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문제 정의
- Raw 264.7과 HepG2의 TNF-α 생성과 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 다음과 같이 실험을 시행한다.
- 본 연구에서는 애엽(艾葉)과 애엽을 효모균의 일종인 Saccharomyces cerevisiae, 그리고 유산균의 일종인 Lactobacillus pentosus로 발효시켜 얻은 시료를 대상으로 인간간조직세포 HepG2와 마우스대식세포 RAW 264.7의 종양괴사인자-알파의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하고 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 애엽물추출물(AW), 유산균발효애엽물추출물 (AFL), 효모균발효애엽물추출물(AFS)이 마우스 대식세포 RAW 264.7과 인체간조직세포 HepG2의 종양괴사인자-알파 생성에 미치는 영향을 알아보기 위한 in vitro 실험을 수행한 결과 다음을 알 수 있었다.
제안 방법
- 배양 후상층액을 채취한 뒤, ‘ELISA assay kit for TNF-α’ 제조사에서 제시한 ELISA방법에 따라 microplate reader를 이용, 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 TNF-α 생성에 대한 시료의 영향을 비교하였다.
- 배양이 끝난 뒤, 배지를 조심스럽게제거하고 PBS에 녹인 1 mg/mL MTT(Sigma, USA)를 각 well에처리하고 알루미늄호일로 차광하여 2시간동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 모두 제거하고 DMSO를 200 ㎕ 처리한 뒤 37℃에서 60분 방치 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정, 세포생존율을 비교하였다.
- 배지에 녹인 시료(0, 50, 100, 200 μ g/mL)을 각 well에 처리하고 3시간 동안 배양하였다.
- 위에서 제조된 艾葉 추출물을 이용하여 다음과 같이 유산균 발효애엽추출물(AFL)을 제조하였다.
- 위에서 제조된 艾葉 추출물을 이용하여 다음과 같이 효모균 발효애엽추출물(AFS)을 제조하였다.
- 준비된 시료가 RAW 264.7에는 유의한 독성을 나타내지 않음에 대해서 이미 보고한 바3-8)가 있기 때문에 AW의 HepG2 세포생존율에 미치는 영향에 대해서만 MTT assay를 통하여 이미 보고한 방법3-8)에 따라 Mosmann 등 11-12) 의 방법을 응용하여 다음과 같이 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주, 24시간동안 배양한 후, 배지에 녹인 시료(0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)를 각 well에 처리하고 3시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
대상 데이터
- ① 조효소 조제 : 조효소제인 3 g α-herbzyme (한국효소, 한국)에 증류수 100 mL을 가하고 37℃에서 30분간 침출하여 여과시킨 후 그 여액을 조효소액으로 사용하였다.
- 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였으며 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (NUAIRE, USA), clean bench(Jeio thec, Korea), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Gyrozen, Korea), water bath(Sae Han, Korea), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), freeze dryer(Eyela), deep freezer(Ilshin Lab, Korea) microplate reader (Bio-Rad, USA), ELISA assay kit for TNF-α(Endogen, USA) 등이다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 Tetrazolium salt 3,[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dyphenyl tetrazolium bromide (MTT)와 dimethyl sulfoxide (DMSO), 1×PBS solution 등은 Sigma사(USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 약재 애엽(Artemisiae argi Folium)은 한국 서해안에서 채취하여 검정한 후 사용하였으며 검정된 약재들은 경원대학교 한의과대학 병리학교실에 보관되었다.
- 실험에 사용된 세포주는 마우스 대식세포(mouse macrophage RAW 264.7 cell line; RAW 264.7)과 인간 간조직세포(human hepatocyte HepG2 cell line; HepG2)로서 한국세포주 은행(KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험성적은 평균 ± 표준오차(Mean ± SEM)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Student t-test로 분석하여 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 애엽추출물과 발효애엽추출물의 제조는 이미 보고한 선행연구3-8)의 방법에 따라 다음과 같이 시행하였다.
성능/효과
- AFL(0, 50, 100, 200 μg/mL)이 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 HepG2의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 각각 113.8±3.2%, 121.3±3.91%, 132.5±3.07%로 모두 유의(p<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 4).
- AFL(0, 50, 100, 200 μg/mL)이 포함된 배지에 RAW 264.7세포들을 3시간 동안 배양한 결과 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 각각 126.2±2.36%, 127.1±3.31%, 133.2±1.91%로 모두 유의(p<0.05)하게 증가시켰다 (Fig. 1).
- AFS(0, 50, 100, 200 μg/mL)가 포함된 배지에 HepG2 세포 들을 3시간 동안 배양한 결과 HepG2의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 각각 122.2±5.52%, 127.1±1.51%, 156.5±3.25%로 모두 유의(p<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 5).
- AFS(0, 50, 100, 200 μg/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 각각 124.5±2.86%, 131.2± 3.31%, 149.4±3.48%로 모두 유의(p<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 2).
- AW(0, 50, 100, 200 μg/mL)가 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 HepG2의 TNF-α 생성을 AW가 100, 200 μg/mL의 농도에서 각각 131.8±1.68%, 155.2±3.35%로 유의(p<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 3).
- AW(10, 50, 100, 200 μg/mL)를 HepG2에 처리하여 3시간동안 배양한 결과 AW가 10 μg/mL의 농도에서 AW를 처리하지 않은 정상군(normal group)에 비해 106.58 ± 4.93%의 생존율을 나타내는 등 모든 농도에서 유의한 세포생존율 감소를 나타내지 않았다(data not shown).
- 본 연구에서 AW(0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)를 HepG2에 처리하여 3시간동안 배양한 결과 AW가 10 μg/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 세포생존율 감소를 나타내지 않았으며, AFL이 포함된 배지에 RAW 264.7 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시켰고, AFS가 포함된 배지에 RAW 264.7 세포들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시킨 것으로 나타났으며, AW가 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 HepG2의 TNF-α 생성을 AW가 100, 200 μg/mL의 농도에서 유의하게 증가시켰고, AFL이 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 HepG2의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시켰으며, AFS가 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 HepG2의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시켰다.
- 본 연구에서 AW(0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)를 HepG2에 처리하여 3시간동안 배양한 결과 AW가 10 μg/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 세포생존율 감소를 나타내지 않았으며, AFL이 포함된 배지에 RAW 264.7 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시켰고, AFS가 포함된 배지에 RAW 264.7 세포들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 RAW 264.7의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시킨 것으로 나타났으며, AW가 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과 HepG2의 TNF-α 생성을 AW가 100, 200 μg/mL의 농도에서 유의하게 증가시켰고, AFL이 포함된 배지에 HepG2 세포들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 HepG2의 TNF-α 생성을 AFL이 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서모두 유의하게 증가시켰으며, AFS가 포함된 배지에 HepG2 세포 들을 3시간 동안 배양한 결과에서도 HepG2의 TNF-α 생성을 AFS가 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 모두 유의하게 증가시켰다.
후속연구
- 또한 한약을 유산균이나 효모균으로 발효시켜 얻을 수 있는 유익성 획득을 위해 애엽을 발효하는 것이 애엽 본래의 TNF-α 생성증가능을 훼손 시키지 않는 것으로도 이해될 수 있다. 앞으로 애엽과 발효애엽을 이용한 인체면역기능강화제 개발을 위해 보다 많은 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 또한 한약을 유산균이나 효모균으로 발효시켜 얻을 수 있는 유익성 획득을 위해 애엽을 발효하는 것이 애엽 본래의 TNF-α 생성증가능을 훼손 시키지 않는 것으로도 이해될 수 있다. 앞으로 애엽과 발효애엽을 이용한 인체면역기능강화제 개발을 위해 보다 많은 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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