탈지 미강으로부터 미강단백질을 추출하고 상업용 단백분해 효소로 가수분해하고 한외여과하여 얻어진 미강단백질 가수분해물을 Sephadex G-15로 분리하여 얻어진 peptide fraction에 칼슘, 철분을 binding하여 칼슘, 철분 함유 peptide를 제조하였다. 추출된 탈지 미강 단백질의 분자량은 10~66 kDa에 분포하고 있었다. 추출된 단백질을 Flavourzyme으로 가수분해 시, 최적 가수분해 시간은 6시간이었으며, 5kDa 이하로 한외여과 하여 얻어진 peptide를 Sephadex G-15로 분획한 결과 4개의 major peak를 얻었는데, 각 fraction의 칼슘, 철분을 binding한 결과 Ca/peptide는 FI에서, Fe/peptide는 F2에서 가장 많은 함량을 나타내었다. 본 연구 결과 얻어진 칼슘, 철분 binding peptide는 biomineral 기능성 식품의 소재로써 식품산업에 활용될 수 있다고 판단된다.
탈지 미강으로부터 미강단백질을 추출하고 상업용 단백분해 효소로 가수분해하고 한외여과하여 얻어진 미강단백질 가수분해물을 Sephadex G-15로 분리하여 얻어진 peptide fraction에 칼슘, 철분을 binding하여 칼슘, 철분 함유 peptide를 제조하였다. 추출된 탈지 미강 단백질의 분자량은 10~66 kDa에 분포하고 있었다. 추출된 단백질을 Flavourzyme으로 가수분해 시, 최적 가수분해 시간은 6시간이었으며, 5kDa 이하로 한외여과 하여 얻어진 peptide를 Sephadex G-15로 분획한 결과 4개의 major peak를 얻었는데, 각 fraction의 칼슘, 철분을 binding한 결과 Ca/peptide는 FI에서, Fe/peptide는 F2에서 가장 많은 함량을 나타내었다. 본 연구 결과 얻어진 칼슘, 철분 binding peptide는 biomineral 기능성 식품의 소재로써 식품산업에 활용될 수 있다고 판단된다.
Calcium and iron binding peptides were prepared by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration of rice bran protein (RBP), which was isolated from defatted rice bran by phytase and xylanase treatment and ultrasonication. The isolated RBP had a molecular weight in the range of 10-66 kDa. The extracted p...
Calcium and iron binding peptides were prepared by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration of rice bran protein (RBP), which was isolated from defatted rice bran by phytase and xylanase treatment and ultrasonication. The isolated RBP had a molecular weight in the range of 10-66 kDa. The extracted proteins were hydrolyzed using Flavourzyme for 6 hr. After ultrafiltration under 5 kDa as molecular weight, the peptides were fractionated into 4 peaks by Sephadex G-15 gel permeation chromatography, and each fraction was determined for calcium and iron binding activity. As the result, Fl and F2 fractions were the best candidate for calcium and iron chelation, respectively. These results suggest that the calcium and iron binding peptides can be used as functional food additives in food industry.
Calcium and iron binding peptides were prepared by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration of rice bran protein (RBP), which was isolated from defatted rice bran by phytase and xylanase treatment and ultrasonication. The isolated RBP had a molecular weight in the range of 10-66 kDa. The extracted proteins were hydrolyzed using Flavourzyme for 6 hr. After ultrafiltration under 5 kDa as molecular weight, the peptides were fractionated into 4 peaks by Sephadex G-15 gel permeation chromatography, and each fraction was determined for calcium and iron binding activity. As the result, Fl and F2 fractions were the best candidate for calcium and iron chelation, respectively. These results suggest that the calcium and iron binding peptides can be used as functional food additives in food industry.
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문제 정의
따라서 기존의 철분이나 칼슘제재를 대체하고자 본 연구에서는 저렴하고 쉽게 활용 가능한 새로운 식물성 단백질원으로써 미강 단백질을 추출하고 가수분해하여 칼슘과 철분을 chelate 하여 얻어진 bioactive peptides를 분리함으로써, 향후 기능성 식품 소재 활용을 위한 기초연구로써의 연구결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
미강 단백질 가수분해물은 deamination이 일어나 negative chaige를 띄기 쉽기 때문에 칼슘이나 철분과 같은 divalent metal ion과 반응하기 쉽다[Hnada, 2000], 따라서 가수분해물 중에서 분자량이 작은 peptide가- bindinge키는 activity가 높고 또한 체내 활용과 흡수가 더 높기에, 본 연구에서는 5kDa 분자량 이하로 가수분해물을 한외여과 하였다. Flavourzyme에 의해 얻어진 가수분해물은 한외여과 후 gel filtration chromatoghy를 사용하여 분획을 실시하였는데 elution 결과 4개의 major peak를 얻었다 (Fig. 4). 또한 각 cKod에 calcium 사ride와 iron chloride를 첨가하여 칼슘과 철분의 binding activity와 titrobenzerlie acidQNBS) asy를 이용하여 peptide 함량을 측정한 결과 (Table 1), 각 fctction 별 tide 함량의 차이는 없었지만 fraction Fl과 F2에서 0.
단백질가수분해 효소로는 Flavourzyme(perg oryzae, activity 500LAPU/g protein)을 기질대비 50:1의 비율로 첨가하여 shaking incubator에서 50。에서 S시간 동안 가수분해를 실시하였다. 가수분해 종료 후 효소 반응을 정지시키기 위해 90P에서 5분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후 4, 500xg에서 20 분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액을 Pellicon XL(Millipore Co, Billeica, MA, USA)을 이용하여 한외여과하여 molecular weight 5,000 Da 이하만을 취한 후 동결건조 하였다.
244 mM을 보였다. 가수분해를 시작한 2시간 후에 50% 정도가 분해되었고 6시간 후에는 분해율이 급격히 줄어들었기에 최적 가수분해 시간을 6시간으로 설정하였다.
미강단백질의 가수분해는 Lee와 Song[2009]의 방법에 따라 실시하였다. 동결건조된 미강 단백질을 lOmM sodium phosphate bufifer(pH 7.0)에 5%(w/v)가 되도록 용해시켜 제조한 후 4, 500xg에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취해 가수분해를 위한 기질로 사용하였다. 단백질가수분해 효소로는 Flavourzyme(perg oryzae, activity 500LAPU/g protein)을 기질대비 50:1의 비율로 첨가하여 shaking incubator에서 50。에서 S시간 동안 가수분해를 실시하였다.
미강 단백질 가수분해물은 deamination이 일어나 negative chaige를 띄기 쉽기 때문에 칼슘이나 철분과 같은 divalent metal ion과 반응하기 쉽다[Hnada, 2000], 따라서 가수분해물 중에서 분자량이 작은 peptide가- bindinge키는 activity가 높고 또한 체내 활용과 흡수가 더 높기에, 본 연구에서는 5kDa 분자량 이하로 가수분해물을 한외여과 하였다. Flavourzyme에 의해 얻어진 가수분해물은 한외여과 후 gel filtration chromatoghy를 사용하여 분획을 실시하였는데 elution 결과 4개의 major peak를 얻었다 (Fig.
분획된 시료는 214nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였다. 분리된 각각의 fraction에 대해 칼슘, 철분에 대한 결합능과 펩타이드 농도를 측정하였다.
Trinitrobenzensulfonic acid(TNBS) method [Eklund, 1976]를 이용하여 available amino group 함량을 측정하였다. 시료에 IM sodium borate bufier(pH 9.2)를 첨가한 후 5 mM trinitrobenzensulfonic acid와 혼합하여 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 18mM sodium sulfitefNazSOQ와 2M monobasic sodium phosphate(NaH2PO4)S- 첨가하여 반응을 정지시키고 spectrophotometer# 사용하여 420nm에서 흡광도를 측정함으로써 peptide 함량을 계산하였다.
탈지미강 단백질의 추출. 탈지미강 단백질의 추출은 Wang 등 [1999]의 방법을 변형하여 수행하였다(Fig. 1). 탈지미강 100g 을 10배의 deionized watei에 용해시킨 후, phytase와 xylanase 를 첨가하여 pH 5.
대상 데이터
실험재료. 본 실험에 사용된 탈지미강은 (주)세림현미에서 제공 받아 사용하였다.
SDS-PAGE는 Laemmliμ970]의 방법을 따라 실시하였으며 15% separating gel과 5% stacking gel을 사용하였다. 표준 분자량 markeit- lysozyme(14.4 kDa), trypsin inhibitor1.5 kDa), carbonic anhydrase(31 kDa), ovalbumin(45 kDa), bovine serum albumin(66.2 kDa), phosphorylase b(97kDa)을 사용하였다.
데이터처리
2)Means in the same column followed by different letters are significantly (p<0.05) different by Duncan's multiple range test.
통계처리. 모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 土 표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SAS(Statistical Analysis System program, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 각 처리구 간의 유의성3<0.05)검증을 위해 분산분석 (analysis of variance, ANOVA) 후 Duncan's multiple range test로 다중비교를 실시하였다.
이론/모형
electrophoresis. SDS-PAGE는 Laemmliμ970]의 방법을 따라 실시하였으며 15% separating gel과 5% stacking gel을 사용하였다. 표준 분자량 markeit- lysozyme(14.
Peptide 함량 측정. Trinitrobenzensulfonic acid(TNBS) method [Eklund, 1976]를 이용하여 available amino group 함량을 측정하였다. 시료에 IM sodium borate bufier(pH 9.
가수분해물의 제조. 미강단백질의 가수분해는 Lee와 Song[2009]의 방법에 따라 실시하였다. 동결건조된 미강 단백질을 lOmM sodium phosphate bufifer(pH 7.
5 mM calcium chloride(CaC12)와 ferrous chloride(FeCL)를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 침전물을 제거하기 위해 4, 500xg에서 20 분간 원심분리 하여 얻어진 상등액으로 칼슘함량은 ortho- cresolphthalein complexone 을 이용한 colorimetric method [Gitelman, 1967]로 측정하고, 철분함량은 ortho-phenanthroline 을이 용한 colorimetric method[Harris, 1996]로 측정하였다.
성능/효과
4). 또한 각 cKod에 calcium 사ride와 iron chloride를 첨가하여 칼슘과 철분의 binding activity와 titrobenzerlie acidQNBS) asy를 이용하여 peptide 함량을 측정한 결과 (Table 1), 각 fctction 별 tide 함량의 차이는 없었지만 fraction Fl과 F2에서 0.032 mM로 가장 많은 함량을 나타내었다. 또한 칼슘 함량의 측정 결과 F1에서 0.
미강 단백질의 가수분해 정도를 분석하기 위해 SDS-PAGE를 실시한 결과(Fig.3), 가수분해 시간이 증가하면서 미강 단백질의 분자량이 10kDa 이하로 감소함을 확인할 수 있었는데, 이것은 가수분해시간이 증가하면서 단백질이 가수분해 되어 저분자량 펩타이드 양이 증가함을 보여주는 것이다. 그러나 55kDa 과 40kDa의 일부 단백질의 경우 가수분해 시간이 증가해도 단백질의 분해가 진행되지 않았는데, 이것은 미강에서 유지를 추출할 때 높은 압력과 온도에 의해 미강단백질이 변성됨에 따라서 가수분해가 잘 이루어지지 않은 것으로 판단된다.
0005mM<>] 측정되어 F1 이 가장 높은 값을 나타내었다. 철분 함량의 측정 결과 F서 철분 함량이 0.0096±0.0002 mM로 가장 많은 것으로 확인되었다. Caeptide와 Fe/peptide는 각각 F1에서 0.
미강단백질 가수분해물 제조. 추출 된 미강단백질을 Flavounyme에 의해 8시간까지 가수분해하여 각 시간마다 TNBS assay로 peptide 함량을 측정한 결과, 가수분해 시간이 증가함에 따라 available amino group concentration이 증가하였다(Fig. 3A). 가수분해 전에 available amino group 농도는 2.
후속연구
따라서 F1과 F서 칼슘, 철분의 binding activitye]- 가장 높은 것으로 확인되었는데, 이것은 저분자량 peptide의 amino acid 중에서 특히, Asp, Glu, His에 의해 영향을 받아 binding activity/F 다른 fia&r에 비해 높았을 것이라고 추측되는데 [Lee 와 Song, 2009], 향후 peptide sequence 등의 연구가 진행되면 보다 명확해 질 수 있다고 판단된다.
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