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문제 정의
- 추출물 및 각 소재를 질량비 1 : 1. : 1 : 1로 조합한 복합소재의 여드름 완화 효과에 대한 화장품 원료로서의 가능성을 추가 실험을 통하여 알아보았다. 보골지, 당 후박, 목향, 구절초 추출물과 복합소재는 50 pg/mL 내의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 본 실험에서는 항균, 항염증 효과를 갖는 위의 네 가지 약용 식물 추출물을 이용해 저항성과 같은 부작용을 보이지 않는 여드름 완화 화장품 소재 개발 방안을 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 여드름 완화 효과를 갖는 소재를 다양한 추출물을 대상으로 검색하고 발굴하였다. 항균 효과를 갖는 5종의 후보 소재 중 P.
제안 방법
- 5가 될 때까지 배양하였다. 1/100 희석한 배양액 100 를 한천 배지에 도포하고 8 mm의 멸균된 종이 디스크를 배지 위에 올린 후 농도별로 희석된 소재를 각각 20 씩 처리하였다. F.
- acnes를 95 ℃, 5분간 가열하고 적정 농도를 PBS로 희석하여 사용하였다. 2일 후 상등액을 얻어 IL-8, TNF- a ELISA kit로 각 사이토카인의 발현 정도를 측정하였다. 억제율은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존능력은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 보골지, 당후박, 목향, 구절초 추출물과 복합소재에 대한 피부 안전성, 즉 피부 반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 인체 첩포 시험을 실시하였다. 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 10명의 피험자를 대상으로 실시하였으며, 연령분포는 22 ~ 35세, 평균 27세였다.
- 보골지, 당후박, 목향, 구절초 추출물과 복합소재의 세포 독성 측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 즉정한 결과, 50 jUg/mL 이하의 농도로 각 소재 처리 시 세포 생존율이 85 % 이상으로 나타났다 (Figure 1).
- USA)로 여과하였다. 여과된 추출물을 회전식 감압 농축기를 이용해 농축한 후 동결 건조기로 진공 건조하여, 메탄올을 완전히 제거한 약 155 g, 65 g, 86 g, 61 g의 주줄물을 얻었다. 복합 소재는 보골지, 당후박, 목향, 구절초 각각을 질량비 1 : 1 : 1 : 1로 조합하여 준비하였다.
- 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 10명의 피험자를 대상으로 실시하였으며, 연령분포는 22 ~ 35세, 평균 27세였다. 우선, 첩포 부위 인 전박을 70 % 에탄올로 세척한 후 시험물질이 적용된 finn chamber를 시험부위에 첩포하였다. 첩포는 48 h 동안 도포하며, 첩포를 제거한 후에는 마커로 시험부위를 표시하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다.
- aureus는 37 ℃ 배양기에서 1일간 배양하였다. 이후, 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
- 우선, 첩포 부위 인 전박을 70 % 에탄올로 세척한 후 시험물질이 적용된 finn chamber를 시험부위에 첩포하였다. 첩포는 48 h 동안 도포하며, 첩포를 제거한 후에는 마커로 시험부위를 표시하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가기준은 The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA) 가이드라인에서 제시한 판정 기준에 따랐으며, 피부반응도의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다.
- 최소 억제 농도(Minimum inhibitory concentration,MIC) 평가를 수행하여 보골지, 당후박 추출물 및 복합소재의 항균 활성을 추가 확인하였다. P.
- 항균 효과를 갖는 소재를 발굴하기 위해 종이 디스크 확산법을 이용한 검색 과정을 진행하였고 5종의 항균 후보 소재를 확인하였다. 이 중, P.
- 항염증 효과를 갖는 소재를 발굴하기 위해 열에 의해 사멸시킨 P. acnes에 의해 활성화된 THP-1 cell로부터 분비되는 IL-8, TNF-a 의 저해율을 측정하는 방법으로 다양한 추출물을 검색하였다. 이 과정을 통해 5종의 후보 소재를 선별할 수 있었고 이 중 IL-8, TNF- a 모두에 대해 비교적 높은 저해율을 보이는 목향과 구절초 추출물을 대상으로 선정하고 추가 실험을 진행하였다(Table 3).
대상 데이터
- ), 당후버NMagnoliae officinalis), 목향Qnula helenium L.), 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum)는 국내 약초시장인 경동시장에서 구입하였다. 3-(4, 5-dime- thythiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazo-lium bromide (MTT) 시약과 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer solutione Sigma (USA)사 제품으로 사용하였고, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin streptomycine Lonza (Switzerland) 제품을 사용하였다.
- latilobum)는 국내 약초시장인 경동시장에서 구입하였다. 3-(4, 5-dime- thythiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazo-lium bromide (MTT) 시약과 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer solutione Sigma (USA)사 제품으로 사용하였고, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin streptomycine Lonza (Switzerland) 제품을 사용하였다. IL-8, TNF- a ELISA kit는 OptEIATM Human IL-8, TNF-a ELISA set (BD, USA)를 사용하였다.
- 분양받아 사용했다. 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 25 mM HEPES가 첨가된 RPMI-1640 배지를 사용하여 배양하였다.
- aureus에 대해 공통적으로 높은 항균 활성을 보이는 보골지, 당후박 소재를 대상 소재로 선정하여 실험을 진행하였다. 또한 항염증 효과를 갖는 6종의 후보 소재 중 IL-8, TNF- a 발현을 공통적으로 저해하는 목향, 구절초 소재를 대상 소재로 선정하여 실험을 진행하였다. 후보 소재 중 길초근 (Valeriana fauriei B.
- 여과된 추출물을 회전식 감압 농축기를 이용해 농축한 후 동결 건조기로 진공 건조하여, 메탄올을 완전히 제거한 약 155 g, 65 g, 86 g, 61 g의 주줄물을 얻었다. 복합 소재는 보골지, 당후박, 목향, 구절초 각각을 질량비 1 : 1 : 1 : 1로 조합하여 준비하였다.
- IL-8, TNF- a ELISA kit는 OptEIATM Human IL-8, TNF-a ELISA set (BD, USA)를 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 회전식 감압 농축기 (EYELA, Japan), 동결 건조기(OPERON, Korea), 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, Japan), 분광 광도계(HP, USA)를 사용하였다.
- 사람 유래 각질세포 HaCaT세포는 ATCC (USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 DMEM 배지는 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin을 혼합하여 사용하였고, 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.
- 사람 유래 모노사이트 THP-1 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용했다. 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 10 % FBS, 25 mM HEPES가 첨가된 RPMI-1640 배지를 사용하여 배양하였다.
- acnes에 의해 활성화된 THP-1 cell로부터 분비되는 IL-8, TNF-a 의 저해율을 측정하는 방법으로 다양한 추출물을 검색하였다. 이 과정을 통해 5종의 후보 소재를 선별할 수 있었고 이 중 IL-8, TNF- a 모두에 대해 비교적 높은 저해율을 보이는 목향과 구절초 추출물을 대상으로 선정하고 추가 실험을 진행하였다(Table 3).
- 소재를 확인하였다. 이 중, P. acnes, S. aureus 균주에 대해 공통적으로 높은 항균 활성을 갖는 보골지, 당 후박 소재를 대상으로 선정하고 추가 실험을 진행하였다 (Table 1).
- 첩포 시험을 실시하였다. 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 10명의 피험자를 대상으로 실시하였으며, 연령분포는 22 ~ 35세, 평균 27세였다. 우선, 첩포 부위 인 전박을 70 % 에탄올로 세척한 후 시험물질이 적용된 finn chamber를 시험부위에 첩포하였다.
- 항균 효과 평가에 사용된 균주인 P. acnes, S. aureus는 한국생명공학연구원 생명자원센 터에서 분양 받아 사용했다 P. acnes는 37 ℃, 혐기성 환경, Difco™ Reinforced Clostridial Medium (BD, USA)에서 배양되었다. 혐기성 환경은 GasPak EZ Anaerobic Container System (BD, USA)을 이용한 혐기성 병에서 조성되었다.
- 추출물을 대상으로 검색하고 발굴하였다. 항균 효과를 갖는 5종의 후보 소재 중 P. acnes, S. aureus에 대해 공통적으로 높은 항균 활성을 보이는 보골지, 당후박 소재를 대상 소재로 선정하여 실험을 진행하였다. 또한 항염증 효과를 갖는 6종의 후보 소재 중 IL-8, TNF- a 발현을 공통적으로 저해하는 목향, 구절초 소재를 대상 소재로 선정하여 실험을 진행하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균 士 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Student's t-test로 하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 세포 실험에 대한 시료의 적정 처리농도를 결정하기 위해3-(4, 5-dimethythiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazo- lium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 실시하였다. 이 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 포마잔으로 변환시키는 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase 능력을 이용한 방법이다.
- 종이 디스크 확산법 (paper-disk diffusion assay) 을 통해 추출물의 항균 활성을 평가하였다. 각 균주를 액체 배양 배지에 접종한 후 분광 광도계를 이용한 흡광도 측정 시 600 nm에서 optical density (O.
- 추출물의 항균 활성을 평가하기 위해 MIC 측정을 수행하였다. 각 균주를 액체 배양 배지에 접종한 후 분광 광도계를 이용한 흡광도 즉정 시 600 nm에서 optical density (O.
- 첩포는 48 h 동안 도포하며, 첩포를 제거한 후에는 마커로 시험부위를 표시하고 30 min, 24 h, 48 h에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가기준은 The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA) 가이드라인에서 제시한 판정 기준에 따랐으며, 피부반응도의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다.
성능/효과
- MTT assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 즉정한 결과, 50 jUg/mL 이하의 농도로 각 소재 처리 시 세포 생존율이 85 % 이상으로 나타났다 (Figure 1).
- 항균 활성을 추가 확인하였다. P. acnes 균주에 대한 보골지, 당후박, 복합소재의 MIC는 각각 0.003, 0.003, 0.001 %로 양성 대조군인 salicylic acid의 0.25 %에 비해 월등한 항균 효과를 나타냈고, S. aureus 균주에 대한 보골지, 당후박, 복합소재의 MIC는 각각 0.006, 0.006, 0, 003 %로 양성 대조군인 methylparaben의 0.25 %에 비해 월등한 항균 효과를 나타냈다(Table 2).
- P. acnes 균주에 대해서 보골지, 당후박 추출물 모두 양성 대조군으로 사용한 10 % salicylic acid 대비 동일 농도에서 약 2.8배, 약 2.5배의 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(Figure 2). 또한 S.
- acnes 에 대한 THP-1 세포의 IL-8, TNF-a 발현을 크게 저해하는 것으로 나타났다(IL-8: 50 ㎍/mL 농도에서 27 %, 38 %, 44 % 저해 / TNF- a : 50 pg/mL 농도에서 90 %, 88 %, 90 % 저해). 따라서 보골지, 당후박 추출물은 여드름 환자의 모낭에서 염증 반응을 일으켜 화농성 여드름으로 악화시키는데 크게 관여하는 것으로 알려진 혐기성 박테리아 P. acnes와 S. aureus의 생육을 억제하고, 목향, 구절초 추출물은 과도한 염증 반응을 억제하여 여드름 완화 효과를 나타낼 것으로 보인다. 또한, 이와 같은 4종 추출물의 복합 소재의 경우 항균, 항염증 실험에서 단일 소재보다 증가된 효능을 나타내었고 이는 조합된 각 소재간의 상승작용에 의한 것으로 판단할 수 있었다.
- 5배의 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(Figure 2). 또한 S. aureus 균주에 대해서도 양성 대조군으로 사용한 10 % methylparaben 대비 동일 농도에서 보골지의 경우 유사한 효능을, 당후박의 경우 약 1.4배의 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(Figure 3). 복합소재의 경우는 P.
- -8의 경우 두 추출물과 복합소재의 처리 농도에 의존적으로 발현이 감소되는 경향을 보였고 50 pg/mL 농도로 처리 시, 각각 27 %, 38 %, 44 %의 저해율을 보였다. 또한 TNF-Q의 경우도 농도 의존적인 감소 경향을 보였고 50 ㎍/mL 농도로 처리 시, 각각 90 %, 88 %, 90 %의 높은 발현 저해율을 보였다(Figure 4).
- aureus의 생육을 억제하고, 목향, 구절초 추출물은 과도한 염증 반응을 억제하여 여드름 완화 효과를 나타낼 것으로 보인다. 또한, 이와 같은 4종 추출물의 복합 소재의 경우 항균, 항염증 실험에서 단일 소재보다 증가된 효능을 나타내었고 이는 조합된 각 소재간의 상승작용에 의한 것으로 판단할 수 있었다.
- )의 경우도 IL-8 저해율 36 %, TNF-a 저해율 59 %의 높은 항염증 활성을 보였지만, 소재 특유의 강한 향취로 인해 화장품 원료로의 개발이 어려울 것으로 판단되어 제외시켰다. 또한, 항균 대상 소재로 선정된 후박의 경우 TNF-a 저해율 56 %를 보이며 비교적 높은 항염증 활성도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 003 %). 또한, 항염증 효능 소재로 선정된목향, 구절초 추출물과 복합소재는 heat-killed P. acnes 에 대한 THP-1 세포의 IL-8, TNF-a 발현을 크게 저해하는 것으로 나타났다(IL-8: 50 ㎍/mL 농도에서 27 %, 38 %, 44 % 저해 / TNF- a : 50 pg/mL 농도에서 90 %, 88 %, 90 % 저해). 따라서 보골지, 당후박 추출물은 여드름 환자의 모낭에서 염증 반응을 일으켜 화농성 여드름으로 악화시키는데 크게 관여하는 것으로 알려진 혐기성 박테리아 P.
- 4배의 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(Figure 3). 복합소재의 경우는 P. acnes 균주에 대해 양성 대조군인 10 % salicylic acid보다 약 3.2배, S. aureus 균주에 대해 양성 대조군인 10 % methylparaben보다 약 1.5배 높은 효능을 보였다 5, 10 %에서의 두 균주에 대한 항균효과가 거의 유사한 것으로 나타나 실질적인 효능은 더 높을 것으로 보인다.
- 피부반응도(Means)는 0으로 대조군과 마찬가지로 무자극으로 판정되었다. 이는 세포독성 결과와 같이 종합해 볼 때, 독성이 거의 존재하지 않는 안정한 소재임을 알 수 있었다.
- 보골지, 당 후박, 목향, 구절초 추출물과 복합소재는 50 pg/mL 내의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 종이 디스크 확산법을 통한 항균실험에서, 보골지, 당후박 추출물과 복합소재는 여드름 원인균으로 알려진 P. acnes, S. aureus 에 대해 양성 대조군 대비 높은 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(E acnes'- 10 % salicylic .acid의 2.8배, 2.5배, 3.2배 효능 / S. aureus: 10 % methylparaben의 유사효능, 1.4배, 1.5배 효능). 최소 억제 농도(MIC) 평가에서도 P.
- 5배 효능). 최소 억제 농도(MIC) 평가에서도 P. acnes, S. aureus에 대해 양성 대조군 대비 월등한 항균효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다CP. acnes에 대한 MIC: 0.
- 피험자 10명에 대하여 실시한 인체 첩포 시험의 검사 결과에 근거하여 48 h 및 72 h 평균 반응도를 비교하였으며, 이를 기준으로 하여 그 결과를 판정한 결과, 보골지, 당후박, 목향, 구절초 추출물 및 복합소재 1 %에 대한 피부반응도(Means)는 0으로 대조군과 마찬가지로 무자극으로 판정되었다. 이는 세포독성 결과와 같이 종합해 볼 때, 독성이 거의 존재하지 않는 안정한 소재임을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과로 미루어 볼 때 보골지, 당후박, 목향, 구절초 추출물 복합 소재는 항균 효과와 항염증 효과를 동시에 나타냄으로서 여드름 완화 효과를 갖는 기능성 원료로의 이용 가치가 있을 것으로 보인다. 향후 이 소재에 대한 추가적인 임상 실험을 진행하여 피부 안정성 검증과 효능 평가를 진행할 예정이다.
- 이용 가치가 있을 것으로 보인다. 향후 이 소재에 대한 추가적인 임상 실험을 진행하여 피부 안정성 검증과 효능 평가를 진행할 예정이다.
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