문헌조사를 바탕으로 천연 염색 시 염료로 사용이 기능할 것으로 판단되어지는 한약재와 천연물 중 72가지를 선발하고 메탄올 추출물을 이용한 1차 조사와 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트 추출물을 이용한 2차 조사 결과 전반적인 천연물에서 열수와 메탄올 추출물에서 상대적으로 유효한 항균성을 나타내는 것으로 확인되었다. 선별한 천연물 중 대황, 산사, 산수유, 소목, 오매, 오미자, 오배자와 황련 추출물에서 20 mm 이상의 생육저지환이 형성되었으나 항세균성에 대한 활성이 높은 것으로 조사되어 항진균성에 대한 연구가 보다 필요한 것으로 판단된다. 천연물 중 가장 우수한 항균성을 나타낸 황련 열수 추출물의 S. aureus ATCC 6538에 대한 MIC 값을 조사한 결과 110 mg/mL로 조사되었다. 또한 공시균주 외 다른 병원성 미생물에 대한 항균성을 조사한 결과 조사한 3종에 대하여도 양호한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 이에 선별된 천연물이 천연염색 뿐 아니라 다른 분야에서도 많이 적용될 수 있을 것으로 판단되었다. 그러나 용매에 따른 회수율과 항균성을 비교할 때 낮은 회수율에서도 높은 항균성을 나타내는 소목과 황련의 경우 회수율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 진행된다면 보다 좋은 결과를 도출할 수 있을 것으로 판단되었다.
문헌조사를 바탕으로 천연 염색 시 염료로 사용이 기능할 것으로 판단되어지는 한약재와 천연물 중 72가지를 선발하고 메탄올 추출물을 이용한 1차 조사와 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트 추출물을 이용한 2차 조사 결과 전반적인 천연물에서 열수와 메탄올 추출물에서 상대적으로 유효한 항균성을 나타내는 것으로 확인되었다. 선별한 천연물 중 대황, 산사, 산수유, 소목, 오매, 오미자, 오배자와 황련 추출물에서 20 mm 이상의 생육저지환이 형성되었으나 항세균성에 대한 활성이 높은 것으로 조사되어 항진균성에 대한 연구가 보다 필요한 것으로 판단된다. 천연물 중 가장 우수한 항균성을 나타낸 황련 열수 추출물의 S. aureus ATCC 6538에 대한 MIC 값을 조사한 결과 110 mg/mL로 조사되었다. 또한 공시균주 외 다른 병원성 미생물에 대한 항균성을 조사한 결과 조사한 3종에 대하여도 양호한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 이에 선별된 천연물이 천연염색 뿐 아니라 다른 분야에서도 많이 적용될 수 있을 것으로 판단되었다. 그러나 용매에 따른 회수율과 항균성을 비교할 때 낮은 회수율에서도 높은 항균성을 나타내는 소목과 황련의 경우 회수율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 진행된다면 보다 좋은 결과를 도출할 수 있을 것으로 판단되었다.
This study was carried out to investigate the usefulness of the natural antimicrobial substances for natural dyeing. Antimicrobial activity of natural substances, extracted by water, ethanol, methanol and ethyl acetate, were shown over 20 mm by Rheum palmatum, Caesalpinia sappan, Prunus mume, Schiza...
This study was carried out to investigate the usefulness of the natural antimicrobial substances for natural dyeing. Antimicrobial activity of natural substances, extracted by water, ethanol, methanol and ethyl acetate, were shown over 20 mm by Rheum palmatum, Caesalpinia sappan, Prunus mume, Schizandra chinensis, Rhus javanica, and Coptis japonica. Especially, water and methanol extract of C. japonica were shown strong antimicrobial activity against all investigated strains. Minimum inhibition concentration of C. japonica water extract was investigated 110 mg/mL for Staphylococcus aureus ATCC 6538. Investigated natural substances were not only shown strong antimicrobial activity for natural dyeing but also might be used other industries.
This study was carried out to investigate the usefulness of the natural antimicrobial substances for natural dyeing. Antimicrobial activity of natural substances, extracted by water, ethanol, methanol and ethyl acetate, were shown over 20 mm by Rheum palmatum, Caesalpinia sappan, Prunus mume, Schizandra chinensis, Rhus javanica, and Coptis japonica. Especially, water and methanol extract of C. japonica were shown strong antimicrobial activity against all investigated strains. Minimum inhibition concentration of C. japonica water extract was investigated 110 mg/mL for Staphylococcus aureus ATCC 6538. Investigated natural substances were not only shown strong antimicrobial activity for natural dyeing but also might be used other industries.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 천연염재로 많이 사용하고 있는 천연물과 본초학에서 천연염료로서의 가능성을 가진 천연물의 항균성을 조사하여 천연물의 적용 분야의 확대를 도모하고 천연염색에서 활용할 수 있는 객관적이고 과학적인 자료를 제공하여 이를 활용한 고부가가치 제품의 개발을 유도하여 소득향상에 기여하고자 한다.
제안 방법
1차 조사된 결과와 천연염료로서 사용되어지는 정도를 고려하여 천연물을 선별하고 추출 용매에 따른 항균성을 조사하였다. 선별된 천연물은 대황, 목과, 산사, 산수유, 소목, 오매, 오미자, 오배자, 황련 및 양파껍질 총 10종으로 용매별로 추출하여 1차 조사와 동일한 방법으로 항균성을 조사한 결과 메탄올, 에탄올과 열수 추출물에서는 전체적으로 양호한 항균성을 나타내었으나 에틸아세테이트 추출물의 경우 대황, 소목, 오매, 오미자, 오배자 및 양파껍질에서만 약한 항균성을 나타내었다(결과미기재).
1차 조사를 위한 메탄올 추출물의 제조는 선발한 천연물에 10배량의 메탄올을 가하고 상온에서 100 ipm, 24시간 교반 시킨 후 여과(Filter paper No. 2, Whatman, Japan)한 후대형회전농죽기(Rotary evaporator, Buchi, Switzerland) 로감압 농축하여 제조하였다. 2차 조사를 위하여 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였으며 열수 추출물은 천연물의 10배량의 1차 정제수를 가하여 2시간 정도 끓인 후 앞서 제조한 메탄올 추출물과 동일한 방법으로 준비하였으며 용매 추출물의 경우에도 메탄올 추출물의 제조와 동일한 방법으로 진행하였으며 추출을 위한 용매는 특급제품을 사용하였다.
1차 조사의 경우 공시균에 대한 항균성을 나타내는 천연물의 신속한 선별을 위하여 메탄올을 이용하여 추출물을 제조하였으며 2차 조사의 경우 선별한 천연물을 대상으로 물, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 이용하여 추출물을 제조한 후 항균성을 조사하였다.
2, Whatman, Japan)한 후대형회전농죽기(Rotary evaporator, Buchi, Switzerland) 로감압 농축하여 제조하였다. 2차 조사를 위하여 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였으며 열수 추출물은 천연물의 10배량의 1차 정제수를 가하여 2시간 정도 끓인 후 앞서 제조한 메탄올 추출물과 동일한 방법으로 준비하였으며 용매 추출물의 경우에도 메탄올 추출물의 제조와 동일한 방법으로 진행하였으며 추출을 위한 용매는 특급제품을 사용하였다.
S. 의 배양을 위하여 10 mL TSB를 사용하였으며 균을 접종한 후 바로 황련 열수 추출물을 농도별로 20 μL를첨가하여 교반시키고 37℃, 200 rpm에서 3일간 배양하면서 생육 도를 조사하였다. 대조구에는 멸균수 20 첨가하였으며 생육 도는 660nm에서 분광광도계 (UV/VIS spectrophotometer, Shimadzu, Japan)로 조사하였다.
진균의 경우 고체 배지에 곰팡이를 증식시킨 후 멸균수를 첨가하여 백금이로 포자를 회수하였다. 곰팡이의 경우 균사체에 의한 증식도 유도됨으로 탈지면을 넣어 멸균한 주사기에 회수한 포자액을 삽입 시켜 최대한 균사체를 제거하였으며 배지 성분 등의 제거와 현탁액은 세균과 동일한 방법으로 진행하였다.
의 배양을 위하여 10 mL TSB를 사용하였으며 균을 접종한 후 바로 황련 열수 추출물을 농도별로 20 μL를첨가하여 교반시키고 37℃, 200 rpm에서 3일간 배양하면서 생육 도를 조사하였다. 대조구에는 멸균수 20 첨가하였으며 생육 도는 660nm에서 분광광도계 (UV/VIS spectrophotometer, Shimadzu, Japan)로 조사하였다. 또한 황련 열수 주줄 물에 의하여 배지의 탁도;가 변함으로 TSB에 황련 열수 추출물만 첨가한 후 동일한 조건에서 배양하고 흡광도 측정 시 대조 구로 사용하였다.
또한 1차 조사를 바탕으로 선별된 천연물의 추출물을 이용하여 공시균주 외 다른 미생물에 대한 항균성도 추가로 조사하였다.
대조구에는 멸균수 20 첨가하였으며 생육 도는 660nm에서 분광광도계 (UV/VIS spectrophotometer, Shimadzu, Japan)로 조사하였다. 또한 황련 열수 주줄 물에 의하여 배지의 탁도;가 변함으로 TSB에 황련 열수 추출물만 첨가한 후 동일한 조건에서 배양하고 흡광도 측정 시 대조 구로 사용하였다.
선발한 천연물 중 항균성을 조사하기 위하여 공시균을 배지 에서 24시간 전배 양하고 혈구계산반(Haemocytometer, Superior, Germany)을 이용하여 세균의 경우 1.5±0.5><107 cells/mL로, 곰팡이의 경우 1.5±0.5xl07 spores/ml로 포자수를 조정한 후 100(1L를 취하여 멸균된 15 mL 배지에 접종하였다.
오미자 열수, 에탄올과 메탄올 추출물은 E. co/z(Fig. 6), S. epidermidis(g. 7) 및 S. aureus(Fig. . 8)에 대하여 우수한 생육저지환을 형성하였다.
제조한 천연물의 용매별 추출물을 이용하여 공시균주 외 병원성 미생물에 대한 항균성을 조사하였다.
천연물 중 용매별 추출물에서 가장 우수한 항균성을 가지는 것으로 조사된 황련 열수 추출물을 이용하여 KS K 0693 공시균주인 S. aureus ATCC 6538을 대상으로 최소저해농도를 조사하였다. 황련 열수 추출물은 앞선 조사와 동일한 방법으로 준비하였으며 예비 실험을 진행하여 최소저해농도구간을 확인한 후 농도를 80~160 mg/mL 범위에서 5 mg 단위로 준비하였다.
천연물의 항균성을 조사하기 위하여 공시균주를 실험 전 배양한 후 원심분리 (13, 000 rpm, 2 min)하여 균주를 회수하였다. 상등액을 제거하고 멸균수를 첨가하여 잔존 배지 성분 및 균주가 생육하면서 세포 외로 분비하는 물질 등의 제거를 위하여 현탁시킨 후 동일한 방법으로 원심분리 하였으며 3번 반복한 후 희석하여 준비하였다.
천연물의 항균성을 조사하기 위하여 메탄올 추출물(g/mL) 을 이용하여 1차 조사를 수행하였으며 이 결과를 바탕으로 양호한 항균성을 나타내는 천연물을 선별하고, 선별한 천연물을 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트로 추출하여 2 차 조사에 사용하였다. 1차와 2차 조사는 추출물을 6 mm paper disc(Advantec, Japan)에 20 [xL 점적한 후 한천 평판 확산법 (Agar Diffusion Method)으로 조사하였으며 공시 균의 생육이 억제되면서 형성되는 생육저지환(Clear zone)의 크기로 항균성의 유무를 확인하였다.
항균성을 나타내는 천연물을 선별하기 위하여 Table 2의 미생물을 공시균으로 하여 조사하였다. 공시균의 배양을 위하여 Staphylococcus aureus ATCC(American Type Culture Collection, USA) 6538은 Trypticase soy agar(1.
항균성의 조사는 선발한 72가지의 천연물 중 항균성을 가지는 천연물을 선별하기 위한 1차 조사와 그 결과를 이용하여 다양한 용매별로 추출하여 항균성을 조사한 2차 조사로 나누어서 수행하였다.
aureus ATCC 6538을 대상으로 최소저해농도를 조사하였다. 황련 열수 추출물은 앞선 조사와 동일한 방법으로 준비하였으며 예비 실험을 진행하여 최소저해농도구간을 확인한 후 농도를 80~160 mg/mL 범위에서 5 mg 단위로 준비하였다.
대상 데이터
공시균으로 하여 조사하였다. 공시균의 배양을 위하여 Staphylococcus aureus ATCC(American Type Culture Collection, USA) 6538은 Trypticase soy agar(1.7% digest of casein, 0.3% digest of soybean meal, 0.5% NaCl, 0.25% K2HPO4, 0.25% glucose, 1.5% agar, Difco, USA)를, Klebsiella pneumoniae ATCC 4352와 S. aureus ATCC 33591 은 Nutrient agar(0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar, Difco, US A) 를, Aspergillus clavatus ATCC 18214는 Czapek's Dox agar(0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSQQH?0.001% FeSQb 3.0% sucrose, 1.5% agar, Difco, USA)를 사용하였다. 공시균 중 세균은 37℃, 곰팡이는 24℃에서 배양하였으며 각각의 배지에 접종하여 배양한 후 4에서 보관하면서 사용하였으며 주에 한 번씩 계대 배양하여 실험 2일전 다시 계대 배양하여 균을 활성화시킨 후사용하였다.
본 연구에 사용한 천연물 중 한약재는 대구시 수성구 상동 소재 대원약업사에서 생약제제로 포장되어 판매하는 제품을 구입하여 사용하였으며, 양파껍질은 영천시 농업기술센터에서 지원받아 사용하였다. 포도껍질은 영천 지역에서 포도를 구입하여 과피와 과육을 분리한 후 분리한 과피를 60℃ 건열기에서 건조시켜 물기를 제거한 후 분쇄하여 사용하였다.
사용한 균주는 대장균으로 항생물질 민감성 조사 공시 균인 Echerichia coli ATCC 25922, 접촉성 피부염을 유발하는 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, 항생 제인 methicillin과 gentamycin 내성을 가져 다약제 내성균으로 분류되는 S. aureus ATCC 33593을 대상으로 조사하였으며 공시 균주와 동일한 방법으로 조사하였다.
포도껍질은 영천 지역에서 포도를 구입하여 과피와 과육을 분리한 후 분리한 과피를 60℃ 건열기에서 건조시켜 물기를 제거한 후 분쇄하여 사용하였다. 천연물 중 한약재의 선발은 본초학을 바탕으로 문헌 조사하여 선발하였으며 색소를 함유하여 천연염색 시 염료로 사용이 가능할 것으로 판단되는 한약재 중 항균성을 나타낼 수 있는 것을 선발하여 사용하였다(Table 1).
지원받아 사용하였다. 포도껍질은 영천 지역에서 포도를 구입하여 과피와 과육을 분리한 후 분리한 과피를 60℃ 건열기에서 건조시켜 물기를 제거한 후 분쇄하여 사용하였다. 천연물 중 한약재의 선발은 본초학을 바탕으로 문헌 조사하여 선발하였으며 색소를 함유하여 천연염색 시 염료로 사용이 가능할 것으로 판단되는 한약재 중 항균성을 나타낼 수 있는 것을 선발하여 사용하였다(Table 1).
성능/효과
K. ae의 경우 우수한 항세균성을 나타내는 주줄 물은 조사되지 않았으나 대황 메탄올 추출물, 소목 에탄올과 메탄올 추출물, 오매 열수와 메탄올 추출물, 오미자 열수, 에탄올과 메탄올 추출물, 오배자 열수와 메탄올 추출물과 황련 열수 추출물에서 항세균성을 가지는 것으로 조사되었다 (Fig. 2).
S. a의 최소저해농도를 조사한 결과 105 mg/mL 농도의 황련 열수 추출물을 첨가한 경우 1.467의 흡광도를 나타내었으나 110 mg/mL 구간에서 균이 완전하게 생육하지 못하는 것으로 조사되어 최소저해농도는 110 mg/mL로 조사되었다(Fig. 5).
aureus ATCC 33591에 대하여 소목이 28 mm 그리고 Asp. cZavafi/s에 대하여 황련이 38 mm로 가장 높은 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다.
7%로 가장 높게 조사되었으며 진균인 Asp. cZavafus가 11.1%%로 가장 낮게 조사되었으며 이는 진균의 세포벽이 외부의 물리화학적 조건에 대한 저항성을 제공함으로 세포벽 이 없는 세균보다 항균성을 나타내는 천연물의 비율이 낮은 것으로 판단되었다.
aureus ATCC 33591에서 우수한 항세균성을 나타내었으며 특히 Asp. clavatus\ 대하여 선발한 천연물 중 가장 높은 항진균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 구강 미생물을 대상으로 장 등[13]이 황련의 성분 중 berberine0] 매우 우수한 항균성을 나타내었다는 보고와 비교할 때 공시균주에 대한 항균성도 동일한 물질에 의한 것으로 추정하였으나 추가 연구에서 성분에 대한 연구를 진행하여 보고 할 계획이다.
진균인 Asp. clavatuse 대한 항진균성은 황련 열수, 에탄올과 메탄올 추출물에서 가장 우수한 것으로 조사되었다(Fig. 4).
공시균에 대하여 가장 유효한 항균성을 나타내었던 황련의 경우 열수 추출물에서 가장 유효한 항균성을 나타내었으며 S. epidermidis(Yig. 7)와 S. aureus(Fig. 8)에 대하여 우수한 항세균성을 나타내었으나 E. c에 대하여는 상대적으로 미비한 항세균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 이 결과는 황련 에틸아세테이트 추출물이 B.
공시균주별로 살펴보면 S. aureus ATCC 6538의 경우 대황과 소목 메탄올 추출물에서, 오배자 열수와 메탄올 추출물, 그리고 황련 열수와 메탄올 추출물에서 우수한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다(Fig. 1).
대황의 경우 S. epidermidise 대하여 열수, 에탄올과 메탄올 추출물에서 유효한 항세균성을 나타내었으며(결과미기재), 소목의 경우 열수, 에탄올과 메탄올 추출물에서 S epidermidis(Fig. 7)와 S. aureus(Fig. 8)에 대하여도 유효한항세균성을 나타내었다.
이러한 결과는 다양한 이유에 기인하겠으나 기본적으로 한약재의 품질 및 회수율에 따른 차이로 인한 것으로 판단되었다. 또한 연구 결과를 검토할 때 천연물의 항균성은 유사하나 추출물을 제조할 때 마다 약간의 차이를 나타내는 것으로 나타내는 것으로 조사되었다.
메탄올 추출물을 paper disc에 점적하고 상온에서 건조시킨 후 미리 제조해 둔 고체 배지에 얹고 공시균의 배양 온도에서 24시간 배양하여 항균성을 조사한 결과 선발한 천연물 중 대황, 오매, 오미자, 오배자와 황련의 메탄올 추출물은 공시균주 4종에 대하여 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 그리고 소목 메탄올 추출물의 경우 항세균성만 나타내는 것으로 조사되었다(결과미기재).
목과의 경우 양호한 항세균성을 나타내었으나 항진균성은 관찰되지 않았으며 산사와 산수유의 경우 항세균성은 목과와 유사하였으나 약간의 항진균성을 나타내는 것으로 조사되었다.
선별된 천연물은 대황, 목과, 산사, 산수유, 소목, 오매, 오미자, 오배자, 황련 및 양파껍질 총 10종으로 용매별로 추출하여 1차 조사와 동일한 방법으로 항균성을 조사한 결과 메탄올, 에탄올과 열수 추출물에서는 전체적으로 양호한 항균성을 나타내었으나 에틸아세테이트 추출물의 경우 대황, 소목, 오매, 오미자, 오배자 및 양파껍질에서만 약한 항균성을 나타내었다(결과미기재).
조사된 항균성과 천연물의 회수율을 비교할 때 소목, 오배자 그리고 황련의 경우 30% 이하의 낮은 회수율에도 불구하고 양호한 항균성을 나타내어 회수율을 높인다면 보다 양호한 항균성을 기대할 수 있을 것으로 판단되었다[결과미기재].
특히, 황련의 경우 K. pneumoniaee 대한 항세균성은 다소 미흡하였으나 선발한 천연물 중에서 가장 양호한 항균성을 나타내었으며 특히 곰팡이에 대한 항진균성은 매우 우수한 것으로 조사되었다.
후속연구
clavatus\ 대하여 선발한 천연물 중 가장 높은 항진균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 구강 미생물을 대상으로 장 등[13]이 황련의 성분 중 berberine0] 매우 우수한 항균성을 나타내었다는 보고와 비교할 때 공시균주에 대한 항균성도 동일한 물질에 의한 것으로 추정하였으나 추가 연구에서 성분에 대한 연구를 진행하여 보고 할 계획이다.
소목과 황련의 경우 오배자와 비교할 때 유사한 수준의 항균성을 나타내었으나 1차 조사와 동일하게 낮은 회수율을 나타내어 회수율을 높이는 방법에 대한 추가 연구가 진행된다면 보다 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다(결과미기재).
최소저해농도는 점차적으로 생육이 감소하는 경향을 나타내는 것이 일반적이나 본 연구에서는 생육의 점차적인 감소가 유발되는 것이 아니라 110 mg/mL 이상의 황련 열수 추출물을 첨가하였을 때 급격하게 100% 저해되는 양상을 나타내어 이 부분에 대한 추론과 추가 연구는 향후 진행 할 예정이다.
aureus ATCC 33591은 대황 메탄올 추출물, 소목 에탄올과 메탄올 추출물, 오매 열수와 메탄올 추출물, 오미자 열수, 에탄올과 메탄올 추출물, 오배자 열수, 에탄올과 메탄올 추출물, 황련 열수와 메탄올 추출물에서 우수한 항균성을 나타내었다. 특히 S. aureus ATCC 33591이 항생제인 methicillin에 대한 내성균임을 감안할 때 이 부분에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
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