[논문]Development of Species-Specific PCR Primers for the Detection of Streptococcus sobrinus

Kim, Sang-Gon; Yoo, So-Young; Kook, Joong-Ki

Development of Species-Specific PCR Primers for the Detection of Streptococcus sobrinus 원문보기

International journal of oral biology : official journal of the Korean Academy of Oral Biology and the UCLA Dental Research Institute, v.35 no.1, 2010년, pp.21 - 25

Kim, Sang-Gon (Department of Human Biology, School of Dentistry, Chosun University) , Yoo, So-Young (Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University) , Kook, Joong-Ki (Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University)

Abstract ▼ AI-Helper

This study was undertaken to develop species-specific forward and universal reverse PCR primers for the detection of Streptococcus sobrinus. These primers target the variable regions of the 16S ribosomal RNA coding gene (rDNA) and their specificity was tested against 10 strains of S. sobrinus strains and 20 different species of oral bacteria using serial dilutions of the purified genomic DNA of S. sobrinus ATCC $33478^T$. Our data show that species-specific amplicons were obtained from all the S. sobrinus strains tested but not from other species. Both direct and nested PCR could detect as little as 400 pg and 4 fg of genomic DNA from S. sobrinus ATCC $33478^T$, respectively. This result suggests that these PCR primers are highly specific and sensitive and applicable to the detection of S. sobrinus.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

sobrinus도 이와 비슷하다면 5마리까지 검출이 가능하다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 Sato 등(2003a, 2003b)의 것보다 민감도가 뛰어난 프라이머쌍을 개발하고자 시행하였다.

제안 방법

F. nucleatum 균주는 Schaedler broth(Difco Diagnostics)에, A. actinomycetemcomitans 균주는 Trypticase Soy Broth(TSB, Difco Diagnostics)에 0.6% yeast extract, (Difco Diagnostics) 5% horse serum (Difco Diagnostics), 0.2 units(2.8 µg)/ml bacitracin(Sigma, St. Louis, MO., USA) 및 5 µg/ml vancomycin(Sigma)이 첨가된 배지에 접종하여 85% N2, 10% CO2, 5% H2가 공급되는37℃ 혐기성세균배양기에서 1-2일간 배양하여 다음 실험에 사용 하였다.
PCR은 AccuPower® PCR PreMix(Bioneer Corp.)를 이용하여 시행하였다.
PCR은 전술한 바와 같이 AccuPower® PCR PreMix 와 PTC-200 DNA engineTM을 이용하여 시행하였다.
Ss-F2/Ss-R2 프라이머만의 S. sobrinus 표준균주(ATCC 33478^T)의 지놈 DNA에 대한 민감도와 27F와 1492R (Lane, 1991) 프라이머로 S. sobrinus 표준균주(ATCC 33478^T)의 16S rDNA를 증폭한 PCR한 반응물을 10배 희석한 것을 주형으로 Ss-F2/Ss-R2 프라이머의 민감도를 측정하였다. 이때 S.
The detection limits of nested PCR using Ss-F2/Ss-R2 primers. The 16S rDNA was amplified by 27F/1492R primers from purified genomic DNA of S. sobrinus ATCC 33478T (A) and the nested PCR was performed with Ss-F2/Ss-R2 primers and 16S rDNA amplicon (B). The PCR reactions were electrophoresed in 1.
세균 배양액 1.5 ml를 10,000×g의 원심력을 이용하여 수확하고, 이를 인트론사(iNtRON Co., Seoul, Korea)의 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 지놈 DNA를 추출하였다.
앞에서 설계된 S. sobrinus 검출 및 동정을 위한 프라이머의 종-특이성을 알아보기 위하여, S. sobrinus 표준균주(ATCC 33478^T) 및 한국인에서 분리 동정된 9균주를 포함하여 이와 유전학적으로 가장 가까운 4종의 뮤탄스 연쇄상구균의 표준균주들과 3종의 구강 내 연쇄상구균의 표준균주 및 2종의 혐기성 세균의 표준균주 지놈 DNA을주형으로 하여 PCR을 시행하였다. PCR은 AccuPower^® PCR PreMix(Bioneer Corp.
여기에 4 µg의 세균 지놈 DNA와 20 pmoles의 Ss-F2 및 Ss-R2 프리이머를 넣고 PCR을 시행하였다.
여기에 500 µl 의 washing buffer B를 넣고 다시 1분간 원심분리하고, G-spinTM column을 새로운 eppendorf tube에 넣고 100 µl 의 elution buffer를 넣고 1분간 실온에 방치한 다음 10,000×g에서 1 분간 원심분리하여 세균 지놈 DNA를 추출하였다.
)을 이용하여 프라이머 한 쌍 (Ss-F2, 5'-CAT TGG TAA CAC CGG ACT TGC-3' 및 Ss-R2, 5'-CGC CTG CGC TCC CTT TAC-3')을 설계 하였다. 이 때 설계된 프라이머는 미국 미시간 주립대학에서 제공하는 Probe Match 프로그램(http://rdp8.cme.msu. edu/html/analyses.html)을 이용하여 종-특이성을 분석하였고, Bioneer사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 프라이머를 제작하였다. 예상되는 PCR 증폭물의 크기는 550 bp이다.
이를 MegAlign 컴퓨터 프로그램(Lasergene, DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 상동성을 분석하였고, S. sobrinus 16S rDNA 핵산염기서열을 바탕으로 하고, PrimerSelect 프로그램(DNASTAR Inc.)을 이용하여 프라이머 한 쌍 (Ss-F2, 5'-CAT TGG TAA CAC CGG ACT TGC-3' 및 Ss-R2, 5'-CGC CTG CGC TCC CTT TAC-3')을 설계 하였다.
0])를 이용해서 100 V에서 30분간 전기영동하였다. 증폭물은 ethidium bromide로 염색하여 UV transillumination로 발색시켜 크기를 확인하였다.
이 때 PCR 조건은 다음과 같았다. 초기 변성은 94℃에서 5분간 시행 하였고, 변성(94℃, 30초), 결합(58℃, 30초) 및 중합(72℃,30초)의 세 과정을 32회 반복하고, 추가적인 중합(72℃,30초)을 10분간 시행하였다.

대상 데이터

본 연구에 S. mutans ATCC 25175^T, S. mutans KCOM 1053, S. mutans KCOM 2759, S. mutans KCOM 1076, S. mutans KCOM 1055, S. mutans KCOM 1089, S. mutans KCOM 1082, S. mutans KCOM 1085, S. mutans KCOM 1086, S. mutans KCOM 1087, S. mutans KCOM 1089, S. sobrinus ATCC 33478^T, S. sobrinus KCOM 1061, S. sobrinus KCOM 1148, S. sobrinus KCOM 1149, S. sobrinus KCOM 1150, S. sobrinus KCOM 1151, S. sobrinus KCOM 1152, S. sobrinus KCOM 1153, S. sobrinus KCOM 1154, S. sobrinus KCOM 1155, S. downei KCTC 3634^T, S. rattus KCTC 3655^T, S. cricetus KCTC 3640^T, S. anginosus ATCC 33397^T, Streptococcus thermophins KCTC 3658^T, Streptococcus mitis KCTC 3556^T, Staphylococcus aureus KCTC 1621^T, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586^T 및 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 33384^T 등의 세균을 이용하였다. 이들 균주들은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA), Korean Collection for Type Cultures(KTCC, Daejeon, Korea) 또는 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, School of Dentistry, Chosun University, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
anginosus ATCC 33397^T, Streptococcus thermophins KCTC 3658^T, Streptococcus mitis KCTC 3556^T, Staphylococcus aureus KCTC 1621^T, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586^T 및 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 33384^T 등의 세균을 이용하였다. 이들 균주들은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA), Korean Collection for Type Cultures(KTCC, Daejeon, Korea) 또는 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, School of Dentistry, Chosun University, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 이들 세균들 중 연쇄상구균들과 포도상구균은 Todd Hewitt broth(TH broth, Difco Diagnostics, Detroit, MI, USA) 또는 TH broth에 1.

성능/효과

GenBank의 데이터 베이스에서 기존에 이미 알려진 S. sobrinus, S. mutans, S. downei, S. rattus 및 S. cricetus 의 16S rDNA 핵산염기서열을 얻었다. 이를 MegAlign 컴퓨터 프로그램(Lasergene, DNASTAR Inc.
Ss-F2/Ss-R2 프라이머로 S. sobrinus의 표준균주 및 임상 분리균주들과 더불어 구강 내 존재하는 연쇄상구균, 포도상구균 및 혐기성 그람음성 세균들의 표준균주 지놈 DNA 를 대상으로 PCR을 시행한 결과 S. sobrinus 균주들에서만 예상한 것과 같은 550 bp의 증폭물이 증폭되었다(Fig. 1).
또한 본 연구에서 이용한 nested PCR법은 첫 번째 PCR 에서 모든 세균 종으로부터 16S rDNA를 증폭할 수 있는 프라이머로 증폭한 다음, S. sobrinus 종-특이 프라이머로 두 번째 PCR을 시행했고, 이 증폭물을 10배 희석해서 사용하였기 때문에 S. sobrinus 이외의 구강 내 많은 세균종의 검출에 다시 이용할 수 있어, 한 번의 샘플링으로 치아우식증뿐만 아니라 치주질환 원인균도 검출할수 있는 장점이 있다.
3). 또한, Fig. 1에서 사용된 S. sobrinus이외의 대조군 세균 지놈 DNA를 이용하여 27F와 1492R 프라이머로 일차 PCR을 시행한 후, Ss-F2/Ss-R2 프라이머를 이용하여 nestPCR을 한 결과 아무런 증폭물이 생성되지 않았다(자료는 제시 안함).
모는 세균 종의 16S rDNA 대부분을 증폭할 수 있는 27F와 1492R 프라이머로 일차 PCR을 시행한 후, 그 PCR 산물을 10배 희석하여 Ss-F2/Ss-R2 프라이머로 2번째 PCR(nested PCR)을 시행한 결과 S. sobrinus ATCC 33478T지놈 DNA 4 fg까지 검출 할 수 있었다(Fig. 3). 또한, Fig.
본 연구 결과에 의하면, Ss-F2/Ss-R2 프라이머는 nested PCR에 의해서는 S. sobrinus 표준균주(ATCC 33478^T) 지놈 DNA를 4 fg까지 검출할 수 있을 만큼 민감도가 뛰어나고, S. sobrinus와 유전학적으로 민감도가 가장 가까운 S. downei를 포함한 다른 뮤탄스 연쇄상구균들의 지놈 DNA와 구별할 수 있는 뛰어난 특이도를 가지고 있었다. 이는 최근 Sato 등(2003b)에 의해 개발된 nested PCR 보다 민감도가 2.
본 연구에서 설계된 프라이머 중 Ss-R2는 Probe Match 프로그램으로 S. sobrinus 균주의 16S rDNA 핵산염기서열에서만 존재하는 것으로 조사되었다.
sobrinus JCM 5176 균주 지놈 DNA 10 fg까지 검출할 수 있음을 보고 하였다. 아직 S. sobrinus 균주의 지놈 DNA 핵산염기서열이 밝혀져 있지 않았지만, S. mutans 지놈 DNA가 약2 Mbp인 점(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks. cgi)을 감안해서 볼 때, S. sobrinus도 이와 비슷하다면 5마리까지 검출이 가능하다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 Sato 등(2003a, 2003b)의 것보다 민감도가 뛰어난 프라이머쌍을 개발하고자 시행하였다.
constellatus를 구별하기 위한 프라이머이다(Takao 등, 2004). 즉, S. intermedius와 S. constellatus 두 세균 종은 연쇄상 구균 속 중 anginosus 그룹에 속하고, 그들의 16S rDNA 핵산염기서열이 99% 동일하여, 이로는 두 균종을 구별할 수가 없다. 하지만, S.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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