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문제 정의
- 본 연구는 소목의 심재로부터 MeOH 추출에 따른 일련의 유기용매 및 H2O 분획에서 인체병원성 세균에 대한 항균 활성 효과를 알아보고, 이에 대한 효과가 우수한 분획을 정제하여 MS 및 NMR을 통하여 항균활성 물질의 본체 규명을 하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 또한 EtOAc 분획의 항균활성은 Gram (-) 균주 보다 Gram (+) 균주에 더 효과적이며, Gram (-) 균주에 대해서는 세균에 따른 항균활성의 차이를 보였다. EtOAc 분획은 silica gel adsorption column chromatography 및 Sephadex LH-20을 이용하여 분리하였으며 수득한 주요 성분은 재결정을 통하여 얻어진 단일물질을 HPLC를 이용하여 순도를 측정하였다. 300g의 C.
- 확인하였다. Silica gel(300 g, 200-400 mesh, Merck)을 CHCI3: MeOH (15: 1, V/V)로 slurry를 만들어 column에 중진 시킨 후, CHCl3-MeOH 용매계의 MeOH 농도를 순차적으로 증가시키는 step-wise 방법으로 용출하였다. 수득한 5개의 분획물 중 3번째 부-분획물은 Hexane : EtOAc(l:2, 1:3)을 이용하여 다시4개의 하위 분획으로 나누었다.
- 이어 Hexane-EtOAc (1:2; 1:3)Q-로. column 사iromatography한 2번째 활성 분획을 Sephadex LH・20를 이용하여 column chromatograph 하여 분자량에 따라 분리하였다. 주요 성분을 HPLC로 확인하여 수득한 후 ethyl ether에서 재결정하여 단일 물질을 분리하였다.
- concentration)로 측정흐]였다. 각 분획물의 최초 농도를 10 mg/mL로 1/2이 되도록 연속하여 17단계까지 희석하여 Muller hinton agar 배지에 혼합하여 각 농도 별 plate 를 만들었다. 긱긱의 균주가 접종된 Brain heart infusion 액체배지에서 3TC에서 18~24시간 동안 배양하여 560 nm에서 O.
- 각 분획물의 최초 농도를 10 mg/mL로 1/2이 되도록 연속하여 17단계까지 희석하여 Muller hinton agar 배지에 혼합하여 각 농도 별 plate 를 만들었다. 긱긱의 균주가 접종된 Brain heart infusion 액체배지에서 3TC에서 18~24시간 동안 배양하여 560 nm에서 O.D.값 0.6으로 흡광도를 조절하여 replicator(Oxoid, USA)를 이용하여 각각의 균주를 배지에 접종한 다음 37℃ 에서 24시간 배양하여 균이 증식흐]지 않은 농도를 육안으로확인하였다. 대조군으로는 gentamicin sulfate(Sigma, USA) 를 실험군과 동일한 방법으로 점적시켰다.
- 6으로 흡광도를 조절하여 replicator(Oxoid, USA)를 이용하여 각각의 균주를 배지에 접종한 다음 37℃ 에서 24시간 배양하여 균이 증식흐]지 않은 농도를 육안으로확인하였다. 대조군으로는 gentamicin sulfate(Sigma, USA) 를 실험군과 동일한 방법으로 점적시켰다.
- 본 결과에서는 조사된 모든 균주에 대하여 EtOAc 분획물에서 가장 높았으며 , 다음으로는 MeOH, H2O 분획물 순으로 항균활성 효과를 보였다. 따라서 EtOAc 분획물에서 항균활성이 집중되어 활성 본체의 순수분리를 우선 시도하였다.
- 분양 받아 사용하였다. 모든 균주에 대한 생육 배지로 Brain heart infusion(Difco, USA) 액체배지를 사용하였고, 항균활성 실험은 Mueller Hinton agar(Difco, USA) 고체배지를 사용하였다.
- 상기의 수율과 항균활성이 가장 높은 EtOAc 분획물에 대하여 silica gel adsorption column 및 high perfbnnance liquid chromatography로 항균활성 물질을 정제 확인하였다. Silica gel(300 g, 200-400 mesh, Merck)을 CHCI3: MeOH (15: 1, V/V)로 slurry를 만들어 column에 중진 시킨 후, CHCl3-MeOH 용매계의 MeOH 농도를 순차적으로 증가시키는 step-wise 방법으로 용출하였다.
- 소목의 EtOAc 분획물에서 최종 정제된 활성물질은 UV 288.3nn에서 최대 흡수피크를 나타내었으며 , NMR spectrum 과 LCMS・IT・TOF MS system을 통해 분석하였다. 그 결과 iH・NMR(400 MHz, CD3OD, 8) spectrum에서는 7.
- 염증 등의 질병치료를 위해 민간의학에서 오래 동안 사용되어 온 한약재이다. 소목의 심재로부터 항균효과를 조사하기 위하여 MeOH 추출에 의한 hexane, CHC1& EtOAc, n-BuOH, MeOH 및 H2O 분획을 얻었다. 분획 시료 중 3.
- Silica gel(300 g, 200-400 mesh, Merck)을 CHCI3: MeOH (15: 1, V/V)로 slurry를 만들어 column에 중진 시킨 후, CHCl3-MeOH 용매계의 MeOH 농도를 순차적으로 증가시키는 step-wise 방법으로 용출하였다. 수득한 5개의 분획물 중 3번째 부-분획물은 Hexane : EtOAc(l:2, 1:3)을 이용하여 다시4개의 하위 분획으로 나누었다. 수득한 하위분획 증 2번째 하위분획을 sephadex LH.
- 20를 이용하여 column chromatography한 후 다시 ethyl ether로 재결정하였다. 재결정된 단일 peak의 활성 fraction을 Ci8 reversed-phase column 에 MeOH-water(l: 4, V/V) 용매계에서 MeOH 농도를 증가 시켜 1 mL/min의 유속으로 240 nm의 UV 검출기가 장착된 HPLC(Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 순도를 측정하였다.
- column 사iromatography한 2번째 활성 분획을 Sephadex LH・20를 이용하여 column chromatograph 하여 분자량에 따라 분리하였다. 주요 성분을 HPLC로 확인하여 수득한 후 ethyl ether에서 재결정하여 단일 물질을 분리하였다. 분리된 단일물질을 HPLC0에 의한 분석결과retention time이 10.
- 농축한 MeOH 추출물과 물, 그리고 "-hexane의 비율이 1:9: 10(v/v)이 되도록 혼합하여 용매가 잘 섞이도록 반복적으로 강하게 흔들어 준 혼합물을 12시간 동안 정체하여 n-hexane 층과 물 층이 분리되도록 하였다. 하층에 형성된 물 층은 다른 분액깔때기에 보관하고, 유기용매 ”-hexane을 동일한 방법으로 첨가하여 3회 반복하여 추출하였다. 분리된 w-hexane 층은 45。(2에서 감압 농축하여 소목의 w-hexane 분획물을 얻었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 소목은 서울 경동시장에서 건조물을 구입하여 선별한 후 실험에 사용하였다.
- 소목의 유기용매 별 분획의 항균활성에 사용한 인체 병원성 균주는 Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter 속의 Gram (+) 세균 6종과 Gram (-) 세균 14종을 한국미생물보존센터 (KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. 모든 균주에 대한 생육 배지로 Brain heart infusion(Difco, USA) 액체배지를 사용하였고, 항균활성 실험은 Mueller Hinton agar(Difco, USA) 고체배지를 사용하였다.
이론/모형
- 정제된 활성물질의 질량분석은 LCMS-IT-TOF mass spectrometer(Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 MS에 직접주입(direct injection)흐}여 대기압 화학 이온화(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) 방식으로 negative mode를 측정하였다. 정확한 구조분석을 위하여 충돌유도해 (collision-induced dissociation, CID) 방식으로" target ion 을 작은 조각으로 깨뜨려 각각의 조각 이온의 패턴 및 구조를 확인하기 위해 MS, MS/MS, MS/MS/MS까지 측정하여 각각을 identification함으로서 구조를 확인하였다.
성능/효과
- 6가지의 소목 분획물의 인체 병원성 세균에 대한 MIC 농도를 측정하여 항균활성 효과를 알아본 결과(Table 2), EtOAc 분획물에서 Gram (-) 균주 보다 Gram (+) 균주 모두에 대하여 특히 높은 활성을 보였으며, Gram (-) 균주에 대해서는 균주에 따른 항균력이 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 이는 Shin 등[34] 이 소목의 ethanol 추출물이 병원성 미생물에 대하여 항균효과가 매우 높으며, S.
- 3nn에서 최대 흡수피크를 나타내었으며 , NMR spectrum 과 LCMS・IT・TOF MS system을 통해 분석하였다. 그 결과 iH・NMR(400 MHz, CD3OD, 8) spectrum에서는 7.06(lH? d, 八8.8 Hz, H-l), 6.61(1H, s, H-8), 6.5O(1H, s, H-ll), 6.36(1H, dd, 八2.4, 8.8 Hz, H・2), 6.2O(1H, d, 丿=2.4 Hz, H-4), 3.86(1H, br. s, H-12), 3.82(1H, dd, J=12, 11.2 Hz, H-6), 3.58(1H, d, 八 11.2 Hz, H-6), 2.92(1H, d, J=15.6Hz, H-7), 2.65(1H, ds 人 15.6 Hz, H-7)로 나타났으며 (Fig. 2), 13C-NMR(100 MHz, CD3OD, 8c) spectrml에서는 157.69 (C-4a), 155.61(C-3), 145.52(C-9)S 145.20(C-10), 137.41(C- 11a), 132.21(C-1), 131.34(C-7a), 115.52(C-la), 112.88(C- 8), 112.42(C-11), 109.96(C-2), 104.24(04), 78.05(C-6a), 70.77(C-6), 50.95(C-12), 42.79(C-7)로 나타났고(Fig. 3), MS 분석결과 Fig. 4와 같이 molecular ion(M+)이 m/z 285. 075로 나타났다.
- 94%의 가장 높은 수율의 EtOAc 분획이 조사된 인체 병원성 세균에 대해 가장 강한 항균 활성을 나타냈다. 또한 EtOAc 분획의 항균활성은 Gram (-) 균주 보다 Gram (+) 균주에 더 효과적이며, Gram (-) 균주에 대해서는 세균에 따른 항균활성의 차이를 보였다. EtOAc 분획은 silica gel adsorption column chromatography 및 Sephadex LH-20을 이용하여 분리하였으며 수득한 주요 성분은 재결정을 통하여 얻어진 단일물질을 HPLC를 이용하여 순도를 측정하였다.
- 7 μg/mL의 농도에서 우수한 항균활성 효과가 있는 것으로 보고하였고, Lee[17|의 연구에서는 EtOAc 분획물이 가장 높은 항균활성을 보고하였다. 본 결과에서는 조사된 모든 균주에 대하여 EtOAc 분획물에서 가장 높았으며 , 다음으로는 MeOH, H2O 분획물 순으로 항균활성 효과를 보였다. 따라서 EtOAc 분획물에서 항균활성이 집중되어 활성 본체의 순수분리를 우선 시도하였다.
- 소목의 심재로부터 항균효과를 조사하기 위하여 MeOH 추출에 의한 hexane, CHC1& EtOAc, n-BuOH, MeOH 및 H2O 분획을 얻었다. 분획 시료 중 3.94%의 가장 높은 수율의 EtOAc 분획이 조사된 인체 병원성 세균에 대해 가장 강한 항균 활성을 나타냈다. 또한 EtOAc 분획의 항균활성은 Gram (-) 균주 보다 Gram (+) 균주에 더 효과적이며, Gram (-) 균주에 대해서는 세균에 따른 항균활성의 차이를 보였다.
- 51g의 MeOH 추출물을 w-hexane, CHC13, EtOAc, m-BuOH, MeOH, 및 열수로 순차 분획한 결과, 각 분획물의 수율은 Table 1과 같이 나타났다. 소목의 w-hexane, CHCI3, EtOAc, w-BuOH, MeOH, 및 열수 분획물은 각각 0.013%, 0.07%, 3.94%, 0.17%, 0.41%, 0.08%로 나타나, CHCb의 수율이 가장 낮았고 EtOAc 분획물의 수율이 3.94%로 가장 높았다.
- 항균활성이 우수하고 수율이 가장 높은 EtOAc 분획물(11.83 g)을 CHCh-MeOH 용매계를 이용한 silica gel adsorption column chromatography로 용출 분획한 결과, 33% MeOH 용출 분획에서 항균활성이 나타났다. 이어 Hexane-EtOAc (1:2; 1:3)Q-로.
후속연구
- 소목의 유기용매 별 분획에서 braziline 주로 EtOAc 분획에 존재하였으며, 인체에 유해한 병원성 Gram (+) 세균에 우수한 항균력이 있어 천연 항균제로서의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 분리된 활성 물질은 엷은 황색 결정의 단일 화합물로 MS에 의해 분자량이 285 로 나타났으며, *H-NMR, "c-NMR에 의한 구조분석으로 brazilin(C16Hi4O5)> 동정하였다. 이 같은 결과는 소목의 MeOH 추출에 의한 EtOAc 분획에 존재하는 brazilin이 S. aureuse\- 같은 인체 병원성 Gram (+) 균주에 대한 생약 치료제로 활용이 가능할 것을 시사한다.
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