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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한국재래견인 진도개의 정액의 성상과 이ycerol 농도를 통한 정자의 생존율을 조사하여 재래 견의 유전자원보존 체계를 확립하기 위해 실시하였다.
제안 방법
- 동결보호제인 glycerol 을 4, 6 및 8%로 구분하였다. 1:1로 희석된 정액이 4℃로 냉각된 후 glycerol 최종 농도의 1/8, 1/4, 1/2 그리고 최종농도가 되도록 glycerol을 첨가하였고, 각 15분 간격으로 하였으며, 최종 농도로 1시간 동안 평형을 실시하였다. 예비동결 시간은 액체질소 위 5 an 5분, 5 an 10 분을 실시한 후 액체질소에 침지하여 동결을 하였다.
- Glycerol 평형은 4℃에서 30분, 1시간, 2시간 동안 실시하여 최종 농도에 도달하도록 하였고, 평형이 된 정자는 #로 조정하여 스트로에 봉입하였고, 스트로 선단부는 sealing gel을 이용하여 봉합하였다. 동결된 정액은 동결 후 생존율 검사를 위해 액체질소에서 꺼내 공기 중에서 10초간 예비융해를 하였고, 37℃ 온수에서 20초간 융해한 후 생존율 검사를 하였다.
- 정자의 활력은 정자 활동 자동 분석 장치(SIAS, Medical Supply, 한국)를 이용하여 활력을 조사하였다. 동결보호제를[용한 glycerol 평형과 예비동결 시간에 따라 동결된 정액은 액체 질소 통에 보관하기 전에 생존율을 검사하였다.
- 희석된 정액은 동결보호제 및 예비동결 시간을 고려하여 6개 구로 나누어 4 ℃ 까지 냉각하였다. 동결보호제인 glycerol 을 4, 6 및 8%로 구분하였다. 1:1로 희석된 정액이 4℃로 냉각된 후 glycerol 최종 농도의 1/8, 1/4, 1/2 그리고 최종농도가 되도록 glycerol을 첨가하였고, 각 15분 간격으로 하였으며, 최종 농도로 1시간 동안 평형을 실시하였다.
- 이때 음경 표피가 건조하여 출혈이 발생되지 않도록 젤을 도포하였다. 사정된 정액은 총량의 조사를 위해 전 정액을 채취하였고, 총 정액량과 총 정자 수 등의 일반적인 성상을 검사하였다.
- 1:1로 희석된 정액이 4℃로 냉각된 후 glycerol 최종 농도의 1/8, 1/4, 1/2 그리고 최종농도가 되도록 glycerol을 첨가하였고, 각 15분 간격으로 하였으며, 최종 농도로 1시간 동안 평형을 실시하였다. 예비동결 시간은 액체질소 위 5 an 5분, 5 an 10 분을 실시한 후 액체질소에 침지하여 동결을 하였다. Glycerol 평형은 4℃에서 30분, 1시간, 2시간 동안 실시하여 최종 농도에 도달하도록 하였고, 평형이 된 정자는 #로 조정하여 스트로에 봉입하였고, 스트로 선단부는 sealing gel을 이용하여 봉합하였다.
- 정액 채취는 2주 1회의 간격으로 수압법을 이용하여 실시하였고, 발정 암컷을 주변에 두어 수컷이 리비도(libido) 가 발생되도록 유도하였다. 청결한 채취를 위해 생식기 주위를 청결히 하고, 음경을 마사지하여 발기를 유도시킨 후 팽대부 밖으로 포피를 밀어내어 발기가 원활히 되도록 하였으며, 발기된 음경과 팽대부를 압박하며 사정을 유도하였다.
- 정액의 동결은 정장액과 농후부를 분리하고, 농후부를 37℃ 난황트리스액(modified Tris-egg yolk buffer, Table 1)과 1:1 로 희석하여, 정자가 안정화되도록 하였다. 희석된 정액은 동결보호제 및 예비동결 시간을 고려하여 6개 구로 나누어 4 ℃ 까지 냉각하였다.
- 정자의 농후부를 분리하여 희석액으로 1:1로 희석한 후 glycerol을 4, 6 그리고 8%를 4단계로 나누어 1시간 평형을 실시하였고, 동결 전과 후의 생존율을 조사한 것은 Table 2와 같다.
- 이용하여 총 정자수를 확인하였다. 정자의 활력은 정자 활동 자동 분석 장치(SIAS, Medical Supply, 한국)를 이용하여 활력을 조사하였다. 동결보호제를[용한 glycerol 평형과 예비동결 시간에 따라 동결된 정액은 액체 질소 통에 보관하기 전에 생존율을 검사하였다.
- 조사한 결과는 Table 2와 같다. 채정된정액은 정액 총량, 총 정자수, 정장량을 조사하고, 정장 분리 후 Table 1의 희석액으로 1:1로 희석하여 정자의 활력은 CASA 시스템으로 기형 정자는 현미경으로 관찰 조사하였다.
- 채취된 정액은 원심관으로 총 정액량을 환산하고, 정액을 1,500 rpm으로 20분간 원심분리하여 정장액과 농후부정액을 분리하여 농후부 정액을 채취하였고, Makler chamber를 이용하여 총 정자수를 확인하였다. 정자의 활력은 정자 활동 자동 분석 장치(SIAS, Medical Supply, 한국)를 이용하여 활력을 조사하였다.
- 가 발생되도록 유도하였다. 청결한 채취를 위해 생식기 주위를 청결히 하고, 음경을 마사지하여 발기를 유도시킨 후 팽대부 밖으로 포피를 밀어내어 발기가 원활히 되도록 하였으며, 발기된 음경과 팽대부를 압박하며 사정을 유도하였다. 이때 음경 표피가 건조하여 출혈이 발생되지 않도록 젤을 도포하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 공시동물은 진도개사업소(전남 진도군 소재)에서 사육 중인 1~8세의 수컷 성견 12두를 사용하였고, 자연교미를 한 적은 있으나, 인공적으로 정액채취의 경험이 전혀 없는 것을 이용하였다. 이들의 체중은 16-20 kg이었고, 각각 단독의 사육장에서 충분한 운동, 1회의 사료(대한사료) 급여와 무제한 물을 급여하여 사육하였다.
- 희석액은 Tris를 기본 완충액으로 사용하였고, 신선 계란의 난황을 분리하여 20% 첨가하였으며, 이는 Farstad (2009)가 보고한 바와 같이 세포벽을 동해로 부터 방지하게 되며, 세포벽의 인지질의 손실을 보충하거나 혹은 방지하는 것으로 알려져 있다. 그러나 난황은 복합물로써 정확한 생물학적 성상에 대해서는 명확하지 않아 유해성에 대해서는 알 수가 없는 상황이다.
데이터처리
- 본 연구에서 연령별 정자의 활력과 glycerol 농도와 액체질소 위에서 한 예비동결시간에 의한 생존율 실험을 4 회 실시하였으며, 실험 결과는 통계 프로그램인 STATVI-EW를 이용한 ANOVA test로 분석하여 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 7%로 급격히 떨어지는 것으로 나타났다. Qycerol 농도에 따른 동결 전과 동결 후의 생존율은 유의적인 차이를 보였으며0<0.05), 특히 동결 후의 생존율 중 8%의 경우는 급격히 떨어지는 것으로 나타났다.
- 동해방지제는 대체로 상온에서는 독성을 지니고 있어 낮은 농도의 항동해제의 사용이 절실하며, 본 연구의 결과와 같이 4%가 동결 전이나 후에도 가장 높은 생존율을 나타내어 고무적인 현상이라고 할 수 있다. 또한, 희석액의 경우도 최대한 제조 당일 산란된 계란을 사용하였고, 난황의 농후부가 첨가되지 않도록 원심을 2, 000 rpm으로 30분 이상 처리한 결과, 희석액의 질이 더 좋아졌을 것으로 추측된다. 그밖에 난황에는 영양물질, 단백질, 비타민, 인지질, 당 등 복합물이 함유되어 있어 equex STM, skim milk 등 비침투성 동해 방지 물질에 대한 연구도 더 활발히 이루어져야 할 것이다.
후속연구
- 또한, 희석액의 경우도 최대한 제조 당일 산란된 계란을 사용하였고, 난황의 농후부가 첨가되지 않도록 원심을 2, 000 rpm으로 30분 이상 처리한 결과, 희석액의 질이 더 좋아졌을 것으로 추측된다. 그밖에 난황에는 영양물질, 단백질, 비타민, 인지질, 당 등 복합물이 함유되어 있어 equex STM, skim milk 등 비침투성 동해 방지 물질에 대한 연구도 더 활발히 이루어져야 할 것이다.
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