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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 항암활성이 높다고 알려진 상황버섯, 영지버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체를 인삼에 직접 접종하여 발효시킨 다음 발효인삼 추출물이 인체유래 6종의 암세포(위암, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 간암) 증식에 미치는 영향을 살펴보고 암 예방식품으로서의 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co., NY, USA)과 DMEM(Gibco Co.) medium을 사용하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다.
- 균사체로 발효된 인삼 중에 함유된 유용성분을 추출하기 위하여 시료 3 g에 80% ethanol 100 mL를 가하고 80℃에서 3시간 동안 3회 환류추출 한 다음 감압여과 하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과된 추출물은 회전진공농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)로 40℃에서 농축하여 용매를 완전히 제거한 다음 냉동건조 하여 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 인삼은 4년근 파생삼으로 2008년 증평군 인삼농가에서 구입한 후 수돗물로 수세하여 48시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 인삼 1뿌리가 들어가는 시험관(50×200 mm)에 넣고 밀봉한 후 121℃에서 2시간 동안 멸균기(Aqua Science DR-1205, Seoul, Korea)로 멸균하고 방랭한 다음 균사체 발효 기질로 사용하였다. 멸균인삼에 균사체 1차 종배양액(MCM 혼합배지)을 각각 20 mL씩 무균접종한 다음 배양기(Vision Scientific VS-3DM, Buchon, Korea)에서 상황버섯 균사체와 영지버섯 균사체 발효온도는 30℃, 노루궁뎅이버섯 균사체 발효온도는 25℃에서 각각 30일간 발효시킨 다음 동결건조(Ilshin FT-8512, Suwon, Korea)하여 분석용 시료로 사용하였다.
- 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT시약을 well당 10 μL씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO) 100 μL를 가한 후 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader(ELx808, Bio-tekⓇ Inc., HighlandPark, USA)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 상황버섯, 영지버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체로 발효된 인삼추출물이 암세포증식에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 위암세포(MKN-45), 대장암세포(HCT116), 유방암세포(MCF-7), 폐암세포(NCIH460), 전립선암세포(PC-3) 및 간암세포(HepG2)에 농도별(0.25～1.5 mg/mL)로 처리하여 암세포 성장억제율을 측정하였다. 전립선암 세포에서의 암세포 증식억제 효과는 영지버섯 균사체발효 인삼추출물이 1.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 공시균주는 상황버섯(Phellinus linteus), 영지버섯(Ganoderma lucidium) 및 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum) 균사체로 충북농업기술연구원에서 분양 받아 충주대학교 생화학실험실에서 mushroom complete media(MCM) 혼합배지를 사용하여 각 균주별 배양조건으로 1차 종 배양을 실시한 후 본 배양에 사용하였으며, 혼합배지 조성은 배지 1 L당 K2HPO4 7 g, KH2PO4 3.22 g, MgSO4·7H2O 3.5 g, glucose 140 g, peptone 14 g 및 yeast 14 g이었다.
- 본 실험에 사용된 인삼은 4년근 파생삼으로 2008년 증평군 인삼농가에서 구입한 후 수돗물로 수세하여 48시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 인삼 1뿌리가 들어가는 시험관(50×200 mm)에 넣고 밀봉한 후 121℃에서 2시간 동안 멸균기(Aqua Science DR-1205, Seoul, Korea)로 멸균하고 방랭한 다음 균사체 발효 기질로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 암세포는 MKN-45(stomach adenocarcinoma: KCLB 80103), HCT116(colorectal carcinoma: KCLB 10247), MCF-7(mammary gland adenocarcinoma: KCLB 30022), NCIH460(lung large cell carcinoma: KCLB 30177), PC-3(prostate adenocarcinoma: KCLB 21435) 및 HepG2(liver hepatoblastoma KCLB 88065)이었으며, 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co.
데이터처리
- 통계분석은 SPSS Ver 12.0 package program을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하고 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 Ishiyama 등(19)의 방법에 따라 MTT assay로 실험하였다. 즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물을 100 μL를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두 0.25와 0.5 mg/mL의 저농도에서는 위암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 1 mg/mL 농도에서는 각각 58.
- 균사체발효 인삼추출물에 대한 인체유래 간암세포(HepG2)의 성장억제에 미치는 효과를 살펴본 결과, 3가지 균사체발효 인삼추출물은 처리 농도가 증가할수록 간암세포 성장억제율도 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 6). 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 0.
- 균사체발효 인삼추출물에 대한 인체유래 대장암세포(HCT116)의 성장억제율을 측정한 결과, 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물은 농도 의존적으로 대장암세포 성장을 억제하지 못한 반면 영지버섯 균사체발효 인삼추출물에서는 농도 의존적으로 대장암세포 성장억제 효과를 나타내었다(Fig. 2). 또한, 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두, 저농도에서는 위암세포와 마찬가지로 대장암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
- 균사체발효 인삼추출물이 인체유래 전립선암세포(PC-3) 성장억제에 미치는 영향을 살펴본 결과(Fig. 5), 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 0.25와 0.5 mg/mL의 낮은 농도에서는 암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 1.
- 5 mg/mL의 저농도에서는 위암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 1 mg/mL 농도에서는 각각 58.26, 66.45 및 51.30%의 생존율을 보여 암세포의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다. 특히 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 1.
- 또한, 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두, 저농도에서는 위암세포와 마찬가지로 대장암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 1 mg/mL 농도에서도 암세포의 생존율은 각각 72.45 및 68.18%이었지만 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 1 및 1.5 mg/mL 농도에서 각각 36.31 및 3.73% 생존율을 보여 유의적으로 높은 성장억제율을 나타내었다. Cha 등(22)은 대장암 세포 HCT-15와 위암세포 AGS에 차가버섯추출물을 0.
- 5 mg/mL의 낮은 농도에서는 암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 1.5 mg/mL 농도에서 각각 44.29 및 35.05%의 생존율을 보여 전립선암세포의 성장을 많이 억제하는 것으로 나타났다. 특히 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 1.
- 2). 또한, 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두, 저농도에서는 위암세포와 마찬가지로 대장암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 상황버섯 및 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우 1 mg/mL 농도에서도 암세포의 생존율은 각각 72.
- 67%의 생존율을 보여 성장억제 효과가 매우 높게 나타났다. 상황버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 1 및 1.5 mg/mL의 농도에서 각각 76.43 및 53.52%의 생존율을 보였으며, 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물은 저농도(0.25와 0.5 mg/mL)에서는 성장억제 효과가 적었으나 고농도인 1.5 mg/mL에서는 35.27%의 낮은 생존율을 나타내었다. Kim 등(25)의 연구에 의하면 영지버섯 추출물이 다른 버섯에 비하여 높은 항암활성을 갖는다고 보고하였는데 본 실험에서도 영지버섯 균사체발효 인삼추출물이 다른 버섯균사체보다 높은 암세포억제 효과가 있었다.
- 57%를 나타내었다. 세 가지 균사체발효 인삼추출물 모두 간암세포 성장억제 효과가 높은 것으로 나타났으며, 특히 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 간암세포 성장억제 효과가 매우 높게 나타났다. Park 등(13)의 연구에서는 간암세포(Hep3B)에 인삼박으로 배양된 영지버섯 균사체 추출물 2.
- 75% 생존율을 보여 3종의 균사체 가운데 가장 높은 암세포 성장억제율을 나타내었다. 위암세포(AGS) 성장에 대한 능이버섯 추출물의 억제효과의 경우 1～2 mg/mL의 농도에서 68.5～70.8% 범위의 성장억제 효과를 보고하였는데(20) 본 연구에 사용된 버섯균사체와는 다르지만 인삼을 균사체로 발효시킬 경우 원료인삼보다 항암활성이 증가함을 확인할 수 있었다. 원료인삼의 구성사포닌 함량은 22.
- 27%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과로부터 영지버섯 균사체로 발효시킨 인삼추출물이 다른 균사체 인삼발효물보다 다양한 암세포에 대한 성장억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 3종의 버섯 균사체발효 인삼추출물이 6종의 암세포에 대하여 성장을 억제하는 효과가 있었으며, 특히 영지버섯 균사체발효 인삼추출물이 가장 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 영지버섯의 대표적인 생리활성 물질인 polysaccharide와 triterpene류가 갖는 항염증작용, 혈당 강하작용, 면역증강작용 및 항종양작용 등에 의한 효과(27)와 영지버섯 균사체를 인삼에 배양할 경우 항암활성이 높은 사포닌류(Rg3 등)의 생성(21) 그리고 여러 가지 다양한 유용물질들 로 새롭게 생성되었거나 그 양이 증가되었기 때문이라 생각되어진다.
- 인체유래 유방암세포(MCF-7)의 성장억제에 대한 균사체발효 인삼추출물의 효과를 살펴본 결과, 영지버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 1 mg/mL의 농도에서 17.1%로 매우 낮은 암세포 생존율을 나타내었다(Fig. 3). 이러한 결과는 세포주는 다르지만 영지버섯 추출물이 자궁암세포주에 대하여 5 mg/mL 이하의 농도에서도 성장억제 효과가 있다는 Song 등(23)의 연구결과보다 높게 나타났다.
- 인체유래 폐암세포(NCIH460) 성장억제에 대한 균사체발효 인삼추출물의 영향을 살펴본 결과는 Fig. 4와 같이 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두, 농도 의존적으로 폐암세포 성장억제효과를 나타내었다. 특히, 영지버섯 균사체발효 인삼추출물은 1 mg/mL의 농도에서 4.
- 5 mg/mL)로 처리하여 암세포 성장억제율을 측정하였다. 전립선암 세포에서의 암세포 증식억제 효과는 영지버섯 균사체발효 인삼추출물이 1.5 mg/mL 농도에서 3.07%로 가장 낮은 생존율을 나타내었으며, 상황버섯 균사체발효 인삼추출물이 35.05%, 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물이 44.29%의 생존율을 보였다. 폐암세포에 대한 세 가지 버섯균사체발효 인삼추출물의 1.
- 4와 같이 3종의 균사체발효 인삼추출물 모두, 농도 의존적으로 폐암세포 성장억제효과를 나타내었다. 특히, 영지버섯 균사체발효 인삼추출물은 1 mg/mL의 농도에서 4.67%의 생존율을 보여 성장억제 효과가 매우 높게 나타났다. 상황버섯 균사체발효 인삼추출물의 경우는 1 및 1.
- 29%의 생존율을 보였다. 폐암세포에 대한 세 가지 버섯균사체발효 인삼추출물의 1.5 mg/mL 농도에서 영지버섯 균사체발효 인삼추출물은 5.31%로 우수한 항암활성을 나타낸 반면, 상황버섯 균사체발효 인삼추출물이 53.52%, 노루궁뎅이버섯 균사체발효 인삼추출물이 35.27%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과로부터 영지버섯 균사체로 발효시킨 인삼추출물이 다른 균사체 인삼발효물보다 다양한 암세포에 대한 성장억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과는 영지버섯의 대표적인 생리활성 물질인 polysaccharide와 triterpene류가 갖는 항염증작용, 혈당 강하작용, 면역증강작용 및 항종양작용 등에 의한 효과(27)와 영지버섯 균사체를 인삼에 배양할 경우 항암활성이 높은 사포닌류(Rg3 등)의 생성(21) 그리고 여러 가지 다양한 유용물질들 로 새롭게 생성되었거나 그 양이 증가되었기 때문이라 생각되어진다. 따라서 향후 버섯 균사체 발효 인삼추출물의 특정 사포닌류에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다.
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