다. 반면 LMG 방법에서는 혈흔이 포함되지 않은 주방세제, 세탁 세제(분말․용해액), 액상세제(피죤)에서 위양성을 보였으며 락스의 경우 혈액을 혼합한 경우에도 위음성의 결과를 보였다(Table 4).
- Guaiac 혼합물 시약법은 FeCl3, CuSO4, iodine 등에서 위양성, sodium peroxide(Na2O2), fuschin acid 등에서 위음성의 결과를 보였으나, 혈액을 함유한 경우 양성의 결과를 나타났다.
- 최근의 연구결과를 보면 암실 조건 하에 형광반응을 이용하여 혈흔을 검출하는 루미놀 등의 경우 아무런 시약도 처리하지 않은 혈액에 비해 50% 정도 DNA 정제 및 유전자형 분석에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었으며(Walsh 등 1992; Nussbaumer 등, 2006; Zubakov 등, 2008; Marrone 등, 2009), Lim 등 (2004)은 루미놀 등을 제외한 LMG 등 대부분의 혈흔예비검사 시약의 경우 DNA 정제 및 유전 자형 분석이 불가능하다는 연구결과를 보고하였다. 그러나 Guaiac 혼합물 시약의 경우 시약을 처리한 혈흔 시료가 처리하지 않은 시료에 비해 약 10% 정도 DNA 회수율이 감소하였으나, 이는 PCR에 있어서는 별다른 차이를 보이지 않았으며, DNA profiling에 있어서도 별다른 차이 없이 유전자형이 검출 및 분석 가능하여 범죄현장에서 채취한 혈흔에 대해 예비검사 시약으로 사용하여도 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- Guaiac 역시 병원에서 대변 내 잠혈검사에서 금속류나 육류섭취, 시금치 등 대부분의 채소류나 과일 등에도 반응할 수 있어 대장암 1차 선별검사에서 위양성을 보일 수있다고 보고되고 있다(Mandel 등, 2000; Vilkin 등, 2005;Smith 등, 2006; Yoo 등, 2009). 그러나 본 시험에서는 우리가 흔히 섭취하는 버섯과 양배추, 무를 제외한 채소류나 과일 21종에 대해서 교차반응을 보이지 않고 두 시약 모두 특이성이 뛰어난 것으로 나타났으며, 무우, 양배추, 버섯의 경우 조리되지 않은 상태에서는 위양성을 보였으나, 조리된 상태에서는 반응을 하지 않아 실제 사건 현장 에서는 대부분 조리된 상태로 섭취한 경우가 대부분이므로 병원에서의 위양성 반응의 경우가 실제 법의학적 검사용으로 적용하는데 크게 문제가 되지 않을 것으로 판단된다. 금속류나 화학물질에 있어서는 LMG의 경우 현저하게 특이성이 떨어지는 반면, Guaiac 혼합물의 경우몇 가지 금속과 화학물질을 제외한 대부분에서 더 우수한 결과를 보였으며, 위양성을 보인 경우에는 매 시험마다 Guaiac 혼합물과 특이성과 민감도가 우수한 면역크로 마토그래피 검사원리의 인혈확인 검사를 실시(Castiglione 등, 1992; Lim 등, 2004)한다면 해결될 수 있을 것으로 판단된다.
- 반면 LMG 방법에서는 혈흔이 포함되지 않은 주방세제, 세탁 세제(분말․용해액), 액상세제(피죤)에서 위양성을 보였으며 락스의 경우 혈액을 혼합한 경우에도 위음성의 결과를 보였다(Table 4).
- 본 연구결과에서도 Guaiac 혼합물 시약의 민감도는 최소 1×105배 까지 희석된 혈액도 검출 가능하였으며, 이는 Lim 등(2004)이 보고한 최소 1×108배 까지 희석된 혈액까지 검출 가능한 기존 혈흔예비시험 시약인 LMG보다 훨씬 더 우수한 결과를 보였다.
- 야채 및 과일 25종에 대해서는 절단, 파쇄하지 않은 상태에서는 모두 음성의 결과를 보였으나, 절단하거나 파쇄한 경우 Guaiac 혼합물 시약은 무우, 양배추에서 위양성,LMG 시약의 경우 버섯, 양배추에서 위양성을 보였으나, human blood test kit(FOB kit) test 결과 음성의 결과를 나타냈다. 또한 대부분의 사람들이 위의 채소 등을 조리된 상태로 섭취하는 경우가 많으므로 100℃에서 30분간 조리 후 두 가지 시약 모두에 다시 적용한 경우에는 음성의 결과를 보여 이는 조리되지 않은 상태에서는 peroxide 활성물질을 함유하고 있는 관계로 위양성의 결과를 보였으나 조리된 상태에서는 peroxide 활성물질이 모두 파괴되어 음성으로 관찰되었다(Data not shown).
- 혈흔의 유류대상에 따른 검출 감도를 보기 위해 100배 희석된 혈흔 10 μL를 떨어뜨려 건조한 시료(여과지 등 7종)와, 연속적으로 10배씩 희석한 혈흔에 대한 민감도 분석 결과 혈흔이 유류된 대상에 관계없이 두 시약 청색으로 발색반응 하는 것을 관찰하였으며(Table 2, Fig 2), Guaiac 혼합물 시약의 경우 100,000배 희석된 혈흔 10 μL까지 검출, 발색 변화를 육안으로 식별할 수 있었으며, 이는 동일한 시료의 LMG 시약의 결과와 크게 차이를 보이지 않았다(Table 3).
후속연구
- 금속류나 화학물질에 있어서는 LMG의 경우 현저하게 특이성이 떨어지는 반면, Guaiac 혼합물의 경우몇 가지 금속과 화학물질을 제외한 대부분에서 더 우수한 결과를 보였으며, 위양성을 보인 경우에는 매 시험마다 Guaiac 혼합물과 특이성과 민감도가 우수한 면역크로 마토그래피 검사원리의 인혈확인 검사를 실시(Castiglione 등, 1992; Lim 등, 2004)한다면 해결될 수 있을 것으로 판단된다.
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