광학현미경과 투과전자현미경을 이용한 토끼와 닭 대퇴골의 미세구조 분석 Microstructure Analysis of Rabbit and Chicken Femurs by Light Microscopy and Transmission Electron Microscopy원문보기
뼈는 단계별 (hierarchical) 구조를 가진 복합 재료이며 독특한 구조와 기계적 특성 때문에 재료공학 분야에서 많이 연구되어져 왔다. 뼈는 주로 hydroxyapatite, 콜라겐과 물로 구성된 층판형 유 무기 재료 복합체이다. 주요 무기물로써 hydroxyapatite로 잘 알려진 calcium phosphate를 통하여 뼈는 특유의 강도를 유지하게 된다. 본 실험에서는 광학 현미경(LM)과 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 구조를 연구하였다. 구성물질 분석은 대퇴골의 calcium, potassium, oxygen 분포 변화를 알아보는데 이용하였다. 실험은 두 구조 범위에 중점을 두었다: micro scale에서 치밀골의 배열을, nano scale에서 콜라겐 섬유와 apatite 결정을 관찰하였다. Micro scale에서 닭과 토끼 대퇴골 구조의 뚜렷한 차이점이 발견되었다. Nano scale에서는 apatite 결정의 모양과 크기 그리고 콜라겐의 배열을 비교 분석하였다. 그 결과 토끼와 닭은 종이 다름에도 불구하고 nano scale에서는 화학성분과 구조가 매우 유사한 것으로 나타났다.
뼈는 단계별 (hierarchical) 구조를 가진 복합 재료이며 독특한 구조와 기계적 특성 때문에 재료공학 분야에서 많이 연구되어져 왔다. 뼈는 주로 hydroxyapatite, 콜라겐과 물로 구성된 층판형 유 무기 재료 복합체이다. 주요 무기물로써 hydroxyapatite로 잘 알려진 calcium phosphate를 통하여 뼈는 특유의 강도를 유지하게 된다. 본 실험에서는 광학 현미경(LM)과 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 구조를 연구하였다. 구성물질 분석은 대퇴골의 calcium, potassium, oxygen 분포 변화를 알아보는데 이용하였다. 실험은 두 구조 범위에 중점을 두었다: micro scale에서 치밀골의 배열을, nano scale에서 콜라겐 섬유와 apatite 결정을 관찰하였다. Micro scale에서 닭과 토끼 대퇴골 구조의 뚜렷한 차이점이 발견되었다. Nano scale에서는 apatite 결정의 모양과 크기 그리고 콜라겐의 배열을 비교 분석하였다. 그 결과 토끼와 닭은 종이 다름에도 불구하고 nano scale에서는 화학성분과 구조가 매우 유사한 것으로 나타났다.
Bone is a hierarchically structured composite material which has been well studied by the materials engineering community because of its unique structure and mechanical properties. Bone is a laminated organic-inorganic composite composed of primarily hydroxyapatite, collagen and water. The main mine...
Bone is a hierarchically structured composite material which has been well studied by the materials engineering community because of its unique structure and mechanical properties. Bone is a laminated organic-inorganic composite composed of primarily hydroxyapatite, collagen and water. The main mineral that gives bone's hardness is calcium phosphate, which is also known as hydroxyapatite. Light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to study the structure of femurs from chicken and rabbit. The elemental analysis was used to search variation in the distribution of calcium, potassium and oxygen in the femur. Current investigation focused on two structural scales: micro scale (arrangement of compact bone) and nano scale (collagen fibril and apatite crystals). At micro scale, distinct difference was found in microstructures of chicken femur and rabbit femur. At nano scale, we analyzed the shape and size of apatite crystals and the arrangement of collagen fibril. Consequently, femurs of chicken and rabbit had very similar chemical property and structures at nano scale despite of their different species.
Bone is a hierarchically structured composite material which has been well studied by the materials engineering community because of its unique structure and mechanical properties. Bone is a laminated organic-inorganic composite composed of primarily hydroxyapatite, collagen and water. The main mineral that gives bone's hardness is calcium phosphate, which is also known as hydroxyapatite. Light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to study the structure of femurs from chicken and rabbit. The elemental analysis was used to search variation in the distribution of calcium, potassium and oxygen in the femur. Current investigation focused on two structural scales: micro scale (arrangement of compact bone) and nano scale (collagen fibril and apatite crystals). At micro scale, distinct difference was found in microstructures of chicken femur and rabbit femur. At nano scale, we analyzed the shape and size of apatite crystals and the arrangement of collagen fibril. Consequently, femurs of chicken and rabbit had very similar chemical property and structures at nano scale despite of their different species.
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문제 정의
본 실험에서는 토끼와 닭 대퇴골(femur)의 구조와 조성의 차이점을 광학현미경과 전자현미경을 이용하여 밝혀보고자 하였다. 시료 준비 과정에서 본래 가지고 있는 뼈의 성분과 구조에 변형이 일어나는 것을 최소화하기 위해서 뼈 속 혈관 내 혈액만을 제거한 후 탈회(decalcification) 등 다른 화학적 처리를 하지 않고 광학현미경 및 전자현미경 관찰을 실행하였다.
제안 방법
10~500 μm의 범위는 광학현미경을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 섬유주 구조(trabecula structure), 하버시안 관(haversian canal) 및 골원(osteon)을 관찰하였고, 20 nm~10 μm의 범위에서는 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 콜라겐 섬유의 배열, HAp 결정 및 성장 방향을 알아보았다.
초박 시편 준비는 토끼와 닭 대퇴골을 epoxy인 caldofix resin (Struers)과 caldofix hardener (Struers) 를 10 : 1 비율로 혼합하여 시료에 고정시킨 후 oven을 이용하여 60°C에서 12시간 이상 보관하였다. Ultramicrotome (UT, Powertome X, RMC)를 이용하여 초박 시편을 제작하고 300 mesh copper grid에 수집하여 탄소 코팅을 한 후 TEM 분석을 하였다. TEM은 field emission TEM (FE-TEM, JEM 2100F, 200 kV, JEOL)과 energy filtering TEM (EF-TEM, EM 912 Omega, 120 kV, Zeiss)을 이용하였다.
TEM 분말 시편 준비는 막자사발을 이용하여 실험동물의 대퇴골을 분쇄하여 에탄올에 넣은 뒤 ultrasonic cleaner (model 3510, Bransonic)를 이용하여 분산시킨 후 탄소막을 입힌 300 mesh copper grid에 떨어뜨렸다. 그리고 습도 조절 desiccator에서 10시간 이상 건조시킨 후 탄소 코팅을 하여 시료를 관찰하였다. 초박 시편 준비는 토끼와 닭 대퇴골을 epoxy인 caldofix resin (Struers)과 caldofix hardener (Struers) 를 10 : 1 비율로 혼합하여 시료에 고정시킨 후 oven을 이용하여 60°C에서 12시간 이상 보관하였다.
먼저 microsaw를 이용해서 뼈를 1 cm로 자르고 wax를 이용하여 시편 연마기에 부착한 후 다이아몬드 필름(diamond film)을 이용하여 90μm 이내의 두께로 연마하여 시편을 관찰하였다.
뼈에 대한 연구는 오랫동안 계속되어 왔지만 순수 무기질 부분에 대해서는 아직까지도 많은 연구가 필요한 실정이다. 무기질에 대한 이해를 높이기 위해 실험을 진행하였으며 그 대상으로 토끼와 닭의 대퇴골을 이용하였다. 본 실험에서 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 구조적, 화학적 조성 차이를 알아보았다.
무기질에 대한 이해를 높이기 위해 실험을 진행하였으며 그 대상으로 토끼와 닭의 대퇴골을 이용하였다. 본 실험에서 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 구조적, 화학적 조성 차이를 알아보았다. 광학현미경을 이용한 결과를 보았을 때 세관 균열의 방향성 및 골원의 분포 차이를 쉽게 확인 할 수 있었지만 XRD, EDS, TEM을 이용한 명시야상 및 암시야상을 보았을 때 큰 차이를 찾아보기 힘들었다.
분말 X-ray diffraction (XRD, D8 advance, Bruker)용 시편의 경우 토끼와 닭의 대퇴골을 막자사발로 분쇄하고 XRD holder에 채운 후 시료 내부에 빈공간이 생기지 않게 압축 시키고 높이를 일정하게 유지해 준 후 분석하였다.
분말 시편의 경우 나노입자로 이루어져 있기 때문에 고분해능에 유리한 FE-TEM을 이용하여 이미지를 관찰하였고, UT 시편의 경우 energy filter를 통하여 전자회절도형 분석에 유리한 EF-TEM을 이용하여 시편을 관찰하였다. 토끼와 닭의 대퇴골 분말시편을 TEM 명시야상으로 보았을 때 Fig.
본 실험에서는 토끼와 닭 대퇴골(femur)의 구조와 조성의 차이점을 광학현미경과 전자현미경을 이용하여 밝혀보고자 하였다. 시료 준비 과정에서 본래 가지고 있는 뼈의 성분과 구조에 변형이 일어나는 것을 최소화하기 위해서 뼈 속 혈관 내 혈액만을 제거한 후 탈회(decalcification) 등 다른 화학적 처리를 하지 않고 광학현미경 및 전자현미경 관찰을 실행하였다. 실험은 크게 10~500 μm의 범위와 20 nm~10 μm의 범위로 구분지어 연구를 진행하였다.
실험은 크게 10~500 μm의 범위와 20 nm~10 μm의 범위로 구분지어 연구를 진행하였다.
콜라겐 섬유에 따른 HAp 결정의 성장방향 및 배열을 알아보기 위해 Fig. 5의 동일한 부분에서 EF-TEM의 x, y tilting을 이용하여 전자회절도형을 관찰하였다. 토끼 대퇴골의 경우 Fig.
토끼와 닭 대퇴골의 화학조성 및 구성물질을 알아보기 위해서 TEM-EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) 분석과 XRD 분석을 하였다. 먼저 EDS 분석의 경우 토끼와 닭 대퇴골의 분말 시편에서 각각 10 point를 선택하여 각 부분의 성분 분석을 한 결과 Fig.
토끼와 닭 뼈를 화학처리하지 않고 그대로 광학현미경 시료로 제작하기 위해서 microsaw (Precision saw, BUEHLER)와 시편 연마기를 이용하였다. 먼저 microsaw를 이용해서 뼈를 1 cm로 자르고 wax를 이용하여 시편 연마기에 부착한 후 다이아몬드 필름(diamond film)을 이용하여 90μm 이내의 두께로 연마하여 시편을 관찰하였다.
대상 데이터
Ultramicrotome (UT, Powertome X, RMC)를 이용하여 초박 시편을 제작하고 300 mesh copper grid에 수집하여 탄소 코팅을 한 후 TEM 분석을 하였다. TEM은 field emission TEM (FE-TEM, JEM 2100F, 200 kV, JEOL)과 energy filtering TEM (EF-TEM, EM 912 Omega, 120 kV, Zeiss)을 이용하였다.
본 연구에서는 9주령 New Zealand white rabbit 암컷(Samtako-Bio Korea)을 사용하였으며 닭은 20주령 토종닭 암컷을 사용하였다. 기능에 따라 뼈는 크게 장골(long bone)과 편평골 (flat bone), 단골 (short bone), 불규칙 골 (irregular bone)으로 나뉘는데 본 실험에서는 장골인 대퇴골을 사용하였다. 각각의 뼈를 발취하여 4% paraformaldehyde (PFA) 용액에 고정하였다.
본 연구에서는 9주령 New Zealand white rabbit 암컷(Samtako-Bio Korea)을 사용하였으며 닭은 20주령 토종닭 암컷을 사용하였다. 기능에 따라 뼈는 크게 장골(long bone)과 편평골 (flat bone), 단골 (short bone), 불규칙 골 (irregular bone)으로 나뉘는데 본 실험에서는 장골인 대퇴골을 사용하였다.
성능/효과
각 분말의 구성물질을 알아보기 위해서 XRD 분석을 한결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 모두 apatite 결정인 것으로 나타났다. Fig.
본 실험에서 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 토끼와 닭 대퇴골의 구조적, 화학적 조성 차이를 알아보았다. 광학현미경을 이용한 결과를 보았을 때 세관 균열의 방향성 및 골원의 분포 차이를 쉽게 확인 할 수 있었지만 XRD, EDS, TEM을 이용한 명시야상 및 암시야상을 보았을 때 큰 차이를 찾아보기 힘들었다. 하지만 EDS 분석을 통하여 HAp 결정의 주요 구성성분인 Ca, P, O를 확인할 수 있었고, 미량의 Si가 검출된 것으로 토끼와 닭이 성장기에 있는 것을 알 수 있었다.
UT 시편의 경우 뼈 내에서 콜라겐과 HAp의 상호 유기성과 각 배열을 확인하기 용이하였다. 또한 명시야상을 통해서 토끼와 닭 대퇴골에서 모두 콜라겐의 배열을 확인할 수 있었으며 콜라겐의 배열에 따른 HAp 결정의 성장방향 및 분포는 시료를 tilting하여 변화를 주고 같은 위치의 전자회절도형을 분석하여 유추할 수 있었다.
2와 같이 나타났다. 분석 위치에 따라 조성 변화를 보이지만 Ca, P, O, Si로 구성되어 있는 것을 확인 할 수 있었는데 이는 뼈를 구성하고 있는 HAp 의 주성분인 Ca, P, O가 나타나는 것을 알 수 있었다. Carlisle (1970)의 연구에 의해 뼈 형성 초기단계에 Si 이온이 효과적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌는데 Si 성분의 검출은 실험에 사용된 토끼와 닭이 완전한 성체로 자란 것이 아닌 성장단계에 있는 것을 예측할 수 있었다.
광학현미경을 이용한 결과를 보았을 때 세관 균열의 방향성 및 골원의 분포 차이를 쉽게 확인 할 수 있었지만 XRD, EDS, TEM을 이용한 명시야상 및 암시야상을 보았을 때 큰 차이를 찾아보기 힘들었다. 하지만 EDS 분석을 통하여 HAp 결정의 주요 구성성분인 Ca, P, O를 확인할 수 있었고, 미량의 Si가 검출된 것으로 토끼와 닭이 성장기에 있는 것을 알 수 있었다. UT 시편의 경우 뼈 내에서 콜라겐과 HAp의 상호 유기성과 각 배열을 확인하기 용이하였다.
후속연구
, 1993). 뼈의 구성성분과 구조, 기계적∙화학적 현상을 다양한 범위에서 해석한다면 각 요소들 사이의 관계를 이해하는데 도움이 될 것으로 사료되어 실험을 진행하였다.
이번 연구로 토끼와 닭의 종간 무기질의 미세구조차이를 완전히 밝히긴 어려웠다. 하지만 뼈의 유기질과 무기질을 효과적으로 분리한 후 시편관찰이 가능하다면 뼈의 HAp에 대한 이해와 연구가 더욱 활발히 진행 될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
뼈는 무엇으로 구성되어 있는가?
, 1998). 또한 뼈는 다층구조로 콜라겐 (collagen), apatite, 물(water)로 구성되어 있으며 이중에서 apatite 는 뼈의 65 wt.%를 차지함으로써 뼈의 강도에 영향을 미친다(Olszta et al.
기능에 따라 닭 뼈는 크게 어떻게 나뉘는가?
본 연구에서는 9주령 New Zealand white rabbit 암컷(Samtako-Bio Korea)을 사용하였으며 닭은 20주령 토종닭 암컷을 사용하였다. 기능에 따라 뼈는 크게 장골(long bone)과 편평골 (flat bone), 단골 (short bone), 불규칙 골 (irregular bone)으로 나뉘는데 본 실험에서는 장골인 대퇴골을 사용하였다. 각각의 뼈를 발취하여 4% paraformaldehyde (PFA) 용액에 고정하였다.
Apatite는 뼈의 몇 %를 차지함으로써 뼈의 강도에 영향을 미치는가?
, 1998). 또한 뼈는 다층구조로 콜라겐 (collagen), apatite, 물(water)로 구성되어 있으며 이중에서 apatite 는 뼈의 65 wt.%를 차지함으로써 뼈의 강도에 영향을 미친다(Olszta et al., 2007).
참고문헌 (10)
Carlisle EM: Silicon: a possible factor in bone calcification. Science 167 : 279, 1970.
Glimcher MJ: Bone: Nature of the calcium phosphate crystals and cellular, structural, and physical chemical mechanisms in their formation. In: Nita S, ed, Review in Mineralogy & Geochemistry 64 : 223-282, 2006.
Landis WJ, Song MJ, Leith A, McEwen L, McEwen BF: Mineral and organic matrix interaction in normally calcifying tendon visualized in three dimensions by high-voltage electron microscopic tomography and graphic image reconstruction. Journal of Structural Biology 110 : 39-54, 1993.
Olszta MJ, Cheng X, Jee SS, Kumar R, Kim YY, Kaufman MJ, Douglas EP, Gower LB: Bone structure and formation: A new perspective. Material Science & Engineering R58 : 77-166, 2007.
Rensberger JM, Watabe M: Fine structure of bone in dinosaurs, birds and mammals. Nature 406 : 619-622, 2000.
Robinson RA: An electron microscopy study of the crystalline inorganic components of bone and its relationship to the organic matrix. Journal of Bone and Joint Surgery 34A : 389-434, 1952.
Rubin MA, Rubine J, Jasiuk I: SEM and TEM study of the hierarchical structure of C57BL/6J and C3H/HeJ mice trabecular bone. Bone 35 : 11-20, 2004.
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