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문제 정의
- 그렇지만 자연환경에서 탄산칼슘을 형성 할 수 있는 새로운 미생물종의 보고는 매우 미미하다[3, 6, 7]. 따라서 본 연구에서는 독도에서 분리한 포자형성세균중에서 탄산칼슘 을 형성할 수 있는 새로운 균주를 분리하고자 하였으며, 그 분리균주를 이용하여 시멘트-모래 모르타르에서 균열보수 및 압축강도증진 효과를 검증하였다.
- 본 연구는 탄산칼슘형성세균을 이용하여 시멘트-모래 모르타르의 압축강도증진 및 균열보수의 응용에 연구의 목적이 있다. 독도로부터 분리한 7가지의 탄산칼슘형성세균을 16S rDNA 염기서열을 이용하여 동정했다.
제안 방법
- pH가 12정도의 시멘트 환경하에서 분리 세균이 생존할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 pH 범위를 측정하였다. 6N HCl과 10N NaOH를 이용하여 tryptic soy broth의 pH를 조정하였다. 배지는 유리튜브에 5 mL씩 분주하여 고온멸균 하였다.
- pH가 12정도의 시멘트 환경하에서 분리 세균이 생존할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 pH 범위를 측정하였다. 6N HCl과 10N NaOH를 이용하여 tryptic soy broth의 pH를 조정하였다.
- 각각의 pH 범 위에서 배양된 배양액을 96 well tissue culture plate에 200 µL씩 분주하고 ELISA(Sensident scan type 352, Merck, USA)를 이용, 580 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 독도로부터 분리한 7가지의 탄산칼슘형성세균을 16S rDNA 염기서열을 이용하여 동정했다. 고체배지상의 콜로니 주변부에 형성되는 광물결정을 확인했다. Urea-CaCl2 배지에서 형성되는 광물의 모양은 종 특이적인 것을 확인했다.
- 균열보수효과 검증을 위해 urea-CaCl2 배지에 균을 현탁하여 100 µL씩 5번 분주하는 방법을 이용하여 균열부위에 미생물이 잘 부착할 수 있게 하였다.
- 각각의 pH 범 위에서 배양된 배양액을 96 well tissue culture plate에 200 µL씩 분주하고 ELISA(Sensident scan type 352, Merck, USA)를 이용, 580 nm에서 흡광도를 측정하였다. 균을 접종 하지 않은 pH 8~12 범위의 TSB 배지를 대조군으로 사용하였다.
- 본 연구는 탄산칼슘형성세균을 이용하여 시멘트-모래 모르타르의 압축강도증진 및 균열보수의 응용에 연구의 목적이 있다. 독도로부터 분리한 7가지의 탄산칼슘형성세균을 16S rDNA 염기서열을 이용하여 동정했다. 고체배지상의 콜로니 주변부에 형성되는 광물결정을 확인했다.
- 모르타르의 균열보수에 미생물의 탄산칼슘형성 작용을 이용하기 위해 모르타르에 인위적인 균열을 만들고 배양균을 주입하였다. 모르타르의 제작은 시멘트 30 g, 모래 10 g 및 증류수 15 mL를 넣어 지름 4 cm 짜리 petri dish에 두께 0.
- 모르타르의 압축강도 증진효과를 검증하기 위해 모르타르 타설 시에 미생물을 혼입하는 방법을 이용하였다[12]. Fig.
- 미생물을 모르타르 환경에 적용하여 압축강도증진 효과를 검증하기 위해 7종의 탄산칼슘형성세균을 모르타르 제작과정에 혼입하였다. 균주를 TSB 배지 300 mL에 접종하고 30°C에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕배양 하였다.
- 미생물의 탄산칼슘형성작용을 시멘트-모래 모르타르의 균열보수에 이용하고자 인위적인 균열을 만들고 균을 접종하여 관찰하였다. 깊이와 폭이 같은 균열을 만들기 어렵기 때문에 0.
- 동일한 방법으로 3일 동안 반복 실시하였으며, 균이 접종된 시편들은 30°C에서 배양 하였다. 미생물이 분주된 균열부위의 상태는 광학현미경을 이용하여 촬영하였다. 멸균된 1차 증류수를 위와 같은 방법으로 균열부위에 접종하여 대조군으로 사용하였다.
- 건조시키는 동안 너무 큰 폭의 균열이 발생하는 것을 방지하기 위해 증류수를 뿌려 주었다. 미수화된 시멘트 슬러리를 제거하기 위해 건조된 모르타르를 7일간 수중양생시켰다. 균열보수 효과 검증에 사용된 모르타르는 균열 폭이 최소 머리카락 두께인 0.
- 배양된 균주를 pH 8, 9, 10, 11, 12 등의 5 mL TSB에 각각 100 µL씩 접종하여 30°C에서 170 rpm으로 3일간 배양하였다.
- , Anyang, Korea)를 이용하여 사진상에 척도를 삽입하였다. 배지상에서 광물결정상이 확인된 7개 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기배열을 결정하였다.
- 2 mm체를 통과한 강모래 1,308 g 및 균 현탁액 240 mL를 시험체 2 SET(6 EA) 제작에 사용하였다. 시멘트와 모래는 같은 비율로 넣고 멸균증류수만 혼입한 것을 대조군으로 사용하였다. 24시간 후에 형틀에서 모르타르 시편을 떼어내어 수돗물이 들어있는 수조에 모르타르 시편이 완전히 잠기게 하여 28일 동안 수중양생 하였다.
- 양생수는 수중양생 시 모르타르 시험체에서 발생되는 잔존불순물의 제거를 위해 서 7일 간격으로 깨끗한 물로 교체하였다. 압축강도의 측정은 7일과 28일에 각각 3개의 모르타르 시편을 측정하였으며, 압축강도 측정시 모르타르 시험체의 표면은 완전히 건조한 상태에서 강도측정기계(Universal test machine, Shimadzu corporation, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 원심분리 후 침전물을 2 mL urea-CaCl2 배지에 현탁 하여 100 µL씩 5회에 걸쳐 주입하여 균열부위에만 균현 탁액이 스며들도록 하였다[10].
- 인위적 균열을 만들기 위해 타설 직후 온도 60°C의 건조기 안에서 10시간 동안 건조시켰다.
- 고체배지에 균을 획선하여 배양하고 30°C에서 5~10일 동안 배양하면서 결정형성여부를 관찰하였다. 탄산칼슘결정은 광학현미경(Sw 804425, Samwon, Seoul, Korea)을 이용하여 확인하였다. 형성된 탄산칼슘결정의 형태는 광학현미경과 연결된 Zentech digital camera에 의해 촬영되었으며, 결정의 크기를 비교하기 위해 imagespartener software(Saramsoft Co.
- 탄산칼슘형성세균을 분리하기 위해 urea-CaCl2 고체배지에 균을 획선하여 배양하고 30°C에서 5~10일 동안 배양하면서 결정형성여부를 관찰하였다.
- 탄산칼슘결정은 광학현미경(Sw 804425, Samwon, Seoul, Korea)을 이용하여 확인하였다. 형성된 탄산칼슘결정의 형태는 광학현미경과 연결된 Zentech digital camera에 의해 촬영되었으며, 결정의 크기를 비교하기 위해 imagespartener software(Saramsoft Co., Ltd., Anyang, Korea)를 이용하여 사진상에 척도를 삽입하였다. 배지상에서 광물결정상이 확인된 7개 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기배열을 결정하였다.
대상 데이터
- 미수화된 시멘트 슬러리를 제거하기 위해 건조된 모르타르를 7일간 수중양생시켰다. 균열보수 효과 검증에 사용된 모르타르는 균열 폭이 최소 머리카락 두께인 0.1 mm에서 최대 0.55 mm정도가 되는 것을 선택하였다. 균열보수에 사용된 균들은 TSB 10 mL 접종하여 30°C에서 170 rpm으로 진탕 배양한 후, 8,000 rpm 으로 10분간 원심분리하고 멸균증류수를 이용하여 2번 세척하였다.
- 미생물의 탄산칼슘형성작용을 시멘트-모래 모르타르의 균열보수에 이용하고자 인위적인 균열을 만들고 균을 접종하여 관찰하였다. 깊이와 폭이 같은 균열을 만들기 어렵기 때문에 0.1~0.55 mm 정도로 다양한 균열폭을 갖는 모르타르를 선별하였다[10]. 균열보수효과 검증을 위해 urea-CaCl2 배지에 균을 현탁하여 100 µL씩 5번 분주하는 방법을 이용하여 균열부위에 미생물이 잘 부착할 수 있게 하였다.
- 모르타르 시험체의 규격은 50.8 mm×50.8 mm×50.8 mm를 사용하였고, 보통포틀랜트시멘트 436 g, 1.2 mm체를 통과한 강모래 1,308 g 및 균 현탁액 240 mL를 시험체 2 SET(6 EA) 제작에 사용하였다.
- 탄산칼슘을 형성할 수 있는 미생물을 선별하기 위해 ureaCaCl2 배지를 이용하였다. 이 배지에는 칼슘과 탄산성분이 들어 있고, 요소를 첨가하여 미생물 유래의 urease에 의해 요소가 분해 될 경우 암모니아의 방출로 pH가 올라갈 수 있도록 했다[8, 13].
- 4가 되도록 하였다. 탄산칼슘형성세균의 증식 가능 pH 범위와 압축강도증진 실험을 위한 균의 배양에는 TSB(tryptic soy broth, Difco, USA)를 이용하였다.
성능/효과
- Urea-CaCl2 배지에서 형성되는 광물의 모양은 종 특이적인 것을 확인했다. Arthrobacter nicotinovorans KNUC601, Microbacterium resistens KNUC602, Agrobacterium tumefaciens KNUC603, Exiguobacterium acetylicum KNUC604, 및 Bacillus thuringiensis KNUC606균주는 인위적으로 만든 모르타르 균열부위를 메우는 것을 확인했다. Stenotrophomonas maltophilia KNUC605가 혼입된 시멘트-모래 모르타르는 음성대조구에 비해 14.
- 시멘트-모래 모르타르 환경은 pH가 12정도로 고 알칼리 환경이며 균의 증식에 필요한 영양분도 없는 극한적 환경이다[12, 16]. Fig. 1에서 KNUC602와 KNUC603은 pH 8에서 pH 9까지 균이 증식할 수 있음을 확인했으며, KNUC601, 604, 605, 606, 607 등은 pH 10까지 균의 증식을 확인할 수 있었다. 분리된 7종 모두 pH 10 이상에서는 균의 증식을 확인할 수 없었다.
- Fig. 2에서 볼수 있는 것처럼, 균열폭이 0.1~0.3 mm로 비교적 크지 않은 균열부위에 접종된 C(E. acetylicum KNUC604), D(M. resistens KNUC602), E(B. thuringiensis KNUC606), F(A. nicotinovorans KNUC601), G(A. tumefaciens KNUC603)에서 균열이 완전히 메워지는 것을 확인할 수 있었다. 그 중 KNUC602, KNUC601, KNUC603 등은 다른 실험군들에 비해 균열부위를 빈틈없이 메웠다.
- 4). S. maltophilia KNUC605의 경우 다른 처리구에 비해 가장 높은 강도증진 효과를 보였으며, 7일 강도와 28일 강도 에선 대조구에 비해 17.60%와 14.02%의 증가치를 각각 보였다(Fig. 4). 그러한 압축강도의 증가는 미생물에 의해 형 성된 탄산칼슘의 공극충전과 세균 표면 자체가 공극을 메울 수 있는 충전제로써 기능을 할 수 있을 것으로 여겨진다[6].
- Arthrobacter nicotinovorans KNUC601, Microbacterium resistens KNUC602, Agrobacterium tumefaciens KNUC603, Exiguobacterium acetylicum KNUC604, 및 Bacillus thuringiensis KNUC606균주는 인위적으로 만든 모르타르 균열부위를 메우는 것을 확인했다. Stenotrophomonas maltophilia KNUC605가 혼입된 시멘트-모래 모르타르는 음성대조구에 비해 14.7%정도 강도가 증가됐다.
- 고체배지상의 콜로니 주변부에 형성되는 광물결정을 확인했다. Urea-CaCl2 배지에서 형성되는 광물의 모양은 종 특이적인 것을 확인했다. Arthrobacter nicotinovorans KNUC601, Microbacterium resistens KNUC602, Agrobacterium tumefaciens KNUC603, Exiguobacterium acetylicum KNUC604, 및 Bacillus thuringiensis KNUC606균주는 인위적으로 만든 모르타르 균열부위를 메우는 것을 확인했다.
- 결론적으로 본 연구를 위하여 분리한 탄산칼슘형성세균인 A. nicotinovorans KNUC601, M. resistens KNUC602, A. tumefaciens KNUC603, E. acetylicum KNUC604, B. thuringiensis KNUC606등은 시멘트-모래 모르타르의 외부 균열 보수에 이용될 수 있으며, 그 효과는 균열부위의 폭에 의존적임을 관찰할 수 있었다.
- 결론적으로, KNUC601, KNUC604, KNUC605 등의 경우 시멘트-모래 압축강도증진 효과를 가지고 있으며, 특히 S. maltophilia KNUC605의 모르타르 압축강도증진 효과가 가장 높다(Fig. 4). KNUC605의 탄산칼슘형성능력은 모르타르 압축강도증진을 위한 내부충전제로써 사용이 가능할 정도이다.
- 다양한 광물결정의 모양과 크기는 콜로니 형태 및 분비성 외부물질의 분자적 특이성에서 기인 하는 것으로 여겨진다[4, 8, 9, 13]. 균주의 선별과정에서 콜로니의 색깔과 모양의 차이로 미생물을 분리하여 탄산칼슘 형성을 관찰한 결과 7종 모두 다른 속에 속하는 종임을 확인하였다(Table 1). 7종 모두 현재까지 탄산칼슘형성에 관해서는 국제학계에서 보고된 바가 없다.
- 미생물 유래의 세포벽, 아미노산, 단백질 등에 의해 다른 종류의 유기-무기 광물(organic-inorganic crystal)이 형성될 수 있으며, 이러한 광물들이 모르타르의 역학적 성능을 개선할 수 있다는 것이다[1, 7]. 그러한 결과로 미루어 보아 균의 혼입 초기에는 정상적인 탄산칼슘형성작용이 가능할 것이지만 시간이 흐르면서 균의 세포 내에 외부물질들에 의해 새로운 유기-무기광물(organic-inorganic crystal)들이 형성될 것으로 여겨진다. 아마도 그러한 광물들에 의해 모르타르의 역학적 성능이 개선될 수 있을 것으로 예상되었다[1, 2, 5].
- 그 중 KNUC602, KNUC601, KNUC603 등은 다른 실험군들에 비해 균열부위를 빈틈없이 메웠다. 반면에 균열폭이 0.3~0.6 mm로 상대적으로 큰 균열부위에 접종된 A(R. ornithinolytica KNUC607), B(S. maltophilia KNUC605), E(B. thuringiensis KNUC606)에서는 균열보수효과가 낮았다. 또한 0.
- 반면에, R. ornithinolytica KNUC607의 경우 7일과 28일의 압축강도 측정값이 각각 -24.70%와 -24.71%로 대조구에 비해 낮은 강도치를 보이는 것을 확인했다(Fig. 4).
- 본 연구에서는 탄산칼슘형성세균을 이용하여 모르타르균 열 보수 및 압축강도증진에 효과가 있음을 입증하였다. 이것은 국내외에서 최초로 연구된 결과여서 그의미가 적지 않지만, 역할 물질을 찾아내기 위하여 정제된 탄산칼슘결정을 이용한 실험을 통하여 한 단계 더 깊은 연구가 필요하다 하겠다.
- 9 mm로 비교적 크지만 균열내부까지 완 전히 부숴지지 않은 부위에서는 탄산칼슘이 형성되어 균열이 메워진 것을 확인 할 수가 있었다. 이러한 결과로 보아 균열의 수복은 종에 따라 효과가 달라질 수 있으며 균열의 크기와 폭에 따라 그 효과는 의존적인 것으로 사료된다[10]. 배양균을 균열부위에 분주할 때 균열 폭이 클 경우 균이 균열부위에 부착되지 못하고 아래로 흘러내려서 탄산칼슘결정 형성에 필요한 nucleation site가 제공되지 못하는 것으로 알려져 있다[16].
후속연구
- 본 연구에서는 탄산칼슘형성세균을 이용하여 모르타르균 열 보수 및 압축강도증진에 효과가 있음을 입증하였다. 이것은 국내외에서 최초로 연구된 결과여서 그의미가 적지 않지만, 역할 물질을 찾아내기 위하여 정제된 탄산칼슘결정을 이용한 실험을 통하여 한 단계 더 깊은 연구가 필요하다 하겠다. 다행스럽게도, 친환경 건축소재 개발분야에서 미생물을 이용한 연구는 국내외 학계에서도 그 관심이 점차 높아 지고 있다.
- 이러한 미생물 종의 특이성이 광물결정의 특징을 결정하며 모르타르의 균열보수 및 압축강도증진에 종 특이적인 효과를 부여 할 수 있을 것으로 기대한다[1, 6, 11, 16].
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