[논문]토양에서 분리한 Bacilus flexus로부터 Invertase의 생산

오태석; 윤희; 심예지; 김진우; 최민지; 윤종원

토양에서 분리한 Bacilus flexus로부터 Invertase의 생산
Production of Invertase from Newly Isolated Strain Bacilus flexus 원문보기

KSBB Journal, v.25 no.1, 2010년, pp.79 - 84

오태석 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 윤희 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 심예지 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 김진우 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 최민지 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 윤종원 (대구대학교 공과대학 생명공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

In the present study, we isolated a new bacterial strain producing invertase (EC 3.2.1.26) and determined optimized culture condition in flask culture. The strain was identified as Bacilus flexus determined by the 16S rDNA sequencing method. The invertase was produced only in the sucrose medium as the sole carbon source. Potassium nitrate was an adequate nitrogen source for enzyme production, whereas meat peptone showed the highest bacterial growth. Enzyme production was increased about 2-fold when $MgSO_4\cdot7H_2O$ was supplemented to the growth media. The optimum temperature was found to be $30^{\circ}C$ for both enzyme production and bacterial growth. Invertase exhibited pH optima in the range 5.0-6.0 and have a temperature optimum at $40^{\circ}C$, similarly to other invertases found from different microbial sources. Several mineral ions (K and Fe) stimulated the invertase activity, whereas some bioelements (Ag, Mg, and Mn) inhibited enzyme activity. Under the optimized culture condition, the maximum enzyme production (over 250 units/mL) was achieved at 20 h. To the best of our knowledge, this is the first time to report on invertase production by Bacilus flexus.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

Sucrose 배지에 1%의 종균을 접종하여 30C 에서 진탕배양 (120 rpm)하면서 2시간 간격으로 660 皿에서 배지의 흡광도를 측정하여 미생물의 증식 정도를 확인하였고, 미생물을 제거한 상등액을 조 효소액 (crude enzyme solution)으로 사용하여 효소 활성을 측정하여 효소생산량을 측정하였다. 효소활성은 sucrose가 가수분해되어 생성되는 glucose의 양을 glucose oxidase kit를 사용하여 정량 하였다 휴스: 반응은 sucrose용액 1% (w/v) 1 mL에 조 효소액 1 mL을 첨가한 후 37℃ 에서 30분간 반응시켰다.
반응온도 40℃, pH 5.5의 조건에서, Pb(NO₃)2, AgNO₃j KI, KC₁, MgSO₄, MnCl2, FeSO₄) CuSQ의 등의 여러 가지 금속이온을 긱각 2 mM의 농도가 되게 첨가하여 invertase 활성을 상대 비교하였다.
본 연구에서는 국내 여러 지역의 토양 시료로부터 invertase 생산 미생물을 스크리닝한 결과, invertase를 비교적 고농도로 생산하는 Bacilus flexus 균주를 분리하여 이를 동정하였고, invertase 생산조건을 플라스크 배양을 통해 최적화하였다.
최적 반응온도를 조사하기 위해서 20℃~70℃ 범위에서 효소 활성을 즉정하였으며, 1% (w/v) sucrose 용액 1 mL 및 조효소 용액 1 mL를 30분간 각 온도에서 기질과 함께 반응시킨 후 (pH 7), 끓는 물에서 10분간 처리하여 효소 반응을 중지시켰다 이후 상대적인 효소 활성을 측정하여 최적 온도를 결정하였다. 한편 최적 반응 pH는 위의 조건과 동일하게 pH 3.
온도를 결정하였다. 한편 최적 반응 pH는 위의 조건과 동일하게 pH 3.0~6.0 범위에서는 0.1 M citrate buff初를, pH 6.0-8.0 범위에서는 0.1 M potassium phosphate buffer를 사용하여 상대적인 효소 활성을 측정하여 최적 pH를 결정하였다.
, K* orea) 사용하였다. 효소활성 측정을 위한 흡광도 측정은 분광광도계 (GenesysTM5, Spectronic® instruments, USA)를 사용하였으며, 탄수화물 정량은 HPLC (Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 다음과 같은 조건에서 분석하였다. 컬럼은 Aminex HPX-42C (0.

대상 데이터

경상북도 진량읍 내리리 인근의 유채꽃밭에서 채취한 토양을 멸균수로 희석하고 sucrose 고체 배지 (sucrose 1%, bacto-tryptone 1%, NaCl 1%, p아assium nitrate 0.5%, agar 1.5%, pH 7)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 형성된 colony를 streaking 하여 동일한 조건에서 배양한 후 단일 c이ony를 sucrose 액체배지에 접종하여 37℃ 에서 48시간 진탕 배양(120 rpm)한 다음, invertase 활성이나 타나■는 균주를 16S rDNA sequencing (Korean Culture Center of Microorganisms) 방법으로 동정하였다.

이론/모형

1. Phylogenic tree of the isolated strain determined by the 16S rDNA sequencing method. The isated strain wasidentified as Bacillus flexus.
5%, pH 7)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 형성된 colony를 streaking 하여 동일한 조건에서 배양한 후 단일 c이ony를 sucrose 액체배지에 접종하여 37℃ 에서 48시간 진탕 배양(120 rpm)한 다음, invertase 활성이나 타나■는 균주를 16S rDNA sequencing (Korean Culture Center of Microorganisms) 방법으로 동정하였다.

성능/효과

8에 나타내었다. 2시간 간격으로 미생물 증식과 효소생산량을 측정한 결과, 배양 4~6시간 이후 효소의 생산량이 급격히 증가하였다. 이 결과는 미생물이 초기 탄소원인 sucrose를 가수분해한 혹, 읺ucose 및 fructose 등의 단당류를 이용하여 효소를 생합성 하는 것으로 추측된다.
Invertase 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 batch 반응立로 검토한 결과, pH 5-6에서 최고 활성을 나타내었으며, 그 이외의 pH에서는 급격한 효소의 활성 저해가 나타났다 (Fig. 6). 최적 pH 값을 100%로 하였을 때, pH 4.
이 결과는 Kaur 등 [26] 이 Streptomyces sp. 에서 생산한 invertase가 sucrose를 탄소원으로 사용했을 때 효소생산이 최적이었다는 결과와 일치하지만 질소원으로 yeast extract와 NaNC)3가 최적이었다는 점과는 차이가 있었다. Haq 등 [2기은 Sctcchar이nyces 前加로부터 생산한 invertase의 경우 urea 또는 peptone 과 yeast extract® 혼합한 질소원 배지를 사용하였을 때 효소 생산성이 증대되었다고 보고한 바 있다.
온도에 따른 미생물의 성장과 효소생산을 조사하기 위해 30℃, 37℃, 45℃ 에서 실험을 수행한 결과,30 와℃와 37℃ 에서는 미생물 성장은 유사하였으나 효소생산은 30℃ 에서 최적이었다 (Fig. 5).
이상의 결과에서 최적화한 배지에서 invertase를 생산한 다음 2.5% (w/v) sucrose를 기질로 효소 용액 sucrose 1 mg 당 20 units의 효소량으로 각각 6, 20시간 반응한 결과, 전환률이 각각 62.3%, 96.9%이었다 (Fig. 9).
일반적으로 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있는 여러가지 금속이온들을 효소 반응액에 첨가한 결과, Ag, Mg, Mn 등을 첨가한 경우 각각 88.2%, 62.7%, 80.3%로 효소 활성이 저해되었으며, K 및 Fe를 첨가한 경우 효소 활성이 10% 정도 증가되었다 (Table 1).
2). 질소원의 경우 potassium nitrate, malt extract, meat peptone, poly peptone, ammonium sulfate, yeast extract를 검토한 결과, m시t extract와 meat peptone, poly peptone에서 미생물 성장이 유리하였으나 potassium nitrate에서 가장 높은 효소 생산성을 나타내었다 (Fig. 3). 이 결과는 Kaur 등 [26] 이 Streptomyces sp.
6). 최적 pH 값을 100%로 하였을 때, pH 4.0 에서는 효소활성이 30.2%로 감소하였고, pH 7.0, 8.0에서는 효소활성이 각각 36.5, 33.9%로 감소히쵸 pH 5.0-6.0의 약산성 부근에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 Aspergillus niger 및 Pteris deflexa 등으로부터 생산된 invertase의 최적반응 pH와 동일하고 [20-22], 식물기원의 invertase 역시 최적 활성이 5~7 전후로 보고되고 있다.
탄소 원으로 glucose, lactose, s이bit이, fructose, sucrose, maltose을 검토한 결과, 미생물 성장은 m시tose 배지에서 최대였으나, 예상대로 sucrose를 탄소 원으로 한 배지에서만 특이적으로 invertase가 생산되었다 (Fig. 2). 질소원의 경우 potassium nitrate, malt extract, meat peptone, poly peptone, ammonium sulfate, yeast extract를 검토한 결과, m시t extract와 meat peptone, poly peptone에서 미생물 성장이 유리하였으나 potassium nitrate에서 가장 높은 효소 생산성을 나타내었다 (Fig.
탄소 원으로 sucrose, 질소원으로 potassium nitrate를 사용한 배지에 K2HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄-7H₂O, MnSO₄-5H₂O 의 등의 금속이온을 2 tnM첨가하여 배양한 결과, Fig. 4에서와 같이 미생물의 성장은 금속이온의 영향이 크지 않았으나, Mg 및 Mn 이온을 첨가한 경우 효소생산이 각각 200%, 187%로 증가하였다.
토양으로부터 분리한 invertase 생성 균주를 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) 에 의뢰 하여 동정 한 결과, Bacillus刀ws로 동정되었다 (Fig. 1, 기탁번호 AB021185).

후속연구

주된 관심사였다. 따라서 본 연구에서 Bacilus flexus 로부터 분리한 새로운 invertase를 보고하였는데, 산업 균주로 활용하기 위해서는 향후 효소의 정제를 통해 이 효소의 분자 수준의 특성을 이해하는 후속 연구가 필요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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