본 연구는 gene tagging system(plasmid rescue와 inverse polymerase chain reaction)을 사용하여 얻은 배추($Brassica$$rapa$ ssp. $pekinensis$) 형질전환체 계통을 분석하고 이들의 표현형을 관찰하고자 수행되었다. 배추의 기능유전체 연구를 위해 $Agrobacterium$의 전이 DNA(T-DNA)를 사용하여 삽입돌연변이체를 유기하였다. 형질전환체는 '서울' 배추 품종의 pRCV2 vector를 가진 $Agrobacterium$$tumefaciens$을 접종하여 얻었다. 형질전환 $T_1$ 세대는 비형질전환체와 비교하여, 수술 수의 감소, 크거나 작은 꽃, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁거나 결각이 깊은 것과 같은 다양한 표현형을 보였다. 형질전환 계통 중에서 발견된 13개의 돌연변이 계통의 표현형 변화는 체세포의 배수성 분석을 통하여 염색체 수의 변화에 기인하지 않은 것을 확인하였다. 배추 genomic DNA에서 T-DNA의 위치 확인을 위해 multiple copy와 single copy 형질전환체에 plasmid rescue와 inverse PCR 방법을 각각 적용하였다. 비형질전환체와 비교하여 뚜렷한 표현형적 차이를 보이고 Southern blot 분석 결과 1 copy의 T-DNA를 가지며 염색체 수가 20(2n)인 돌연변이체를 선발하여, flanking DNA 염기서열을 확인하고 배추 염색체내에서 각각의 유전자좌를 표시하였으며 이들 계통들에 대하여 데이터베이스를 작성 중에 있다.
본 연구는 gene tagging system(plasmid rescue와 inverse polymerase chain reaction)을 사용하여 얻은 배추($Brassica$$rapa$ ssp. $pekinensis$) 형질전환체 계통을 분석하고 이들의 표현형을 관찰하고자 수행되었다. 배추의 기능유전체 연구를 위해 $Agrobacterium$의 전이 DNA(T-DNA)를 사용하여 삽입돌연변이체를 유기하였다. 형질전환체는 '서울' 배추 품종의 pRCV2 vector를 가진 $Agrobacterium$$tumefaciens$을 접종하여 얻었다. 형질전환 $T_1$ 세대는 비형질전환체와 비교하여, 수술 수의 감소, 크거나 작은 꽃, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁거나 결각이 깊은 것과 같은 다양한 표현형을 보였다. 형질전환 계통 중에서 발견된 13개의 돌연변이 계통의 표현형 변화는 체세포의 배수성 분석을 통하여 염색체 수의 변화에 기인하지 않은 것을 확인하였다. 배추 genomic DNA에서 T-DNA의 위치 확인을 위해 multiple copy와 single copy 형질전환체에 plasmid rescue와 inverse PCR 방법을 각각 적용하였다. 비형질전환체와 비교하여 뚜렷한 표현형적 차이를 보이고 Southern blot 분석 결과 1 copy의 T-DNA를 가지며 염색체 수가 20(2n)인 돌연변이체를 선발하여, flanking DNA 염기서열을 확인하고 배추 염색체내에서 각각의 유전자좌를 표시하였으며 이들 계통들에 대하여 데이터베이스를 작성 중에 있다.
The objectives of this study were to analyze mutant lines of Chinese cabbage ($Brassica$$rapa$ ssp. $pekinensis$) using gene tagging system (plasmid rescue and inverse polymerase chain reaction) and to observe the phenotypic characteristics. Insertional mutants were...
The objectives of this study were to analyze mutant lines of Chinese cabbage ($Brassica$$rapa$ ssp. $pekinensis$) using gene tagging system (plasmid rescue and inverse polymerase chain reaction) and to observe the phenotypic characteristics. Insertional mutants were derived by transferring DNA (T-DNA) of $Agrobacterium$ for functional genomics study in Chinese cabbage. The hypocotyls of Chinese cabbage 'Seoul' were used to obtain transgenic plants with $Agrobacterium$$tumefaciens$ harboring pRCV2 vector. To tag T-DNA from the Chinese cabbage genomic DNA, plasmid rescue and inverse PCR were applied for multiple copies and single copy insertional mutants. These techniques were successfully conducted to Chinese cabbage plant with high efficiency, and as a result, T-DNA of pRCV2 vector showed distinct various integration patterns in the transgenic plant genome. The polyploidy level analysis showed the change in phenotypic characteristics of 13 mutant lines was not due to variation in somatic chromosome number. Compared with wild type, the $T_1$ progenies showed varied phenotypes, such as decreased stamen numbers, larger or smaller flowers, upright growth habit, hairless leaves, chlorosis symptoms, narrow leaves, and deeply serrated leaves. The polyploidy level analysis showed the change in phenotypic characteristics of 13 mutant lines was not due to variation in somatic chromosome number. To tag T-DNA from the Chinese cabbage genomic DNA, plasmid rescue and inverse PCR were applied for multiple copies and single copy insertional mutants. Mutants that showed distinct phenotypic difference compared to wild type with 1 copy of T-DNA by Southern blot analysis, and with 2n = 20 of chromosome number were selected. These selected mutant lines were sequenced flanking DNA, mapped genomic loci, and the genome information of the lines is being recorded in specially developed database.
The objectives of this study were to analyze mutant lines of Chinese cabbage ($Brassica$$rapa$ ssp. $pekinensis$) using gene tagging system (plasmid rescue and inverse polymerase chain reaction) and to observe the phenotypic characteristics. Insertional mutants were derived by transferring DNA (T-DNA) of $Agrobacterium$ for functional genomics study in Chinese cabbage. The hypocotyls of Chinese cabbage 'Seoul' were used to obtain transgenic plants with $Agrobacterium$$tumefaciens$ harboring pRCV2 vector. To tag T-DNA from the Chinese cabbage genomic DNA, plasmid rescue and inverse PCR were applied for multiple copies and single copy insertional mutants. These techniques were successfully conducted to Chinese cabbage plant with high efficiency, and as a result, T-DNA of pRCV2 vector showed distinct various integration patterns in the transgenic plant genome. The polyploidy level analysis showed the change in phenotypic characteristics of 13 mutant lines was not due to variation in somatic chromosome number. Compared with wild type, the $T_1$ progenies showed varied phenotypes, such as decreased stamen numbers, larger or smaller flowers, upright growth habit, hairless leaves, chlorosis symptoms, narrow leaves, and deeply serrated leaves. The polyploidy level analysis showed the change in phenotypic characteristics of 13 mutant lines was not due to variation in somatic chromosome number. To tag T-DNA from the Chinese cabbage genomic DNA, plasmid rescue and inverse PCR were applied for multiple copies and single copy insertional mutants. Mutants that showed distinct phenotypic difference compared to wild type with 1 copy of T-DNA by Southern blot analysis, and with 2n = 20 of chromosome number were selected. These selected mutant lines were sequenced flanking DNA, mapped genomic loci, and the genome information of the lines is being recorded in specially developed database.
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문제 정의
따라서 본 연구는 T-DNA 삽입돌연변이 집단에서 표현형의 변화를 보인 계통을 선발하고 유전자 tagging과 mapping 방법을 이용하여 T-DNA의 삽입 위치를 분석하고 염색체의 배수성을 조사하였으며, 표현형과 관련된 유전자를 추정하여 돌연변이의 원인을 연구하였다.
본 연구는 gene tagging system(plasmid rescue와 inverse polymerase chain reaction)을 사용하여 얻은 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis) 형질전환체 계통을 분석하고 이들의 표현형을 관찰하고자 수행되었다. 배추의 기능유전체 연구를 위해 Agrobacterium의 전이 DNA(T-DNA)를 사용하여 삽입돌연변이체를 유기하였다.
현존하는 피자식물 중 약 30-70%가 배수성을 가지고 있을 것으로 여겨진다(Contreras 등, 2007a, 2007b; Osborn 등, 2003; Solti등, 2003). 본 연구에서는 상당히 다른 표현형을 보이는 21개의 돌연변이 계통을 대상으로 표현형의 변화가 조직배양이나 형질전환 과정에서 생기는 염색체 수의 변화가 아니라는 것을 배수성 분석을 통해 확인하였다. 배추의 염색체는 20(2n)인데, 7개 계통이 40(2n), 1개 계통이 19(2n)를 보였으며, 나머지 13개 계통은 20(2n)으로 확인되었다(Fig.
제안 방법
18시간 동안 혼성화[(NaH2PO4(mono-basic) 1 M, Na2HPO4(di-basic) 1M, 10% BSA, 20% SDS, EDTA 0.5M, 32P-dCTP, 65℃)] 반응된 nylon membrane은 2× SSC, 0.1% SDS와 0.1× SSC, 0.1% SDS로 각각 65℃에서 15분간 처리하였다.
21±2℃, 암조건에서 3일 동안 공동배양한 절편 체는 cefotaxime 200mg･L-1이 포함된 MS 기본액체배지에서 3회 반복하여 Agrobacterium을 제거해 주고 hygromycin 10mg･L-1가 첨가된 선발배지(MS 기본배지, 3% sucrose, NAA 1mg･L-1, BA 4mg･L-1, AgNO3 4mg･L-1, acetosyringone 10mg･L-1, cefotaxime 200mg･L-1, 1.6% bacto-agar, pH 5.8) 에 치상하였다.
BamH I, Dra I, EcoR I, Hind III, EcoR V, Xba I, and Sca I 등 7종의 제한효소에 의해 절단된 양친 genomic DNA 간에 다형성을 탐색하였고, 뚜렷한 다형성을 보인 제한효소에 의해 절단한 ‘장원’ 분리집단(JWF3p)을 0.9% agarose gel 상에 40 V, 16시간 전기영동한 후, Hybond-N+ nylon membrane에 전이 하였다.
탐침자로 활용키 위해, 분리한 flanking sequence가 포함된 플라스미드 양쪽을 T7과 T3 primer를 이용하여 PCR 하고, QIAGEN(Valencia, CA) gel extraction kits를 활용하여 flanking DNA만을 다량 분리하였다. P32-dCTP에 의해 표지화한 탐침자를 활용하여 혼성화시켰고, 염 농도에 따라 3단계로 세척하여 특이 밴드를 검출하였다(Kim 등, 2006). 유전자 연관 분석과 구성은 JoinMap 3.
PCR반응은 genomic DNA 1μL(100ng), HPT1과 HPT2 primer(10pmol) 각각 1μL, 2.5mM dNTPs 2μL, Taq polymerase(5units/μL) 0.5μL, 10× buffer 2μL, 그리고 나머지는 멸균수를 첨가하여 최종 반응액이 20μL가 되도록 하였다.
Rescue cloning 을 수행할 경우, pBluescript II KS(+)의 ampicillin 저항성 유전자와 ori 유전자를 중심으로 BamH I 제한효소를 사용 하면 right border쪽의 flanking DNA를, Hind III 제한효소를 사용하면 left border쪽의 flanking DNA를 알아낼 수 있다. Plasmid rescue 방법은 T-DNA가 2 copy 이상 삽입된 개체를 대상으로 수행하였고, T-DNA가 1 copy만 삽입된 개체는 inverse PCR을 수행하였다.
처리한 DNA 는 phenol, chloroform, isoamyl alcohol(25:24:1) 혼합용액으로 정제한 후 진공상태에서 DNA를 건조시켰다. Plasmid rescue를 위해 건조된 DNA를 증류수에 녹이고 self-ligation 을 실시한 뒤, 50ng의 ligated DNA는 SUREⓇ electroporationcompetent E. coli cells(Stratagene, USA)에 형질전환하였다. 형질전환 후 ampicillin 50mg･L-1이 첨가된 LB 고체배지를 이용하여 선발된 콜로니를 분석하였다.
T-DNA tagging 변이체의 게놈 삽입 위치를 결정하기 위하여 ‘장원’ 품종의 양친과 그 분리집단을 활용하였다.
T0 세대에서 pRCV2 vector의 형질전환 여부를 확인하기 위해서 HPT(hygromycin phosphotransferase)1 primer(5'- AGCCTGACCTATTGCATCTC C-3')와 HPT2 primer(5'- GGTTGTTACAGGACTGCCTGT-3') 쌍을 사용하여 PCR 검정을 실시하였다.
T1 세대의 flanking DNA 확인을 위해 inverse PCR을 수행하였으며 inverse PCR로 증폭된 product는 pGEMⓇ-T easy vector(Promega, USA)에 cloning 시킨 후 DH5α competent cell(E.coli)에 전이시켰다.
채취한 근단은 15℃의 α-bromonaphtalene 포화수용액에서 2시간 처리하고 수세하여 aceto-ethanol 고정액(acetic acid:ehanol=1:3)에 고정하여 70% ethanol에 넣어 냉동 저장하였다. 고정된 근단은 20분간 수세한 후 0.3% pectolyase Y-23, 0.3% cellulase, 0.3% cytohelicase 및 150mM citrate buffer로 조성한 효소 혼합액에 넣어 37℃에서 1-2시간 처리하고 60% acetic acid 용액을 적하 하여 squash 방법으로 슬라이드 위에 전개하여 검경하였다.
두 실험 모두 10µg의 genomic DNA를 BamH I 또는 Hind III 제한효소로 18시간동안 처리하였다.
화기관련 표현형으로는 수술의 수가 6개가 아닌 4개만 가지는 돌연변이 계통과 비형질전환체에 비해 꽃의 크기가 작거나큰 돌연변이 계통을 확인할 수 있었다. 또한 배추의 성숙모본 단계에서 다양한 돌연변이 계통이 확인되었는데, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁은 것, 결각이 깊은 잎 등의 비정상적인 표현형을 관찰하였다(Fig. 3). 그리고 몇몇 돌연변이 계통들은 5장의 꽃잎, 잠자리 날개 형태의 꽃잎, 진한 노란색의 주름진 꽃잎, 뒤틀린 꽃잎 등을 가졌으며, 성숙모본에서는 심하게 뒤틀린 잎, 긴 잎, 로제트 형태, 작고 둥근 잎, 굴곡진 잎, 광택이 나는 잎 등의 표현형을 보였다.
pekinensis) 형질전환체 계통을 분석하고 이들의 표현형을 관찰하고자 수행되었다. 배추의 기능유전체 연구를 위해 Agrobacterium의 전이 DNA(T-DNA)를 사용하여 삽입돌연변이체를 유기하였다. 형질전환체는 ‘서울’ 배추 품종의 pRCV2 vector를 가진 Agrobacterium tumefaciens을 접종하여 얻었다.
배추종자를 ethanol과 sodium hypochlorite(NaOCl)로 소독 후, 16시간 일장으로 7일 동안 기내 생장시킨 개체에서 하 배축을 잘라 형질전환에 이용하였다. 이 때 하배축은 1cm 길이로, 생장점 부위가 포함되지 않도록 절단하였다.
또한 배추는 애기장대와 같은 배추과 작물로서 애기장대와 80% 이상의 염기서열 상동성을 가지므로(Lee 등, 2004) 애기장대 연구 결과는 배추 유전자 연구에 적용될 수 있다. 본 연구 역시 애기장대 database를 바탕으로 형질전환체의 flanking DNA sequence를 분석하였다.
선발된 흰색 콜로니는 LB액체배지를 이용하여 200rpm, 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하였고, HiYieldTM plasmid mini kit(Real Biotech Corporation, Korea)을 이용하여 plasmid 를 분리하였다. 분리된 plasmid DNA는 EcoR I을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 1% agarose gel 상에서 cloning 여부를 확인하였다.
X-gal 400mg･L-1, IPTG 20mg･L-1 , ampicillin 50mg･L-1이 첨가된 LB고체배지를 이용하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 흰색 콜로니를 선발하였다. 선발된 흰색 콜로니는 LB액체배지를 이용하여 200rpm, 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하였고, HiYieldTM plasmid mini kit(Real Biotech Corporation, Korea)을 이용하여 plasmid 를 분리하였다. 분리된 plasmid DNA는 EcoR I을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 1% agarose gel 상에서 cloning 여부를 확인하였다.
여기에 isopropyl alcohol 950 μL를 넣어 invert 를 반복함으로써 DNA를 추출하였다.
대조군인 비형질전환체의 종자 역시 같은 시기, 같은 장소에 파종하였다. 온실 파종 4개월 후 충분히 자란 식물체를 대상으로 표현형을 관찰하였다. 화기관련 표현형으로는 수술의 수가 6개가 아닌 4개만 가지는 돌연변이 계통과 비형질전환체에 비해 꽃의 크기가 작거나큰 돌연변이 계통을 확인할 수 있었다.
2). 이상의 방법으로 얻은 배추 돌연변이 집단을 대상으로 표현형 검정을 수행하고 이들 돌연변이체 중 표현형에서 변이를 보이는 돌연변이 계통 들은 각 개체별로 database화하였으며 표현형이 뚜렷한 개체들은 T2까지 재배하여 고정하였다.
절단한 하배축은 pRCV2 vector(Fig. 1)를 가진 Agrobacterium LBA4404 strain용액에 6분 동안 침지시키는 방법으로 접종하고, 공동배양배지[Murashige & Skoog(MS) 기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, NAA 1mg･L-1, BA 4mg･L-1, AgNO3 4mg･L-1, and acetosyringone 10mg･L-1, pH 5.8]에 치상하였다.
8) 에 치상하였다. 절편체에서 발생된 callus를 동일한 조건의 선발배지에 옮겨 신초를 유도하였고, 유기된 신초는 발근배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, pH 5.8)에 옮겨 발근시켰다.
증폭된 PCR 산물은 1× TBE buffer를 사용하여 1% agarose gel 상에서 70V, 40분간 전기영동하여 ethidium bromide (EtBr)로 염색한 후, UV illuminator를 이용하여 반응산물을 확인하였다.
체세포 염색체를 관찰하기 위해 종자를 수분이 있는 페트리디쉬에 치상한 후 25℃에서 이틀간 발아시킨 다음, 2-3 cm정도 자란 근단을 채취하였다. 채취한 근단은 15℃의 α-bromonaphtalene 포화수용액에서 2시간 처리하고 수세하여 aceto-ethanol 고정액(acetic acid:ehanol=1:3)에 고정하여 70% ethanol에 넣어 냉동 저장하였다.
추정 형질전환체의 Genomic DNA 10μg을 제한효소 BamH I 또는 Hind III를 첨가하여 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 1× TBE buffer를 사용하여 1% agarose gel 상에서 30V, 15시간 전기영동하였다.
9% agarose gel 상에 40 V, 16시간 전기영동한 후, Hybond-N+ nylon membrane에 전이 하였다. 탐침자로 활용키 위해, 분리한 flanking sequence가 포함된 플라스미드 양쪽을 T7과 T3 primer를 이용하여 PCR 하고, QIAGEN(Valencia, CA) gel extraction kits를 활용하여 flanking DNA만을 다량 분리하였다. P32-dCTP에 의해 표지화한 탐침자를 활용하여 혼성화시켰고, 염 농도에 따라 3단계로 세척하여 특이 밴드를 검출하였다(Kim 등, 2006).
확인된 T0 돌연변이체에서 획득한 종자(T1 종자)를 각각 10개씩 파종하여 PCR 분석을 통해 형질전환 여부를 확인하고 표현형을 관찰하였다. 대조군인 비형질전환체의 종자 역시 같은 시기, 같은 장소에 파종하였다.
대상 데이터
coli)에 전이시켰다. X-gal 400mg･L-1, IPTG 20mg･L-1 , ampicillin 50mg･L-1이 첨가된 LB고체배지를 이용하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 흰색 콜로니를 선발하였다. 선발된 흰색 콜로니는 LB액체배지를 이용하여 200rpm, 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하였고, HiYieldTM plasmid mini kit(Real Biotech Corporation, Korea)을 이용하여 plasmid 를 분리하였다.
(Seoul, Korea)에 의뢰 하였다. 염기서열 결과는 National Center for Biotechnology Information(NCBI) database(www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용 하여 분석하였다.
형질전환체는 ‘서울’ 배추 품종의 pRCV2 vector를 가진 Agrobacterium tumefaciens을 접종하여 얻었다.
이론/모형
돌연변이 유기에 가장 흔하게 이용되는 방법은 Agrobacterium tumefaciens를 이용한 방법이다. 그러나 기존의 A. tumefaciens를 이용한 식물체 형질전환(Bevan, 1984; Hoekema 등, 1983, 1984; Pereira, 2000; Van Kavaveke 등, 1974)이 배추에서 아주 낮은 성공률을 보이기 때문에 본 연구에서는 Lee 등(2004)이 확립한 개선된 배추형질전환 방법에 따라 형질전환을 실시하여 형질전환체의 대량유기에 성공하였다. 또한 배추는 애기장대와 같은 배추과 작물로서 애기장대와 80% 이상의 염기서열 상동성을 가지므로(Lee 등, 2004) 애기장대 연구 결과는 배추 유전자 연구에 적용될 수 있다.
형질전환 계통 중에서 발견된 13개의 돌연변이 계통의 표현형 변화는 체세포의 배수성 분석을 통하여 염색체 수의 변화에 기인하지 않은 것을 확인하였다. 배추 genomic DNA에서 T-DNA의 위치 확인을 위해 multiple copy와 single copy 형질전환체에 plasmid rescue와 inverse PCR 방법을 각각 적용하였다. 비형질전환체와 비교하여 뚜렷한 표현형적 차이를 보이고 Southern blot 분석 결과 1 copy 의 T-DNA를 가지며 염색체 수가 20(2n)인 돌연변이체를 선발 하여, flanking DNA 염기서열을 확인하고 배추 염색체내에서 각각의 유전자좌를 표시하였으며 이들 계통들에 대하여 데이터베이스를 작성 중에 있다.
배추에서 pRCV2 vector의 T-DNA가 전이된 삽입돌연변이체의 대량 생산을 Lee 등(2004)의 배추 형질전환 방법에 따라 ‘서울’ 배추의 하배축을 이용하여 형질전환하였다.
이 연구는 배추 기능유전체학 연구의 중요한 토대가 되는 것으로 현재도 계속 진행 중이다(Kim 등, 2006; Lim 등, 2005, 2007). 염기서열 확인은 flanking DNA와 T-DNA에 근접한 위치의 sequencing primer들을 이용하였고, 획득한 염기서열은 NCBI database의 BLASTN 분석 방법을 이용해 동정하였다. 그 결과, Brassica rapa, B.
P32-dCTP에 의해 표지화한 탐침자를 활용하여 혼성화시켰고, 염 농도에 따라 3단계로 세척하여 특이 밴드를 검출하였다(Kim 등, 2006). 유전자 연관 분석과 구성은 JoinMap 3.0(Van Ooijen과 Voorrips, 2001)을 이용하였다.
성능/효과
염기서열 확인은 flanking DNA와 T-DNA에 근접한 위치의 sequencing primer들을 이용하였고, 획득한 염기서열은 NCBI database의 BLASTN 분석 방법을 이용해 동정하였다. 그 결과, Brassica rapa, B. napus, B. juncea, B. oleracea, Arabidopsis thaliana, Lycopersicum esculentum 및 Oryza sativa 등의 다양한 유전자와 높은 상동성을 보여 plasmid rescue와 inverse PCR 기술에 성공적으로 수행되었으며, pRCV2 vector의 T-DNA가 형질전환체 게놈상에 다양한 형태로 삽입되었음을 확인할 수 있었다(Table 1).
3). 그리고 몇몇 돌연변이 계통들은 5장의 꽃잎, 잠자리 날개 형태의 꽃잎, 진한 노란색의 주름진 꽃잎, 뒤틀린 꽃잎 등을 가졌으며, 성숙모본에서는 심하게 뒤틀린 잎, 긴 잎, 로제트 형태, 작고 둥근 잎, 굴곡진 잎, 광택이 나는 잎 등의 표현형을 보였다. 또한 노란색을 띄며 녹색이 약한 잎을 가진 황백화 현상 개체들과 색소결핍현상 개체들은 크게 자라지 못하고 시들거나 죽었다(자료 미제시).
4). 따라서 13개의 돌연변이 계통의 표현형의 변화는 체세포 염색체 수의 변화와 관계없이 T-DNA가 삽입됨으로써 특정 표현형이 변하였음을 알 수 있었다.
본 연구에서는 상당히 다른 표현형을 보이는 21개의 돌연변이 계통을 대상으로 표현형의 변화가 조직배양이나 형질전환 과정에서 생기는 염색체 수의 변화가 아니라는 것을 배수성 분석을 통해 확인하였다. 배추의 염색체는 20(2n)인데, 7개 계통이 40(2n), 1개 계통이 19(2n)를 보였으며, 나머지 13개 계통은 20(2n)으로 확인되었다(Fig. 4). 따라서 13개의 돌연변이 계통의 표현형의 변화는 체세포 염색체 수의 변화와 관계없이 T-DNA가 삽입됨으로써 특정 표현형이 변하였음을 알 수 있었다.
형질전환 T1 세대는 비형질전환체와 비교하여, 수술 수의 감소, 크거나 작은 꽃, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁거나 결각이 깊은 것과 같은 다양한 표현형을 보였다. 형질전환 계통 중에서 발견된 13개의 돌연변이 계통의 표현형 변화는 체세포의 배수성 분석을 통하여 염색체 수의 변화에 기인하지 않은 것을 확인하였다. 배추 genomic DNA에서 T-DNA의 위치 확인을 위해 multiple copy와 single copy 형질전환체에 plasmid rescue와 inverse PCR 방법을 각각 적용하였다.
온실 파종 4개월 후 충분히 자란 식물체를 대상으로 표현형을 관찰하였다. 화기관련 표현형으로는 수술의 수가 6개가 아닌 4개만 가지는 돌연변이 계통과 비형질전환체에 비해 꽃의 크기가 작거나큰 돌연변이 계통을 확인할 수 있었다. 또한 배추의 성숙모본 단계에서 다양한 돌연변이 계통이 확인되었는데, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁은 것, 결각이 깊은 잎 등의 비정상적인 표현형을 관찰하였다(Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
기능유전체학이란?
기능유전체학(functional genomics)은 게놈 연구에 의해 축적된 방대한 양의 정보를 이용하여 유전자의 기능과 유전자 간의 상호작용을 알아내는 분자생물학의 한 분야이다. 그리고 기능유전체학은 DNA의 염기서열이나 구조와 같은 정적인 게놈 정보에 대한 연구가 아닌 유전자의 전사와 번역, 단백질 간의 상호작용 등 동적인 연구에 초점을 맞추고 있다.
기능유전체학의 연구 초점은?
기능유전체학(functional genomics)은 게놈 연구에 의해 축적된 방대한 양의 정보를 이용하여 유전자의 기능과 유전자 간의 상호작용을 알아내는 분자생물학의 한 분야이다. 그리고 기능유전체학은 DNA의 염기서열이나 구조와 같은 정적인 게놈 정보에 대한 연구가 아닌 유전자의 전사와 번역, 단백질 간의 상호작용 등 동적인 연구에 초점을 맞추고 있다. 또한 이 연구는 두 모델 식물인 애기장대와 벼(Goff 등, 2002)의 게놈 염기서열 분석이 마무리되고, expressed sequence tags 분석과 DNA microarray 기술의 진보에 힘입어 더욱 가속화 되었다.
기능유전체학 연구가 가속화된 계기는?
그리고 기능유전체학은 DNA의 염기서열이나 구조와 같은 정적인 게놈 정보에 대한 연구가 아닌 유전자의 전사와 번역, 단백질 간의 상호작용 등 동적인 연구에 초점을 맞추고 있다. 또한 이 연구는 두 모델 식물인 애기장대와 벼(Goff 등, 2002)의 게놈 염기서열 분석이 마무리되고, expressed sequence tags 분석과 DNA microarray 기술의 진보에 힘입어 더욱 가속화 되었다. 현재는 이러한 연구방법을 모두 이용하여 한 가지 방법으로 유전자의 기능을 구명하던 시간을 단축하고 정확도를 높여 효율적인 기능유전체학 연구가 가능하게 되었다(Ge 등, 2003; Holtorf 등, 2002).
참고문헌 (19)
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