식물병원성 진균에 항균 효과를 지닌 슈도모나스 균주의 항진균 활성 증진을 위한 배양조건의 최적화 Antifungal Activities of Pseudomonas spp. Strains Against Plant Pathogens and Optimization of Culture Conditions원문보기
골프 코스 잔디 뿌리부근의 토양으로부터 분리된 4종 Pseudomonas spp.의 배양조건과 잔디에 갈색마름병의 원인이 되는 R. solani와 동전마름병의 원인이 되는 S. homoeocarpa에 대한 항진균 활성을 조사하였다. 배양조건으로는 pH 7.0으로 $20-25^{\circ}C$에서 배양할 때 생육도 우수하며 양호한 항진균 활성을 나타내었다. 대량배양을 위한 기본배지로 King's B 배지를 사용하였으며 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 tryptone을, 무기염류로는 $K_2HPO_4$를 첨가하였을 때 균의 생육이 가장 우수하며 항진균 활성도 높았다. 갈색마름병과 동전마름병에 대해 전반적인 항진균 활성의 경우, 상대적으로 낮은 온도의 지역에서 생존하는 YUD-F군(P. mandelii와 P. fluorescens)의 Pseudomonas spp.가 YUD-O군(P. trivialis와 P. jessenii)의 Pseudomonas spp. 보다 항진균 활성이 보편적으로 넓게 작용하고 있음을 알 수 있다. 이는 지역별 평균 기온차가 각각의 Pseudomonas spp.의 최적 생육온도와 항진균 활성에 영향을 주고 있는 것으로 보여 진다. YUD-O군의 Pseudomonas spp.는 동전마름병에 대해 우수한 항진균성을 보이지만, 갈색마름병에 대해선 상대적으로 약한 항진균 활성을 보여주고 있다.
골프 코스 잔디 뿌리부근의 토양으로부터 분리된 4종 Pseudomonas spp.의 배양조건과 잔디에 갈색마름병의 원인이 되는 R. solani와 동전마름병의 원인이 되는 S. homoeocarpa에 대한 항진균 활성을 조사하였다. 배양조건으로는 pH 7.0으로 $20-25^{\circ}C$에서 배양할 때 생육도 우수하며 양호한 항진균 활성을 나타내었다. 대량배양을 위한 기본배지로 King's B 배지를 사용하였으며 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 tryptone을, 무기염류로는 $K_2HPO_4$를 첨가하였을 때 균의 생육이 가장 우수하며 항진균 활성도 높았다. 갈색마름병과 동전마름병에 대해 전반적인 항진균 활성의 경우, 상대적으로 낮은 온도의 지역에서 생존하는 YUD-F군(P. mandelii와 P. fluorescens)의 Pseudomonas spp.가 YUD-O군(P. trivialis와 P. jessenii)의 Pseudomonas spp. 보다 항진균 활성이 보편적으로 넓게 작용하고 있음을 알 수 있다. 이는 지역별 평균 기온차가 각각의 Pseudomonas spp.의 최적 생육온도와 항진균 활성에 영향을 주고 있는 것으로 보여 진다. YUD-O군의 Pseudomonas spp.는 동전마름병에 대해 우수한 항진균성을 보이지만, 갈색마름병에 대해선 상대적으로 약한 항진균 활성을 보여주고 있다.
To define the optimum conditions for the mass production of four antifungal Pseudomonas spp. isolated from soil, we have investigated culture conditions and effects of various nutrient sources on the bacterial growth and evaluated antagonistic activity against Rhizoctonia solani and Sclerotinia homo...
To define the optimum conditions for the mass production of four antifungal Pseudomonas spp. isolated from soil, we have investigated culture conditions and effects of various nutrient sources on the bacterial growth and evaluated antagonistic activity against Rhizoctonia solani and Sclerotinia homoeocarpa, plant pathogens. The optimum temperature and pH for the growth of these isolates were determined as pH 7.0 and $20^{\circ}$ or $25^{\circ}C$, respectively. Sucrose, tryptone, and $K_2HPO_4$ generally were more adequate for better growth as carbon, nitrogen and mineral source, respectively. The nutrient sources were also found to be very effective for high antifungal activities against R. solani and S. homoeocarpa. It was elucidated that YUD-F group (P. mandelii and P. fluorescens), which inhabit regions at relatively low temperature, had more broad spectrum and higher antifungal activity than YUD-O group (P. trivialis and P. jessenii) generally against R. solani and S. homoeocarpa. It is thought that the differences of the average temperature in the various habitats of Pseudomonas spp. influence the optimal growth temperature and antifungal activity. Especially, Pseudomonas spp. of YUD-O group showed the better antifungal activity against dollar spot caused by S. homoeocarpa, but showed relatively weaker antifungal activity against brown patch caused by R. solani.
To define the optimum conditions for the mass production of four antifungal Pseudomonas spp. isolated from soil, we have investigated culture conditions and effects of various nutrient sources on the bacterial growth and evaluated antagonistic activity against Rhizoctonia solani and Sclerotinia homoeocarpa, plant pathogens. The optimum temperature and pH for the growth of these isolates were determined as pH 7.0 and $20^{\circ}$ or $25^{\circ}C$, respectively. Sucrose, tryptone, and $K_2HPO_4$ generally were more adequate for better growth as carbon, nitrogen and mineral source, respectively. The nutrient sources were also found to be very effective for high antifungal activities against R. solani and S. homoeocarpa. It was elucidated that YUD-F group (P. mandelii and P. fluorescens), which inhabit regions at relatively low temperature, had more broad spectrum and higher antifungal activity than YUD-O group (P. trivialis and P. jessenii) generally against R. solani and S. homoeocarpa. It is thought that the differences of the average temperature in the various habitats of Pseudomonas spp. influence the optimal growth temperature and antifungal activity. Especially, Pseudomonas spp. of YUD-O group showed the better antifungal activity against dollar spot caused by S. homoeocarpa, but showed relatively weaker antifungal activity against brown patch caused by R. solani.
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제안 방법
1). 25℃에서 7일간 배양한 후 길항균과 병원균 균총간의 거리를 측정하였다.
각 길항균의 생장과 활성에 미치는 초기 pH의 영향은 King's B 액체배지를 pH 5.0-9.0로 각각 조정하여 동일한 방법으로 배양하였다.
균체의 생육은 Park 등(2005)의 방법에 따라 실시하였다. 각각의 배지조성과 조건에서 배양된 길항균 현탁액은 UV-Vis Spectrophotometer (Cary-50, VARIAN Inc., USA)를 사용하여 600 nm에서 OD값으로 측정하였다. 식물병원균인 R.
현탁액을 발육저지대 측정법(pairing plate culture)을 이용하여 측정하였다. 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 식물병원균과 길항균의 생육저지거리를 측정하기 위하여 각 조건에서 18시간 배양한 길항균 배양액을 plate 중앙에 획선 접종하고 두 종류의 식물병원균을 5 mm 크기의 culture disc를 만들어 중앙에서 일정 거리를 두고 맞은편에 접종하였다(Fig. 1). 25℃에서 7일간 배양한 후 길항균과 병원균 균총간의 거리를 측정하였다.
를 King's B 액체 배지에 접종한 후 18시간 배양한 일정 농도(OD값 1.0)의 길항균 배양액을 조제된 액체 배지에 첨가(접종량의 10% v/v)하여 15, 20, 25, 30 및 35℃에서 18시간 진탕 배양하였다.
0으로 조정하여 전배양액을 접종하고 25℃에서 18시간 진탕 배양하였다. 모든 실험구들은 배양이 끝난 후, 즉시 균체의 생육 및 항진균 활성을 측정하였다.
도출된 온도 실험 결과와 초기 pH는 탄소원 선정 실험에 반영하였으며, 결정된 탄소원 역시 질소원 선정 실험의 탄소원으로 사용되었다. 무기염 실험 역시 이전 실험 결과를 단계적으로 적용하는 동일한 방법으로 수행하였으며, 각각의 실험 요인(온도, 초기 pH, 탄소원, 질소원, 무기염)마다 길항균 생육과 길항력을 측정하여, 각각의 변수가 두 종의 병원균에 대한 항균 활성에 미치는 영향을 분석, 평가하였다. 최적 온도 조건을 알아보기 위해 4종의 Pseudomonas spp.
무기염류로는 0.15% 농도의 KCl, K2HPO4, NaCl, Na2HPO4, 및 Na2SO4를 King's B 배지의 무기염 대신에 넣어 준 후 배양액 초기 pH를 7.0으로 조정하여 전배양액을 접종하고 25℃에서 18시간 진탕 배양하였다.
5 g/L)(14)를 사용하였다. 실험과정은 이전 실험결과를 다음 실험결과에 반영하며, 단계별로 적용해 나가는 방법을 사용하였다. 먼저, 4종의 Pseudomonas spp.
먼저, 4종의 Pseudomonas spp.에 대한 각각의 최적온도를 선발하였고, 결정된 온도조건을 바탕으로 초기 pH 실험을 수행하였다. 도출된 온도 실험 결과와 초기 pH는 탄소원 선정 실험에 반영하였으며, 결정된 탄소원 역시 질소원 선정 실험의 탄소원으로 사용되었다.
골프 코스 잔디 뿌리부근의 토양으로부터 분리된 4종 Pseudomonas spp.의 배양조건과 잔디에 갈색마름병의 원인이 되는 R. solani와 동전마름병의 원인이 되는 S. homoeocarpa에 대한 항진균 활성을 조사하였다. 배양조건으로는 pH 7.
의 생육 및 항진균 활성을 검토하기 위하여 King's B 배지의 질소원으로 2% 농도의 peptone과 peptone 대신 동일 농도의 beef extract, malt extract, tryptone 및 yeast extract를 첨가하여 배양한 결과는 Fig. 5와 같았다.
solani에 대해 항진균 활성이 있는 4종의 Pseudomonas spp.의 최적 배양 조건을 조사 검토하였다. 선발된 조건은 향후 대량배양에 적용하여 생물학적 방제제 개발에 활용할 예정이다.
대상 데이터
fluorescens)는 골프 코스의 잔디 근권토양에서 수집한 균주로 다양한 식물병원균에 대한 길항력이 보고된 바 있다(4, 5). 공시균주로 갈색마름병균인 R. solani AG-1(1B) (KACC-40108)는 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받아 사용하였으며, 동전마름병균인 S.homoeocarpa는 2008년 전북 무주 소재 무주골프장에서 분리하였다.
기본 배지로 King's B 액체 배지(glycerol 10 g/L, peptone 20 g/L, K2HPO4 1.5 g/L, and MgSO4 1.5 g/L)(14)를 사용하였다.
4종의 Pseudomonas spp.에 필요한 최적 배양조건을 알아보기 위해 배양온도, 초기 pH, 질소원과 탄소원의 종류 및 무기염(minerals)이 사용되었다. 기본 배지로 King's B 액체 배지(glycerol 10 g/L, peptone 20 g/L, K2HPO4 1.
영양원에 따른 균체 생육 및 항진균 활성 비교 본 연구에서 사용된 영양원은 시중에서 구입이 비교적 용이하고 동일 균을 대상으로 사용이 빈번한 것들을 대상으로 선정하였다. 특히, 생육과 항진균 활성이 유사할 경우 대량배양시 생산비 절감을 고려하여 영양원들을 선발하였다.
영양원에 따른 균체 생육 및 항진균 활성 비교 본 연구에서 사용된 영양원은 시중에서 구입이 비교적 용이하고 동일 균을 대상으로 사용이 빈번한 것들을 대상으로 선정하였다. 특히, 생육과 항진균 활성이 유사할 경우 대량배양시 생산비 절감을 고려하여 영양원들을 선발하였다. 탄소원은 미생물 생장에 필요한 에너지원으로 미생물의 생리적 특이성과 차이로 인해 선호하는 탄소원의 종류가 서로 다룰 수 있다(15).
데이터처리
모든 데이터에 대해서는 분산 분석이 수행되었는데, 평균값들의 유의차 검정에는 PROC ANOVA 프로그램(SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 최소유의차 검정법이 사용되었다. 집단화 데이터의 통계 분석은 유의수준 5%에서 분산분석을 하였다.
, USA)을 이용하여 최소유의차 검정법이 사용되었다. 집단화 데이터의 통계 분석은 유의수준 5%에서 분산분석을 하였다.
이론/모형
균체의 생육은 Park 등(2005)의 방법에 따라 실시하였다. 각각의 배지조성과 조건에서 배양된 길항균 현탁액은 UV-Vis Spectrophotometer (Cary-50, VARIAN Inc.
homoeocarpa에 대한 항진균 활성은 4종의 Pseudomonas spp. 현탁액을 발육저지대 측정법(pairing plate culture)을 이용하여 측정하였다. 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 식물병원균과 길항균의 생육저지거리를 측정하기 위하여 각 조건에서 18시간 배양한 길항균 배양액을 plate 중앙에 획선 접종하고 두 종류의 식물병원균을 5 mm 크기의 culture disc를 만들어 중앙에서 일정 거리를 두고 맞은편에 접종하였다(Fig.
성능/효과
하지만 온도별 길항균의 항진균 활성은 흥미로운 결과를 나타냈다. YUD-O군(P. trivialis와 P. jessenii)은 25℃ 이상의 생육조건에서 동전마름병균인 S. homoeocarpa에 대한 항진균성이 높았으며, YUD-F군(P. mandelii와 P. fluorescens)은 25℃ 이하의 생육조건에서 R. solani에 대한 항진균성을 높게 나타냈다. 이러한 사실은 각 균의 특성에 따른 원인으로 판단된다.
solani에 대한 활성을 제외하고는 모든 배양액에서 생육과 항진균 활성이 가장 양호한 것으로 나타났다. malt extract의 경우에 OD값이 가장 낮아 균의 생육이 가장 미비한 것으로 조사되었으나 항진균 활성은 낮은 생육에도 불구하고 아주 양호한 것으로 나타났다.
5와 같았다. tryptone을 첨가했을 때 P. trivialis YDU-O-5G-1-3과 P. fluorescens YDU-F-6F-1의 R. solani에 대한 활성을 제외하고는 모든 배양액에서 생육과 항진균 활성이 가장 양호한 것으로 나타났다. malt extract의 경우에 OD값이 가장 낮아 균의 생육이 가장 미비한 것으로 조사되었으나 항진균 활성은 낮은 생육에도 불구하고 아주 양호한 것으로 나타났다.
4와 같다. 균체의 생육과 항진균 활성은 종류를 달리한 탄소원을 넣은 모든 배양액에서 비교적 양호하게 나타났으며, sucrose를 사용했을 때 균체의 생육이 가장 높게 나타났고 starch를 사용했을 때 균체의 생육이 가장 저조하였다. 항진균 활성은 균체의 생육정도와 일관성을 보이지는 않았으며 대체적으로 고른 항진균 활성을 보였다.
대량배양을 위한 기본배지로 King's B 배지를 사용하였으며 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 tryptone을, 무기염류로는 K2HPO4를 첨가하였을 때 균의 생육이 가장 우수하며 항진균 활성도 높았다.
6과 같다. 모든 균에서 생육은 K2HPO4가 가장 양호하였으며 항진균 활성은 대부분의 무기염에서 고르게 나타났다. 이상의 결과를 토대로 저자들은 현재 동일한 배지조성을 이용하여 대량배양액을 제제화하여 생물학적 방제제 개발을 위한 온실 실험 및 포장 실험 등을 진행중에 있다.
3과 같다. 배양된 길항균들은 전체적으로 초기 pH에 관계없이 고르게 잘 자란 것으로 나타났으나 다소 중성인 pH 7.0에서 높은 경향이었다. 이러한 결과는 Cha 등(2002)의 Pseudomonas 속 균주가 중성에서 잘 자란다는 보고와 일치하였다.
homoeocarpa에 대한 항진균 활성을 조사하였다. 배양조건으로는 pH 7.0으로 20-25℃에서 배양할 때 생육도 우수하며 양호한 항진균 활성을 나타내었다. 대량배양을 위한 기본배지로 King's B 배지를 사용하였으며 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 tryptone을, 무기염류로는 K2HPO4를 첨가하였을 때 균의 생육이 가장 우수하며 항진균 활성도 높았다.
균체의 생육과 항진균 활성은 종류를 달리한 탄소원을 넣은 모든 배양액에서 비교적 양호하게 나타났으며, sucrose를 사용했을 때 균체의 생육이 가장 높게 나타났고 starch를 사용했을 때 균체의 생육이 가장 저조하였다. 항진균 활성은 균체의 생육정도와 일관성을 보이지는 않았으며 대체적으로 고른 항진균 활성을 보였다.
후속연구
본 연구에서 분리, 동정되어 사용된 4가지의 Pseudomonas 균주는 일반적으로 샘물, 광천수, 토양, 풀잎 등에서 흔히 분리되는 자연생태계 서식 미생물이고, 인축에 병원성이 없는 것으로 추정되지만 생균을 골프 코스 등에 생물학적 방제제로 사용할 경우 인체 직접 노출, 접촉으로 나타날 기회 감염성의 위해성에 대해서는 별도의 확인 실험이 필요할 것으로 판단된다.
의 최적 배양 조건을 조사 검토하였다. 선발된 조건은 향후 대량배양에 적용하여 생물학적 방제제 개발에 활용할 예정이다.
길항균의 생육정도는 15℃에서 35℃까지 고르게 나타났다. 이렇게 넓은 범위의 온도 적응성을 보이는 것은 향후 포장에서 사용될 경우 유리한 특성으로 작용될 것으로 판단된다. 하지만 온도별 길항균의 항진균 활성은 흥미로운 결과를 나타냈다.
모든 균에서 생육은 K2HPO4가 가장 양호하였으며 항진균 활성은 대부분의 무기염에서 고르게 나타났다. 이상의 결과를 토대로 저자들은 현재 동일한 배지조성을 이용하여 대량배양액을 제제화하여 생물학적 방제제 개발을 위한 온실 실험 및 포장 실험 등을 진행중에 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생물학적 방제의 재료로서, Pseudomonas spp.의 장점은 무엇인가?
는 많은 장점을 가지고 있다(6, 15, 17, 19). 예를 들면, (i) 실험실에서 생장이 빠르고 대량생산 가능, (ii) 빠른 대사 속도로 종자와 뿌리 분비물을 이용, (iii) 근권과 종자 표면 그리고 식물내부에 정착과 증식이 용이, (iv) 항생제, siderophores, 휘발성 물질 및 성장 촉진 물질과 같이 식물병원균에 활성을 보이는 넓은 대사산물 생성 (v) 다른 미생물들과의 경쟁력 우수, 그리고 (vi) 환경 스트레스에 대한 우수한 적응력 등이 있다.
식물병원균을 대상으로 한 생물학적 방제제의 사용이, 세계적으로 증가 추세인 이유는?
지속 가능한 친환경농업에 대한 관심이 집중되면서 화학농약의 대안으로 식물병원균에 대한 길항미생물의 생물학적 방제에 의한 연구가 활발하게 진행되고 있다(12, 19). 식물병원균을 대상으로 한 생물학적 방제제는 친환경적이고 살균제 내성 발생 등의 문제가 없어 세계적으로 그 사용이 증가 되고 있는 추세이다(3, 10, 13).
Pseudomonas spp.는 무엇인가?
그람 음성 토양 박테리아인 Pseudomonas spp.는 생물학적 방제제와 작물비료로 널리 사용되고 있는 균 중의 하나이다(9, 21, 22, 23). 생물학적 방제의 재료로서 Pseudomonas spp.
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