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문제 정의
- 본 연구는 여수시농업기술센터에서 여수 돌산 갓 고유품종 육성을 위해 지난 2001년부터 꾸준한 연구를 통해 돌산지역 재배포장에서 생태적으로 적응한 갓을 선발하여 분리육종 기술로 선발된 14 품종의 RAPD분석에 의한 유연관계를 분석하여 F1 조합 작성을 위한 원연계통을 선발하고자 수행 하였다.
제안 방법
- 100 μl의 1× TE buffer로 DNA를 용해시켰으며, spectrophotometer (Optizen 3220UV)를 이용하여 DNA를 정량하였다.
- 1에 나타냈다. 24종의 primer로부터 증폭된 52개 DNA 단편을 기초로 순계분리한 14 품종간의 Genetic similarity matrix를 분석하기 위하여 PCR 증폭된 밴드의 유, 무에 따라 유는 1, 무는 0으로 데이터화하고 NYSYS Complete Program을 이용하여 유사도 값을 구했다. 그 결과 돌산 갓 14 품종간의 유사도 계수는 0.
- DNA 추출은 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법[10]을 응용하여 추출하였다. 새로 신장한 어린 잎 0.
- 39종의 Random primer에서 특이적 band로 검출 된 24종의 primer를 찾을 수 있었다(Table 2). PCR 증폭 단편의 다형성과 재현성이 확실하면서 단편의 구분이 뚜렷한 OPA-4, OPA-7, OPA-8, OPA-11, OPA-14, OPB-6, OPB-18의 7종의 primer를 선발하였고, 이 중 4종의 primer를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 1.5% agarose gel상에 분획한 것을 Fig. 1에 나타냈다. 24종의 primer로부터 증폭된 52개 DNA 단편을 기초로 순계분리한 14 품종간의 Genetic similarity matrix를 분석하기 위하여 PCR 증폭된 밴드의 유, 무에 따라 유는 1, 무는 0으로 데이터화하고 NYSYS Complete Program을 이용하여 유사도 값을 구했다.
- 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. RAPD 분석결과 다형성을 나타내는 DNA 단편의 유무에 의해있는 경우는 1, 없는 경우는 0으로 기록하고 기초 행렬을 작성하였다. 유연관계 분석은 Nei와 Li [11]의 방법에 준하여 유사도 지수를 계산한 후 작성된 정보를 통계 프로그램인 NTSYS complete Program (Numerical taxonomy system과 multivariate analysis system, version 2.
- RAPD 분석을 위해 Perkin-Elmer사의 PE-9700을 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, PCR 반응액은 template DNA 10 ng, 50 pmol random primer, 10× Ex buffer, dNTP, 1 U Ex Taq (TaKaRa, Japan)를 혼합하여 최종량을 25 μl로 하였다.
- 동량의 phenol과 chloroform을 첨가하여 DNA를 정제하였고 isoprophanol 500 μl와 3 M sodium acetate 75 μl를 넣고 원심 분리시켜 DNA를 침전시켰다.
- 작물의 유전적 유연관계 분석 및 다양성 분석 방법으로 과거에는 주로 작물의 육종기록과 식물의 형태적 특성 및 생화학적 인자인 동위효소 다형화 분석에 근거를 두어 왔으나, 최근에 다양한 분자생물학적 방법을 이용한 분석이 다양한 품종의 육성과정에 활용되고 있는데[6-8], 이 중 Willams 등[15]에 의하여 개발된 RAPD 분석방법이 경제적 잇점으로 인하여 유연관계 분석에 많이 활용되고 있으므로[2,7], 순계로 분리한 14 품종으로 부터 total DNA를 추출, 정제하여 RAPD 분석법을 이용하여 이들 품종들 간의 유연관계를 분석하였다. 시판의 random primer 39종(Operon Co, USA)을 사용하여 PCR을 수행하였으며, oligonucleotide의 염기서열과 G+C 함량은 Table 2에 나타냈다. 각각의 primer에 있어서 1.
- 5% agarose gel에 전기영동한 후 UV transilluminator를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. RAPD 분석결과 다형성을 나타내는 DNA 단편의 유무에 의해있는 경우는 1, 없는 경우는 0으로 기록하고 기초 행렬을 작성하였다.
- 여수시농업기술센터에서 분리육종 기술로 선발된 14 품종의 생육특성 및 형태적 특성을 10개체씩 3번에 걸쳐 조사한 후, 잎조직으로부터 DNA를 추출하여 RAPD 분석에 이용하였다.
- 작물의 유전적 유연관계 분석 및 다양성 분석 방법으로 과거에는 주로 작물의 육종기록과 식물의 형태적 특성 및 생화학적 인자인 동위효소 다형화 분석에 근거를 두어 왔으나, 최근에 다양한 분자생물학적 방법을 이용한 분석이 다양한 품종의 육성과정에 활용되고 있는데[6-8], 이 중 Willams 등[15]에 의하여 개발된 RAPD 분석방법이 경제적 잇점으로 인하여 유연관계 분석에 많이 활용되고 있으므로[2,7], 순계로 분리한 14 품종으로 부터 total DNA를 추출, 정제하여 RAPD 분석법을 이용하여 이들 품종들 간의 유연관계를 분석하였다. 시판의 random primer 39종(Operon Co, USA)을 사용하여 PCR을 수행하였으며, oligonucleotide의 염기서열과 G+C 함량은 Table 2에 나타냈다.
- PCR 증폭 반응은 94℃에서 5분간 pre-denaturation한 다음 94℃에서 30초간 denaturation, 39℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 45회 반복한 후, 72℃에서 10분간 post-extension하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에 전기영동한 후 UV transilluminator를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다.
대상 데이터
- RAPD 분석을 위해 Perkin-Elmer사의 PE-9700을 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, PCR 반응액은 template DNA 10 ng, 50 pmol random primer, 10× Ex buffer, dNTP, 1 U Ex Taq (TaKaRa, Japan)를 혼합하여 최종량을 25 μl로 하였다. Random primer는 시판되는 39종(OPA 20종, OPB 19종, Operon Co, USA)을 사용하였다(Table 2). PCR 증폭 반응은 94℃에서 5분간 pre-denaturation한 다음 94℃에서 30초간 denaturation, 39℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 45회 반복한 후, 72℃에서 10분간 post-extension하였다.
데이터처리
- RAPD 분석결과 다형성을 나타내는 DNA 단편의 유무에 의해있는 경우는 1, 없는 경우는 0으로 기록하고 기초 행렬을 작성하였다. 유연관계 분석은 Nei와 Li [11]의 방법에 준하여 유사도 지수를 계산한 후 작성된 정보를 통계 프로그램인 NTSYS complete Program (Numerical taxonomy system과 multivariate analysis system, version 2.1, Applied Biostatistics Inc, USA)을 이용하여 유사도 값을 구했으며, UPGMA clustering 방법으로 14 품종간의 유연관계를 분석하였다.
성능/효과
- 5% agarose gel상에서 분획한 DNA 단편 수는 2개에서 27개로 다양하게 나타내었다. PCR 증폭된 DNA 단편의 크기는 0.2 kb에서 3.5 kb의 범위에 위치하였으며, 평균 8.7개의 단편이 증폭되었다(Table 2). 본 실험에 사용된 random primer 39종은 모두 10 mer로써 기존에 보고된 갓[12], 순무[1]에서의 평균 단편수와 유사하였지만, 브로콜리[13]의 3.
- 추대성 조사에서도 보통, 만추, 극만추의 3개의 그룹으로 나뉘어 졌는데 JC-5와 JD-4품종이 만추성을 나타내었고, JD-2품종은 극만추성을 나타내었다(Table 1). JD-2품종의 주요 특성으로서는 i) 식물체는 중간형이며 자엽이 크고 배축의 안토시아닌이 없거나 매우 약하였으며 ii) 엽색은 연록색이며 표면의 물결이 약하면서 잎 수가 작고 털의 수와 엽장은 중간정도, 결각의 크기가 작으며 도란형을 나타내었고 iii) 중륵은 반원형으로 폭과 두께가 중간, 중륵과 엽병에 혹·꼬임이 없었으며 iv) 엽병의 길이가 짧고 추대에 있어서 조기추대품종보다 온도와 일장에 아주 둔감하여 추대성이 30일이 늦은 극만추성 및 비결구성을 나타내었다. 따라서 이러한 특징을 나타내는 JD-2품종은 추대가 일찍 되어 수량이 떨어지지만 가격이 가장 높게 형성되는 시기로 판로 걱정이 없어 소득을 높일 수 있는 여름철 단경기 재배종으로 유리한 품종으로 판단되었다.
- 24종의 primer로부터 증폭된 52개 DNA 단편을 기초로 순계분리한 14 품종간의 Genetic similarity matrix를 분석하기 위하여 PCR 증폭된 밴드의 유, 무에 따라 유는 1, 무는 0으로 데이터화하고 NYSYS Complete Program을 이용하여 유사도 값을 구했다. 그 결과 돌산 갓 14 품종간의 유사도 계수는 0.49～0.86 사이로 나타났다. 분획된 단편의 종류(크기, 수)를 분석한 결과 14 품종의 돌산 갓은 Coefficient 0.
- 535를 기준으로 3개의 그룹으로 구분할 수 있었다. 그룹 Ⅰ은 JA-1, JA-2;그룹 Ⅱ는 JB-1, JC-1, JC-4, JD-2, JA-4, JB-2, JE-1, JD-4; 그룹Ⅲ는 JC-2, JC-5, JD-4, JC-6로 그룹 지어졌고, JC-2와 JC-5는 86%의 높은 유사도를 나타내었다(Fig. 2). 그러나 양적 형질 조사와 RAPD 분석과의 상관관계는 찾아 볼 수 없었다.
- JD-2품종의 주요 특성으로서는 i) 식물체는 중간형이며 자엽이 크고 배축의 안토시아닌이 없거나 매우 약하였으며 ii) 엽색은 연록색이며 표면의 물결이 약하면서 잎 수가 작고 털의 수와 엽장은 중간정도, 결각의 크기가 작으며 도란형을 나타내었고 iii) 중륵은 반원형으로 폭과 두께가 중간, 중륵과 엽병에 혹·꼬임이 없었으며 iv) 엽병의 길이가 짧고 추대에 있어서 조기추대품종보다 온도와 일장에 아주 둔감하여 추대성이 30일이 늦은 극만추성 및 비결구성을 나타내었다. 따라서 이러한 특징을 나타내는 JD-2품종은 추대가 일찍 되어 수량이 떨어지지만 가격이 가장 높게 형성되는 시기로 판로 걱정이 없어 소득을 높일 수 있는 여름철 단경기 재배종으로 유리한 품종으로 판단되었다.
- 이러한 결과는 몇 개의 양적 형질의 유사도가 RAPD분석 결과와 일치하는 것을 기대할 수는 없었지만 외부의 환경요인과 관계없이 유전적인 특성을 분류할 수 있는 방법으로는 RAPD분석이 유용하다는 것을 알았다. 또한, F1 종자생산에 있어서 잡종강세 현상에 유리한 계통은 유전적으로 거리가 먼 원연인 계통을 이용할수록 유리하다. 본 실험에서는 I 그룹과 Ⅲ 그룹간의 유전적 거리가 가장 멀리 나타난 결과로 부터 F1 조합 작성을 위하여 I 그룹과 Ⅲ 그룹에 속하는 계통을 교배 조합으로 이용하는 것이 가장 적합하다는 결론을 얻었다.
- 7개의 단편이 증폭되었다(Table 2). 본 실험에 사용된 random primer 39종은 모두 10 mer로써 기존에 보고된 갓[12], 순무[1]에서의 평균 단편수와 유사하였지만, 브로콜리[13]의 3.7개 보다는 평균 단편수가 많았다.
- 또한, F1 종자생산에 있어서 잡종강세 현상에 유리한 계통은 유전적으로 거리가 먼 원연인 계통을 이용할수록 유리하다. 본 실험에서는 I 그룹과 Ⅲ 그룹간의 유전적 거리가 가장 멀리 나타난 결과로 부터 F1 조합 작성을 위하여 I 그룹과 Ⅲ 그룹에 속하는 계통을 교배 조합으로 이용하는 것이 가장 적합하다는 결론을 얻었다.
- 86 사이로 나타났다. 분획된 단편의 종류(크기, 수)를 분석한 결과 14 품종의 돌산 갓은 Coefficient 0.535를 기준으로 3개의 그룹으로 구분할 수 있었다. 그룹 Ⅰ은 JA-1, JA-2;그룹 Ⅱ는 JB-1, JC-1, JC-4, JD-2, JA-4, JB-2, JE-1, JD-4; 그룹Ⅲ는 JC-2, JC-5, JD-4, JC-6로 그룹 지어졌고, JC-2와 JC-5는 86%의 높은 유사도를 나타내었다(Fig.
- 그러나 양적 형질 조사와 RAPD 분석과의 상관관계는 찾아 볼 수 없었다. 이러한 결과는 몇 개의 양적 형질의 유사도가 RAPD분석 결과와 일치하는 것을 기대할 수는 없었지만 외부의 환경요인과 관계없이 유전적인 특성을 분류할 수 있는 방법으로는 RAPD분석이 유용하다는 것을 알았다. 또한, F1 종자생산에 있어서 잡종강세 현상에 유리한 계통은 유전적으로 거리가 먼 원연인 계통을 이용할수록 유리하다.
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