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문제 정의
- 일반적으로 nitric oxide는 체내 방어기능과 신호전달기능 등 다양한 생리 기능을 가지고 있으나, 과량의 nitric oxide는 염증반응을 촉진 시킨다(Higuchi 등, 1990). 따라서 본 연구는 nitric oxide의 생성을 저해하여 염증반응을 예방하는데 있다. 즉, 대식세포인 RAW 264.
- 더욱이, 기능성 생리활성에 관한 연구는 극히 일부이거나 다양한 생리효능에서의 대한 연구는 거의 이루어진바 없다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 개량한 팽이버섯 11계통을 사용하여 다양한 생리활성을 비교 분석하였다.
제안 방법
- α-1,4 및 α-1,6 글루코시드결합을 분해하는 효소인 αamyloglucosidase(Sigma, USA)를 사용하여 버섯 추출물이이 효소의 활성을 저해함으로써 단당류의 소화흡수를 저해 하는 정도를 측정, 간접적인 항당뇨 활성을 측정하였다.
- 가수 분해액을 200 mM의 sodium acetate buffer(pH 5.0)로 희석한 후 원심분리하고 상층액 100 uL을 취하여 exo 1,3-β-glucanase와 β-glucosidase를 첨가한 후 glucose determination reagent(Megazyme, Ireland)를 첨가하고, 510 nm에서 흡광도를 측정하여 total glucan과 glucan 이외의 당 함량을 분석하였다.
- 2 M acetate를 첨가하여 중화시켰다. 그리고 DNS(3,5-dinitrosalicylicacid) 환원당 정량 법에 의하여 동량의 DNS를 넣고 90℃에서 10분간 가열하고 실온으로 냉각 후 증류수 1 mL를 가해 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반응 후 생성되는 유리 glucose양을 측정 하여 α-glucoamylase의 저해활성을 측정하였다.
- 내독소인 lipopolysaccharide(Sigma, USA)를 RAW264.7 cell에 처리하고 버섯 추출물 시료를 첨가하여, 생성되는 염증 유발물질의 생성량을 비교하였다. 즉, DMEM 배지(Welgene, Korea)를 사용하여 RAW264.
- 즉 5×104 cell/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양한 후, 배양에 사용된 배지를 제거하고 버섯시료 에탄올 추출물을 포함한 새로운 배지 200 uL를 첨가하였다. 다시 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 MTT 시약을 분주하여 4시간 후 ELISA microreader(Biorad, CA)를 이용하여 흡 광도를 측정하였다.
- 반응 후 생성되는 유리 glucose양을 측정 하여 α-glucoamylase의 저해활성을 측정하였다.
- 버섯 자실체를 동결건조시켜 분쇄한 후 건조 시료의 20배(v/w)의 80% ethanol을 가하여 상온에서 48시간 추출한 후 흡입 여과하였고, 여과액을 감압 농축하여 에탄올 추출물을 제조하였다.
- 베타글루칸 함량은 BETA-GLUCAN kit(Megazyme, Ireland)를 사용하여 측정하였다. 즉, β-glucan의 함량은 total glucan과 α-glucan의 당 함량을 구한 후, 두 개의 당 함량 차이로 β-glucan을 측정하였다.
- 7 cell을 5×105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 버섯시료 에탄올 추출물과 LPS를 동시 처리해서 20시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 griess reagent system을 이용하여 NO2를 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액과 griess 시약을 1:1 양으로 혼합 하여, 96-well plate에 반응 후 측정하였다.
- 5 mL의 ethylacetate를 첨가한 후 5분 이상 충분히 혼합하고 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상등액 1 mL를 취해 120℃ dry oven에서 40분간 ethylacetate를 완전히 제거하였다. 잔유물을 증류수 1 mL로 용해하고 228 nm에서 흡광도를측정하였으며, 또한 시료 및 기질, 효소를 첨가하고 반응 전에 1 N HCl을 동량 첨가하여 효소반응을 정지시킨 sample blank군을 함께 측정하였고 대조군은 시료 대신 borate buffer를 사용하였다.
- 즉, β-glucan의 함량은 total glucan과 α-glucan의 당 함량을 구한 후, 두 개의 당 함량 차이로 β-glucan을 측정하였다.
- 생성된 NO의 양은 griess reagent system을 이용하여 NO2를 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액과 griess 시약을 1:1 양으로 혼합 하여, 96-well plate에 반응 후 측정하였다.
- 팽이버섯 11계통을 사용하여 polyphenol 및 β-glucan 함량을 분석하고, 생리활성으로 항산화 및 항암, 항고혈압, 항당뇨, 항염활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 팽이버섯은 2009년도에 충청북도 농업기술원에서 재배한 11계통으로 CBMFV-30, CBMFV-29, CBMFV-26, CBMFV-10, CBMFV-42, CBMFV-41, CBMFV-37, CBMFV-62, CBMFV-66, CBMFV-65, CBMFV-63의 자실체를 사용하였다.
- 세포 독성 시험 세포 독성 실험은 Kotakenara 등(Kotakenara 등, 2001)의 방법에 따라 1% streptomycin(Welgene, Korea)과 10% fetal bovine serum(Welgene, Korea)을 포함하는 RPMI1640와 DMEM(Welgene, Korea)배지를 사용하였으며, 세포주는 A549(폐암세포) 및 HT-29(대장암세포), TM3(고환 정상세포)를 사용하였다. 즉 5×104 cell/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양한 후, 배양에 사용된 배지를 제거하고 버섯시료 에탄올 추출물을 포함한 새로운 배지 200 uL를 첨가하였다.
이론/모형
- 고혈압 발생 원인물질을 생성하는 angiotensin converting enzyme(ACE) 활성저해 효과는 Cushman과 Cheung의 spectrophotometric assay 방법(Cushman과 Cheung, 1971)에 의하여 측정하였다. 즉, 0.
- 소거능 실험은 Blois의 방법(Blois, 1958)에 따라 99.9% methyl alcohol에 녹인 0.05 mM DPPH solution 3.9mL에 버섯시료 에탄올 추출물 0.1 mL를 넣고 10초간 혼합한 후 빛을 차단한 상태에서 30분간 상온에서 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Negative control은 sample과 동일한 양의 D.
- 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis(Swain 등, 1959)법으로 측정하였다. 즉 시료를 증류수에 녹인 다음 Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA) 0.
성능/효과
- β-glucan 함량에서는 CBMFV-41에서 27.37%로 가장 높았으며, 그다음으로 CBMFV-30 27.21%, CBMFV-6527.11%의 순서로 높은 β-glucan 함량을 나타냈다.
- 05%로 가장 높은 세포 저해활성을 나타냈다. ACE 저해활성에서는 CBMFV-65에서 10.96%를 나타냈고 나머지 품종은 10%미만의 저해활성을 나타냈다. 항당뇨 활성에서는 CBMFV-41에서 63.
- 팽이버섯 11계통을 사용하여 polyphenol 및 β-glucan 함량을 분석하고, 생리활성으로 항산화 및 항암, 항고혈압, 항당뇨, 항염활성을 측정하였다. Polyphenol 함량에서는 CBMFV-65가 244.74 mg%로 가장 많은 함량을 나타내었고 전 품종에서 전반적으로 100 mg% 이상의 함량을 나타냈다. β-glucan 함량에서는 CBMFV-41에서 27.
- 11%로 높은 순을나타냈다. 다음으로 대장암세포에서 높은 세포 사멸율을 보였으며 폐암세포에서와 같이 CBMFV-30이 67.05%로 가장 높았으며 CBMFV-29이 66.78%, CBMFV-63이 63.53%로 높은 세포 사멸율을 보였다. 마지막으로 고환 정상세포에서는 암세포와 비교했을 때 상대적으로 미미한 30%정도의 세포 저해활성을 나타냈다.
- 53%로 높은 세포 사멸율을 보였다. 마지막으로 고환 정상세포에서는 암세포와 비교했을 때 상대적으로 미미한 30%정도의 세포 저해활성을 나타냈다. 천연자원으로부터 항암활성이 있는 다당체 분리는 계속 되어오고 있으며, 이중 담자균류의 항암활성이 가장 광범위하게 연구되고 있다.
- 98%로 가장 낮은 효소 저해활성을 나타냈다. 마지막으로 항염활성에서는 CBMFV-41에서 61.44%의 nitric oxide 억제율이 측정되었다.
- 본 실험에 사용된 팽이버섯 11계통은 비록 베타글루칸 함량이 높다고 알려진 꽃송이버섯 43.6%에는 미치지 못하지만 잎새버섯 15∼20% 및 영지버섯 8∼15%, 송이버섯 18.1%(Miura, 1997; Kajimura와 Suga, 2004)에 비하면 팽이버섯 11계통은 전반적으로 높은 베타글루칸 함량을 나타냈다.
- 74%로 가장 높은 DPPH 소거 활성을 나타냈으며 전체적으로 70%의 높은 소거활성을 보였다. 세포독성 실험에서는 폐암세포에 대한 세포 저해활성이 가장 컸으며, 폐암세포와 대장암세포 모두 CBMFV-30에서 각각 76.07%, 67.05%로 가장 높은 세포 저해활성을 나타냈다. ACE 저해활성에서는 CBMFV-65에서 10.
- 항당뇨 활성 혈당 상승예방을 위해 사용되는 경구용 혈당강하제로는 탄수화물의 소화를 제한하여 식후 고혈당을 예방하는α-glucosidase 저해제로 acarbose 및 miglitol 등과 인슐린 분비를 촉진하는 sulfonylurea, 인슐린 감수성을 촉진 시키며 hepatic glucose output을 감소시키는 metformin, thiazolidinedione 등이 알려져 있다(Park 등, 2007). 시료 처리 결과 Fig 6과 같이 팽이버섯 CBMFV-41에서 63.57%로 가장 높은 유리 포도당의 생성 감소를 나타냈고, 다음으로 CBMFV-29 58.67%, CBMFV-62 57.65%의 활성을보였으며, 가장 낮은 활성을 보인 것은 CBMFV-63으로 10.98%의 효소 저해활성을 나타냈다. Cha 등(2004)에 의하면 streptozotocin으로 당뇨 유발된 흰쥐 수컷에 팽이버섯 추출물 함유 발효유를 투여한 결과 혈당강하 효과가 있었으며, 이는 인슐린 농도증가에 의한 것으로 보고하였다.
- 11%의 순서로 높은 β-glucan 함량을 나타냈다. 전자공여능에서는 CBMFV-66이 91.74%로 가장 높은 DPPH 소거 활성을 나타냈으며 전체적으로 70%의 높은 소거활성을 보였다. 세포독성 실험에서는 폐암세포에 대한 세포 저해활성이 가장 컸으며, 폐암세포와 대장암세포 모두 CBMFV-30에서 각각 76.
- 7 세포에 염증성 매개물질을 증가시키는 LPS(1 ug/mL)를 첨가하여 nitric oxide의 생성을 유도한 후 팽이버섯 추출물을 처리하였을 때 nitric oxide 생성을 억제하였으며, 결과는 Fig 7과 같다. 즉, LPS를 단독으로 처리했을 때 100% nitric oxide 생성율로 환산하여 비교한 결과 CBMFV41에서 61.44%의 가장 높은 억제율을 기록했으며 그 다음으로 CBMFV-42가 38.12%로 나타냈다. 가장 낮은 활성은 CBMFV-63으로 3.
- 따라서 본 연구는 nitric oxide의 생성을 저해하여 염증반응을 예방하는데 있다. 즉, 대식세포인 RAW 264.7 세포에 염증성 매개물질을 증가시키는 LPS(1 ug/mL)를 첨가하여 nitric oxide의 생성을 유도한 후 팽이버섯 추출물을 처리하였을 때 nitric oxide 생성을 억제하였으며, 결과는 Fig 7과 같다. 즉, LPS를 단독으로 처리했을 때 100% nitric oxide 생성율로 환산하여 비교한 결과 CBMFV41에서 61.
- 팽이버섯 추출물의 항암활성을 알아보고자 폐암세포 (A549) 및 대장암세포(HT-29), 정상세포(TM3)를 사용하여 세포 생존율을 MTT assay 방법으로 확인한 결과는 Fig 4와 같이 나타났다. 즉, 버섯시료 에탄올 추출물 처리시 암세포에 대한 독성은 폐암세포에서 가장 높게 나타났으며, CBMFV-30에서 76.07%로 가장 높은 세포 사멸율을 보였고 CBMFV-66이 73.19%, CBMFV-26이 73.11%로 높은 순을나타냈다. 다음으로 대장암세포에서 높은 세포 사멸율을 보였으며 폐암세포에서와 같이 CBMFV-30이 67.
- 팽이버섯 11계통의 β-glucan을 분석한 결과 Fig 2와 같이, CBMFV-41에서 27.37%로 가장 높은 β-glucan 함량을나타냈으며, 그 다음으로 CBMFV-30 27.21%, CBMFV-6527.11% 순으로 나타났고 CBMFV-66이 19.33%로 가장 낮은 β-glucan 함량을 나타냈다.
- 팽이버섯 11계통의 ACE 활성 저해 효과를 측정한 결과 팽이버섯 CBMFV-65에서 10.96%를 나타냈고 나머지 품종은 10%미만의 활성 저해 효과를 나타냈다. 고혈압의 치료제로 사용되는 ACE 억제제는 관상동맥질환과 심근경색의 발생을 감소시키며, neurohormonal effect에 의해 혈관 벽에 가해지는 스트레스를 감소 시켜 심혈관계 질환에 효과를 나타낸다.
- 팽이버섯 11계통의 DPPH radical 소거활성을 측정 한 결과 Fig 3과 같이 팽이버섯 CBMFV-66이 91.74%로 가장 높은 DPPH 소거활성을 나타냈으며 전체적으로 70%이상의 소거활성을 나타냈다. Huynh 등(2010)에 의하면 팽이버섯 열수 추출물은 0.
- 팽이버섯 11계통의 polyphenol 함량을 분석한 결과는 Fig 1과 같이 CBMFV-65에서 244.74 mg%로 가장 많은 함량을 나타내었고 그 다음으로 CBMFV-41에서 241.45 mg%, CBMFV-30에서 240.98 mg%의 순으로 높은 함량을 나타냈으며, 전체적으로 100 mg%의 높은 함량을 나타냈다. 페놀성 화합물은 천연의 항산화제 중 대표적인 화합물로서 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 생체 내에서 항산화 및 항균 활성 등의 다양한 생리 활성 기능을 나타내며 폴리페놀 화합물을 추출하려는 연구가 여러 분야에서 이루어지고 있다(Stirpe와 Corte, 1969).
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