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문제 정의
- 대체 의학에 따르면 녹두의 삶은 즙을 마시면 열을 내리고 혈압을 낮추는데 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며 여드름이나 피부질환에도 효과가 있어서 한방화장품의 소재로도 활용되고 있다. 본 연구에서는 항암 및 항염증 소재로서 녹두의 활용가능성을 탐색하기 위하여 녹두추출물의 항암 및 항염증 활성을 몇 가지 대두 품종들과 비교분석 하였다.
가설 설정
- 1)QR induction assay was carried out by Hepa 1c1c7 cells.
제안 방법
- 식이 섭취에 의한 2상효소계의 활성 유도는 대표적 암 예방기작이다. 2상효소계는 NADP(H): QR와 GST, UDP-glucuronosyl transferase 등으로 구성되어 있는데 이중 QR은 GST와 함께 유도되는 암예방 효소계의 지표효소로 보고되어 있으므로(22) 본 연구에서는 녹두에 존재하는 암 예방 활성 물질 탐색의 생체지표로서 QR 유도활성을 이용하였다.
- 1 filter paper로 진공 여과하여 추출물을 준비하였다. Ethylaetate 와 ethanol 추출물은 감압회전농축기로 농축 후 동결 건조하여 분말시료를 제조하였다.
- LPS에 의하여 유도된 NO 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 세포를 50,000 cells/well 수준으로 첨가하고 24시간 동안 배양하여 96 well plate에 부착한 후 다양한 농도의 시료와 LPS(1 µg/mL)를 동시에 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- 이때 단백질 함량은 동일한 세트의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다. QR specific activity를 2배로 증가시키는데 필요한 시료의 농도를 CD value로 정의하였으며 QR활성의 농도-반응곡선으로부터 CD value를 계산하였다.
- 1% hydroxyprophyl-β-cyclodextrin을 첨가하여 시료가 용해되도록 하였다. QR 유도 후에는 배지를 제거한 후 digitonin/EDTA 용액을 첨가하여 세포를 용해시켰으며 Prochaska and Santamaria(20)의 표준 기질 칵테일 용액을 이용하여 QR 유도 활성을 측정하였다. QR 유도활성은 microtiter plate scanner (Spectramax plus Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 10분간 측정하였다.
- 마쇄된 시료 100 g을 cellulose thimble(Whatman, Maidstone, England)에 넣고 환류냉각추출 장치에 거치한 후 1000 mL의 hexane, ethylacetate, absolute ethanol, 증류수를 이용하여 순차적으로 용매추출을 실시하였다. 각 용매의 추출은 4시간 동안 지속하였으며 추출 후 시료로부터 남아있는 용매를 휘발시켜 제거한후 thimble에 다시 시료를 충진 하여 다음 용매의 추출을 실시하였다. 증류수를 이용한 열수추출은 95℃에서 1시간 동안 실시하였으며 추출 후 1,764×g에서 10분간 원심분리하고 Whatman No.
- 녹두의 ethylacetate 추출물과 ethanol 추출물은 모두 유의적인 QR 유도활성 및 NO생성 억제활성 효과를 나타내었으나 추출 수율(ethylacetate: 약 0.53%, ethanol: 약 2.66%)과 차후 기능성 소재로서의 응용 가능성(식품 제조에 사용 가능한 ethanol을 이용하여 추출된 녹두 ethanol 추출물)을 고려하여 일차적으로 ethanol 추출물의 부분적 정제를 시도하였다.
- 일반적으로 추출물의 CD value 가 <10 µg/mL일 경우 항암 효과에 긍정적인 결과를 나타낼 수있는 것으로 간주할 수 있으나(23) CD value는 시료의 QR 유도 능력의 지표일 뿐 시료 자체가 가지고 있는 세포 독성에 대한 정보는 제공하지 않기 때문에 암 예방 활성을 가진 기능성 식품 소재의 지표로서는 충분치 않을 수 있다. 따라서 본 연구에서는 IC50 값을 CD value로 나누어 구한 CI(chemoprevention index) value를 함께 표시하였다. Table 2에 나타난 바와 같이 ethylacetate 추출물은 ethanol 추출물과 비교하여 CD value가 낮아 보다 낮은 농도에서 QR 유도활성을 나타낸 반면 IC50는 63-250 µg/mL 수준으로서 세포 독성이 ethanol 추출물보다 높았다.
- 마쇄된 시료 100 g을 cellulose thimble(Whatman, Maidstone, England)에 넣고 환류냉각추출 장치에 거치한 후 1000 mL의 hexane, ethylacetate, absolute ethanol, 증류수를 이용하여 순차적으로 용매추출을 실시하였다. 각 용매의 추출은 4시간 동안 지속하였으며 추출 후 시료로부터 남아있는 용매를 휘발시켜 제거한후 thimble에 다시 시료를 충진 하여 다음 용매의 추출을 실시하였다.
- QR 유도활성은 microtiter plate scanner (Spectramax plus Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 10분간 측정하였다. 모든 실험에서는 동일한 처리조건의 duplicate plate를 준비하여 직선적 증가구간에서 단백질 함량을 측정하여 계산하였다. 이때 단백질 함량은 동일한 세트의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다.
- 배양 종료 후 잔여 MTT 시약을 제거하고 DMSO(200 µL)를 이용하여 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 녹두 및 대두의 용매추출물을 제조하고 hepatoma 1c1c7 세포 및 대식세포인 RAW264.7 배양을 이용하여 항암 및 항염증 효과를 비교분석하였다. 녹두추출물은 대두추출물 보다 ethylacetate 및 ethanol 추출물에서 모두 유의적으로 높은 QR 유도활성과 NO 및 PGE2의 생성 억제 효과를 보였으며 농도 의존적 효과를 나타냈다.
- 배양 후에는 Marcocci 등(21)의 방법에 따라 배양 상징액 100 µL 를 취하여 동량의 Griess 시약을 첨가하고 10분간 방치한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 nitrite의 농도는 sodium nitrite를 DMEM 배지에 용해한 후 작성한 표준곡선을 이용하여계산하였으며 LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 nitrite 양의 차이를 기준으로 하여 각 시료의 NO 생성 저해활성을 구하였다.
- 시료의 QR 유도 활성은 Prochaska 등(3)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. Murine hepatoma 1c1c7 세포(ATCC, Rockville, MD, USA)를 10% fetal bovine serum(FBS)와 항생제를 함유하는 α-MEM 배지(α-minimal essential medium; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
- 증류수를 이용한 열수추출은 95℃에서 1시간 동안 실시하였으며 추출 후 1,764×g에서 10분간 원심분리하고 Whatman No. 1 filter paper로 진공 여과하여 추출물을 준비하였다.
- 추출물의 염증억제효과의 지표로서 COX-2에서 유래한 PGE2의 농도 변화를 assay kit(Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. RAW264.
- 포배양액을 제거한 후 Prochaska 등(3)이 제시한 방법으로 crystal violet 염색 및 세척을 실시하고 결합한 염색액을 SDS를 함유한 에탄올용액(50%, v/v)으로 추출하여 한 시간 배양 후 610 nm에서 흡광도를 측정하였으며 세포단백질의 농도를 50% 감소시키는데 필요한 물질의 농도를 산출(IC50)하여 세포단백질 생존성의 지표로 사용하였다.
대상 데이터
- Murine hepatoma 1c1c7 세포(ATCC, Rockville, MD, USA)를 10% fetal bovine serum(FBS)와 항생제를 함유하는 α-MEM 배지(α-minimal essential medium; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
- 의 농도 변화를 assay kit(Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. RAW264.7 cell을 앞서 기술한 방법으로 24시간 배양한 후 추출물을 첨가하여 18시간 배양하고 배양액을 시료로 사용하였다. Assay는 시료의 PGE2와 첨가된 PGE2- peroxidase conjugate와의 경쟁반응을 이용하여 흡광도와 농도의 표준곡선으로 시료세포배양액에 함유된 PGE2의 함량을 산출하였다.
- 마우스 대식세포주인 RAW264.7 cell(ATCC, Manassas, VA, USA)을 10% FBS와 antibiotic mixture가 함유된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)배지에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다.
- 시료는 USDA soybean germplasm collection의 도움을 받아 대두 4종(Glycine max)을 얻었으며 녹두(Vigna radiatae L.)는 시판되는 것(Madison, WI, USA)을 별도로 구입하여 사용하였다. 연구에 사용한 시료의 특징은 Table 1과 같다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였으며, 결과의 통계분석은 SPSS 14.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 ANOVA를 이용하였다. 처리구간의 유의적 차이(p<0.
- 처리구간의 유의적 차이(p<0.05)가 관찰된 경우 Tukey의 다중비교검정법을 사용하여 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- SB(W), soybean Williams 82; SB(LD), soybean LD00-3309; SB(91), soy bean PI458091; SB(80), soybean PI458080; MB, mung bean. The cytotoxicity was evaluated by MTT assay.
- 7 cells were stimulated by LPS in the presence of designated concentrations of sample. The supernatant were collected after 24 hr and PGE2 concentration was determined by ELISA method. Results are expressed as mean±SD.
- 배양 후에는 Marcocci 등(21)의 방법에 따라 배양 상징액 100 µL 를 취하여 동량의 Griess 시약을 첨가하고 10분간 방치한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 세포독성 평가는 RAW264.7 cell을 이용하여 3-(4,5)-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay 를 실시하였다. 위와 동일한 조건으로 시료를 처리하고 24시간 동안 세포를 배양한 후 상징액을 제거하고 MTT 시약(100 µL)을각 well에 분주하여 4시간 동안 배양을 지속하였다.
- 모든 실험에서는 동일한 처리조건의 duplicate plate를 준비하여 직선적 증가구간에서 단백질 함량을 측정하여 계산하였다. 이때 단백질 함량은 동일한 세트의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다. QR specific activity를 2배로 증가시키는데 필요한 시료의 농도를 CD value로 정의하였으며 QR활성의 농도-반응곡선으로부터 CD value를 계산하였다.
성능/효과
- F7분획의 첨가는 농도 의존적으로 PGE2 생성을 억제하였는데 200 µg/mL의 첨가 시에는 대조구와 비교하여 약 42%가, 400 µg/mL의 첨가수준에서는 PGE2 생성의약 83%가 억제되었다.
- F7의 CD value는 분획 전 94에서 24 µg/mL으로 감소하여 CI는 8.3에서 10.4로 상승하였으며 NO생성억제 활성도 다른 분획에 비하여 상대적으로 높았다.
- 4). 각 분획의 QR유도활성 및 NO생성 억제 활성을 측정한 결과 흥미롭게도 전체 수율의 5%에 해당하는 F7에서 상대적으로 높은 QR유도활성 및 NO생성억제 활성이 확인되었다. F7의 CD value는 분획 전 94에서 24 µg/mL으로 감소하여 CI는 8.
- 2). 녹두 ethanol 추출물의 NO 억제 활성의 농도의존성을 측정한 결과(Fig. 3) 시료에 LPS를 처리 시 NO의 생성량은 10배가량 증가하였으며 녹두 ethanol 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 NO의 생성량은 유의적으로 감소하여 농도의존성이 관찰되었다. Kim 등(37)은 RAW264.
- Kwon 등(42)은 30여종의 식물성 식품재료의 에탄올 추출물을 제조하고 염증반응에 관여하는 다양한 효소활성에 미치는 영향을 조사하였다. 녹두 및 녹두의 발아형태인 숙주나물의 에탄올 추출물은 함께 비교 된 두류, 두류유래식품, 식물 뿌리류, 잎채소류, 해조류, 버섯류, 견과류 및 종실류 30여종 중 LOX, phospholipase A2(PLA2) COX-2 등 여러 가지 염증 효소계의 활성을 전반 적으로 억제하였으며 PLA2의 억제 활성이 매우 강하여 비선택적 저해제인 indomethacin과 유사하였다. 또한 LOX 및 COX의 기질인 arachidonic acid 생성을 억제함으로써 염증반응 초기단계에서 항염증 작용을 개시할 수 있는 것으로 보고하였다.
- 녹두의 ethylacetate 추출물과 ethanol 추출물의 NO억제활성은 대두용매추출물보다 유의적으로 높아 100 µg/mL 첨가 시 NO의 생성량은 각각 대조구의 47% 및 62%로 감소하였으며 모든 추출물은 200 µg/mL 수준까지 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 2).
- 7 배양을 이용하여 항암 및 항염증 효과를 비교분석하였다. 녹두추출물은 대두추출물 보다 ethylacetate 및 ethanol 추출물에서 모두 유의적으로 높은 QR 유도활성과 NO 및 PGE2의 생성 억제 효과를 보였으며 농도 의존적 효과를 나타냈다. C18 silica flash column chromatography를 이용하여 회수된 녹두에탄올 추출물의 7개 분획 중 소수성이 가장 강한 분획은 24 µg/mL의 CD value와 783 µg/mL의 IC50를 보 였다.
- 아가콩3은 다른 대두종에 비하여 높은 항산화능력과 QR유도 활성을 보였는데 이와 같은 결과는 아가콩3이 다른 대두종자에 비하여 유의적으로 높은 isoflavone 함량(genistein+daidzein)을 가지기 때문이라고 보고하였다. 또한 총페놀함량과 QR유도활성과의 상관계수(r)는 0.79이었으며 isoflavone과의 상관계수는 0.84로 매우 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 QR이 유전자의 5'upstream 전사조절 부위에 다양한 항산화성분과 반응하는 ARE를 포함하고 있음을 고려할 때(25) 충분히 예상할 수 있다.
- Table 2에 나타난 바와 같이 ethylacetate 추출물은 ethanol 추출물과 비교하여 CD value가 낮아 보다 낮은 농도에서 QR 유도활성을 나타낸 반면 IC50는 63-250 µg/mL 수준으로서 세포 독성이 ethanol 추출물보다 높았다. 시료 중에는 녹두의 ethylacetate 및 ethanol 추출물이 각각 7.88과 8.32의 CI value를 나타내어 대두 추출물과 비교하여 높은 활성을 보였다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 녹두ethanol 추출물은 NO생성 억제 활성을 가지고 있는 것으로 간주할 수 있으며 NO의 과다 생성이 체내 염증반응의 중요 매개경로임을 고려할 때 염증 반응을 억제할 수 있는 천연자원으로 활용할 수 있는 것으로 생각 된다.
- Hexane 추출물은 주성분이 지질로서 QR 유도활성을 보이지 않았으며, 모든 시료의 열수추출물 역시 1,000 µg/mL의 첨가 수준에서도 CD value(QR 유도활성을 2배로 상승시키는데 필요한 시료의 농도)에 도달하지 못하였다. 전반적으로 ethylacetate 추출물은 ethanol 추출물과 비교하여 우수한 QR 유도활성을 보였으며 대두의 품종과 비교하여 녹두는 높은 QR유도 활성을 나타냈다. 일반적으로 추출물의 CD value 가 <10 µg/mL일 경우 항암 효과에 긍정적인 결과를 나타낼 수있는 것으로 간주할 수 있으나(23) CD value는 시료의 QR 유도 능력의 지표일 뿐 시료 자체가 가지고 있는 세포 독성에 대한 정보는 제공하지 않기 때문에 암 예방 활성을 가진 기능성 식품 소재의 지표로서는 충분치 않을 수 있다.
후속연구
- 또한, 활성산소가 조직손상, 염증발현은 물론 암의 발생에도 관여함을 고려할 때, 녹두의 ethanol과 ethylacetate 분획의 높은 항산화 활성(36)도 QR유도 활성에 관여하는 것으로 생각된다. 그러나 정확한 OR활성 유도물질의 확인을 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.
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