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문제 정의
- 본 연구에서는 식품의 잠재적인 위해요소가 될 수 있는 bound-MCPD를 예방적인 차원에서 관리하기 위해 분석법을 개발하고자 하였다.
가설 설정
- 때문에 자세히 검토해 볼 필요가 있다. 단순하게 정량이온만을 가지고 LOD와 LOQ를 구하는 것이 아니라, 5 개 이온 중에서 감도가 제일 낮은 이온을 기준으로 LOD, LOQ를 구해야 옳을 것이다. 3-MCPD를 정량분석하기 위해서 사용하는 이온은 253이며, 5ppb에서 Ippm 농도에서 S/N 비율을 구했을때, 8.
제안 방법
- 주입구의 조건은 온도 250℃, splitless mode로 1 ul 시료를 주입하였다. Ion source의 온도는 200℃, El0 mode 에서 SIM?) scan하여 정량, 정성분석을 하였다.
- 내부 표준물질은 lmg/ml의 3-MCPD-d5 1 ml를 ethylacetate에 녹여 100 ml로 만들어 10 ug/ ml로(10ppm) 만들어서 사용하였다. 3-MCPD 표준품은 1 g 을 1리터의 ethylacetate에 녹여 1 mg/ml로 만들어, stock solution으로 만들고, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1, 000, 2, 000, 5,000, 10, 000, 20, 000, 50, 000ppb의 농도로 희석하여 사용하였다. 포화 NaHCQ는 과량의 탄산수소나트륨을 증류수에 녹여 제조하였다.
- 따라서 lOppb의 S/N 비율값을 사용하여 실험결과를 내삽한뒤 LOD와 LOQ를 구했다. S/N 비가 3 일때를 LOD, 10 일때를 LOQ로 선정하였으며, 기기적인 검출한계와 정량한계는 LOD = 5.4ppb, LOQ = 9.0ppb이고, 실험법 자체가 3배 희석공정이므로 실험적법인 LOD = 5.4x 3 = 16.2ppb, LOQ = 9x3 = 27ppb이다. 특이한 점은 실제 생성되는 이온의 개수 (ion count number)는 453이온이 적은데도 불구하고, S/N비율은 5개 이온 중에서 가장 높다는 점이다.
- Transfer line의 온도는 2&TC로 유지하였고, 유량은 1.0 mV min(분석시간 30분) 또는 0.8ml/min(분석시간 40분)으로 분석하였다. Dwell time = 0.
- 효소반응의 경우 입체반응 특이성이 있어서 원하는위치의 지방산만을 선택적으로 잘라낼 수 있는 등 장점도많지만, 반응조건이 온화하여 반응속도를 크게 높일 수가없으며, 기질의 농도가 너무 높거나 하면 반응에 문제가 생기는 단점도 있다. 그래서 본 연구에서는 산촉매를 이용한가수분해 방식을 택하였다.
- 그러나 291 이온을 보면 5ppb에서 S/N 비율이 낮게 나왔다. 따라서 lOppb의 S/N 비율값을 사용하여 실험결과를 내삽한뒤 LOD와 LOQ를 구했다. S/N 비가 3 일때를 LOD, 10 일때를 LOQ로 선정하였으며, 기기적인 검출한계와 정량한계는 LOD = 5.
- 농축이 끝나고 나면, HFBA (Heptafluoro butyric acid anhydride) 150ul와 iso-octane (2, 2, 4-trimethylpentane) 1 ml를 가하여 60℃, 30분간 반응을 시킨다. 반응을 정지시키고, 미반응 HFBA를 분해시키기 위해서 증류수 5ml를가하고 20초간 격렬히 흔든 후 정치시켜서, 상층의 isooctarme층을 취하여 GCZMS 분석을 한다.
- 연결된 2개의 반응은 모두 가역반응이며, 각 반응의 속도상수를 위와 같이 k1, k2, k;, k4 라고 하여, 생성물의 분포에 대해 예측해 볼 수 있다. 본 연구에서는 bound-MCPD의 가수분해를 극대화시키기 위해서 반응의 평형을 정반응에 우세하도록 지방산에 메틸을 붙여 에스테르화 시켰다. 생성물이 반응에 의해 다시 제거되면서정반응이 더 진행되는 것이다.
- 본 연구에서는 식품 중에 bound-MCPD를 측정하기 위해지방을 추출하고, 메탄올에 녹인 황산으로 60℃, 4hr 가수분해하여 모두 3-MCPD로 전환시켜 분석하는 실험법을 개발하였다. 기존의 논문과 비교하였을때 분석시간이 더 빠르고, 현재 식품공전에 등재된 3-MCPD 시험법에 접목시킨 시험법이다.
- 3-MCPD와 bound-MCPD가 검출되기에 유리한 소스류와 식육가공품을 위주로 수거하였다. 수거의 기준은 식품의 성분으로 기름과 NaCl과 물이 섞여서 가공, 조리된 것을 근거로 하였다. 총 109건의 검체를 수거하였고, 조미식품은소스류 65건, 식육가공품은 30건을 기본적으로 수거하였으며, 부가적으로 스낵과자류은 기름과 소금이 섞여 함께 튀겨진 과자류를 5건 수거하였고, 수산물가공품으로 수산물통조림 5건, 식용유지 2건, 절임류 2건은 깻잎절임 식품을수거하였다.
- 시험법이 제대로 적용될 수 있는지 알아보기 위해 시료를대형할인마트 위주로 수거하였다. 시료의 수거 무게는 1 kg 을 기준으로 수거하였으며, 유통기한이 같은 식품으로만 구입하였다.
- 0min으로 설정하였다. 온도 프로그램은 50℃에서 5분간 유지하고, 3℃/min의 속도로 9(TC까지 승온시키고, 5 분간 유지한뒤에, 3(TC/min의 속도로 28(TC까지 승온하고, 0.33min동안 유지하여 분석조건을 잡았다.
- 튜닝할때는 GC/MS 내부의 수분과질소의 피크가 권장조건만큼 작아질 때까지 bake oirt을 3 시간 해준 뒤에 실시하였다. 튜닝을 하고 나서는 69 ion의전압이 500mV~800mV 유지되는지를 확인하였고, 각 이온의 모양이 바르게 나왔는지 확인한 뒤 시료의 측정을 하였다. 컬럼의 설치가 잘못되었거나, 컬럼을 말단을 잘못 잘랐을때 피크의 모양이 일그러지거나, 갈라지는 현상이 생기기 때문이다.
- 4 X 10-7-3 X 10-7을 유지시켜 주었으며, ion volume과 ion source 교체시마다 mass 튜닝을 다시 해주었다. 튜닝할때는 GC/MS 내부의 수분과질소의 피크가 권장조건만큼 작아질 때까지 bake oirt을 3 시간 해준 뒤에 실시하였다. 튜닝을 하고 나서는 69 ion의전압이 500mV~800mV 유지되는지를 확인하였고, 각 이온의 모양이 바르게 나왔는지 확인한 뒤 시료의 측정을 하였다.
- 험하였으며, 한 시료당 7번씩 총 63건의 전처리를 하였다. 서로 다른 실험자와 시간에 만든 표준품이라 반복성 실험과달리 편차가, 조금 더 크게 나오는 것을 알 수 있다.
대상 데이터
- 3-MCPD-HFBA 유도체화 된 시료의 분석을 위해 253, 275, 289, 291, 453 ion을 선정하였고, 3-MCPD-d5-HFBA 내부표준물은 257, 278, 294, 296, 456 ion을 선정하였다. 정량이온은 3-MCPD의 경우 253으로, 내부표준물질의 경우 257을 기준으로 하였고, 정성분석을 위한 이온 비율의 범위값은 일반적으로 사용하는 ±20%로 하였다.
- 기기분석은 현재 식품공전에 등재된 방법을 기준으로 하였다. GC는 varian의 CP-3800을, MSD는 %rian의 Quadrupole-MSMS 1200을 사용하였다.
- 분석가능한 선형구간은 3-MCPD로서 10ppb(ug/kg)-2ppm (㎎/㎏), 이며 반복성이 상대표준편차 5%이내, 재현성의 상대 표준편차는 선형구간에서 10%이내이다.
- 수거의 기준은 식품의 성분으로 기름과 NaCl과 물이 섞여서 가공, 조리된 것을 근거로 하였다. 총 109건의 검체를 수거하였고, 조미식품은소스류 65건, 식육가공품은 30건을 기본적으로 수거하였으며, 부가적으로 스낵과자류은 기름과 소금이 섞여 함께 튀겨진 과자류를 5건 수거하였고, 수산물가공품으로 수산물통조림 5건, 식용유지 2건, 절임류 2건은 깻잎절임 식품을수거하였다.
데이터처리
- 내부표준물질로 사용흐}는 3-MCPD-d5-HFBA 유도체 화합물의 경우도 257 이온을 정량이온으로 하며, 나머지 이온들의 비율이 맞아야한다. 실제 검량곡선을 그릴 때는 Varian 사의 프로그램을사용하여 계산을 하며, 이온 비율의 범위는 일반적으로 통용되고 있는 ±20%를 기준으로 한다.
이론/모형
- 기기분석은 현재 식품공전에 등재된 방법을 기준으로 하였다. GC는 varian의 CP-3800을, MSD는 %rian의 Quadrupole-MSMS 1200을 사용하였다.
- 한다. 본 연구에서 적용할 3-MCPD의 분석법은 우리나라의 식품공전 방법을 사용하였다. 다음의 Fig.
- 5 ml를 사용하여 중화시 킨다. 중화된 시료에 하얀 침전이 분산되어 있기 때문에 원심분리기를 사용하여 4500rpm, 5min, 4℃ 조건으로 분리하고, 상층액 1 ml를 덜어내어 3-MCPD 분석법으로 연결한다. 위와 같은 방법으로 bound-MCPD를 3-MCPD로 전환시켜 GC/MS 분석을 한 뒤에, 3-MCPD 분석결과를 빼서 bound-MCPD 값으로 한다.
성능/효과
- 977이지만, 농도에 비례하지 않는 패턴이 나타났다. 2ppb에서 50ppb 구간을 따로 떼어 최소자승법으로 추세선을 구하면 R2 값이 0.99&로 높은 편이지만, 농도가 낮은 구간 lOppb 미만에서는 비선형적인 결과를 보여준다. 이것은기기의 검출한계 근처로 가면서, 각 이온의 검출감도에 한계가 오기 때문이다.
- 3-MCPD 시험법의 회수율은 85.53%, R.S.D. = 2.48%, n = 5, 3-MCPD 지방산에스테르의 시험법 회수율은 82.97%, R.S.D = 5.25%, n=10 이었다.
- 3-MCPD는 소스류의 경우 총 65건의 검체 중에서 6건이 검출되었으며, 6건 중에서 최소는 0.062ppm이고 최고 많이 나온 것은 0.276ppm이 검출되었고, 식육가공품은 총 30건 중에서 3건이 검출되었고 제일 적은 것은 0.070ppm에서 많은 것은 0.255ppm 검출되었다. 수산물가공품은 5건 중에서 1건이 검출되었고, 0.
- 식용유지와 기타수거 제품에서는 불검출이었다. 3-MCPD의 경우 109건 중에서 총 13 건이 검출되었으며, 검출률이 11.9%이다.
- 그 이유는 453 이온의 경우 방해이온이 거의 없어서, 베이스 라인이 깨끗하기 때문이다. 검출한계와 정량한계를 구하기 위해 한 개의 농도마다, 총 10번의 기기분석을 하여, 실험 데이타의반복성을 보았는데, O.Olppm이하에서는 데이터의 편차가 매우 심한 것을 알 수 있으며, 특히 291이온의 경우 S/N 비율의 편차가 40%까지 크게 나는 것을 알 수 있다. 이것은분석하고자 하는 3-MCPD의 농도가 작아지면서, 분석에 방해 되는 이온들의 영향력이 커졌기 때문이다.
- 이것은분석하고자 하는 3-MCPD의 농도가 작아지면서, 분석에 방해 되는 이온들의 영향력이 커졌기 때문이다. 기존 문헌과분석법을 비교했을때 동등수준인 것을 알 수 있으며, 본 실험의 실험법으로는 3-MCPD와 DCP (Dichloropropanediol)을 동시에 전처리 할 수 있는 장점이 있다.
- 아직은 bound-MCPD 자체의 독성이나 위해성에 대해 알려져 있지 않지만, bound-MCPD가 식품형태로 소화기관에들어가서 위산과 소화효소, 장을 지나는 과정에서 3-MCPD 로 전환될 가능성이 있다. 독일 연방 위해 평가원(BfR, Bundesinstitut for Risikobewertung)에서 bound-MCPD의 위해평가를 실시하여, bound-MCPD가 인체내에서 가수분해되면, 결합되어 있던 지방산이 분리되면서 3-MCPD가 생성될 가능성이 있다는 결론을 내렸다.
- 이것은기기의 검출한계 근처로 가면서, 각 이온의 검출감도에 한계가 오기 때문이다. 따라서 정량분석을 위한 분석물질의선형감도를 나타내는 구간을 보면 lOppb에서 2ppm 구간에서 선형성이 유지되며, R2값이 0.9996으로 선형성이 우수하다. 다음은 분석하고자 하는 물질이 동일한 조건에 반복적으로 일정하게 측정되는지를 알아보기 위한 반복성 실험결과이다.
- 먼저 내부표준물질과 3-MCPD의 크로마토그램을 보면내부표준물질인 3-MCPD-d5가 15.157 ±0.05min에서 먼저나오고, 3-MCPD는 15.323 ±0.05min에서 나오는 것을 알수 있다. 각각의 피크는 충분히 떨어져 있어서 resolution을따로 계산해 볼 필요는 없었다.
후속연구
- 반대로 bound-MCPDt- 가수분해하여 모두 3-MCPD로 전 환시켜 분석하는 방법은 3-MCPD 표준품만 있으면 되며, 일반적인 GC 컬럼으로도 분석 가능하다' 전처리에 있어서는 가수분해와 유도체화 과정이 필요하다. 한계점으로는 분 석결과를 놓고 어떤 종류의 bound-MCPD인지 종류별 정량 이 불가하여 3-MCPD 총합을 통해서 추측만 가능하다.
- 장점은 유도체화 없이 추출만 하여 분석이 가능하며, 결합형-MCPD의 종류와 분포를 파악할 수 있으며, 모두 정량이 가능하다는 것이다. 한계점으로는 위에서 언급한 것처럼 모든 bound-MCPD 표준품을 확보하는 것이 현실적으로 시간과 비용이 매우 많이 소요된다는 것이다.
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