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문제 정의
- 담수산 클로렐라에서의 카로티노이드계 물질의 추출 및 효능에 대해서는 많은 연구가 이루어졌지만, 아직 해수산 클로렐라에 대해서는 그 연구가 미비하여, 본 연구에서는 해수산클로렐라 Chlorella ellipsoidea 유기용 매 주줄물에서의 항염증활성을 조사하기 위하여 LPS로 활성화된 마우스 대식세포유래의 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성 억제 효과 및 염증성사이토카인 IL-6, TNF-α의 생성 억제 효능을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 마우스대식세포를 이용하여 염증 매 개 인자들의 분비에 대한 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea 유기용 매 추출물의 억제효과를 조사하여, 이들이 염증 반응에 미치는 영향을 비교하고자 하였다. LPS에 24시간 노출시키게 되면 뚜렷하게 NO가 축적되는데 해수 클로렐라 유기용 매 추출물은 LPS에 의한 NO와 interleukin-6 (IL-6), TNF-q 발현을 억제함을 확인하였다.
제안 방법
- NO의 농도는 sodium nitrite (NaNCb)를 사용하여 얻은 표준직선과 비교하여 산출하였다. 100% 활성은 LPS만 처리한 군의 분비량으로 정의하여 상대적인 생성량(% of control)을 계산하였다.
- LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포가 분비하는 NO에 대한 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea의 유기용매 주출몰 CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA의 영향을 Griess 시약을 사용하여 조사하였다 (Fig. 3). 그 결과 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 NO가 소량 생성되었으나, LPS 처리 후 약 96배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE+A는 대조군인 LPS에의해 유도된 높은 NO 생성에 대해 농도의존적으로 유의성있게 억제 효과를 나타내었다, 특히, CE-Met는 최고농도인 80㎍/mL에서 73% 정도의 높은 억제 효과를 나타내어 CE-Hex.
- 배양 상층 액 각 50 ㎕씩을 96 well plate에 취하고, 여기에 동량의 Griess 시약을 넣어 상온의 어두운 곳에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 UV 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 sodium nitrite (NaNCb)를 사용하여 얻은 표준직선과 비교하여 산출하였다. 100% 활성은 LPS만 처리한 군의 분비량으로 정의하여 상대적인 생성량(% of control)을 계산하였다.
- The production of IL-6 and TNF-α was measured by ELISA kit. Three independent assays were performed in triplicate and the data shown arc the mean ± S.D. of the percent inhibition of cytokine compared with the *Scoignntriofilc. ant difference of (P<0.
- 건조된 메탄올 추출물에 10배량의 80% 메탄올과 동량의 헥산을 첨가하여 분획깔대기로 헥산과 80% 메탄올 층으로 분획화하였다. 80% 메탄올 층은 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 에틸아세테이트와 물을 동량 처리하여 분획깔대기로 에틸아세테 이트와 수층으로 분획 화하였다.
- 7 세포에 LPS와 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea의 유기용매분획물 CE-Met, CE-Hex. 그리고 CE-EA을 처리한 후, IL-6, TNF-α 생성량의 변화를 확인하였다(Fig. 4). IL-6 생성량은 정상 세포에 비하여 LPS를 처리 후약 96배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA는 대조군에 비해 농도의존적으로 유의성 있게 감소하였다 (Fig.
- 8 g을 획득하였다. 그리고 메탄올 추출물을 10배량의 80% 메탄올을 넣고 헥산, 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 헥산 층에서 8.7 g, 에틸아세테이트 중에서 2.5 g의 분획물을 획득하였다 (Table 1).
- 24시간 후, 배양액을 제거하고, MTT를 최종 농도 500 ㎍/mL이 되도록 각 well에 가하고 추가로 4시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 배양액을 모두 제거하고 DMSO 용액 150 ㎕ 을 첨가하여 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, Microplate reader(Opsys MR, DYNEX, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였다.
- 7 세포를 24 well plate에 2×105 cells/well1이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 LPS 500 ng/mL와 클로렐라 추출물(0, 5, 10, 20, 40, 80 zzg/mL) 및 양성대 조물질 L-NMMA (NG-Methyl-L-arginine acetate salt, Sigma) (80 μM)을 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후배지에 분비된 NO양을 Griess 반응에 기초하여 측정하였다.
- 7 세포를 24 well plate에 2×105 cells/well이 되도록분주하고 37 G 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 LPS 500 ng/mL와 클로렐라 추출물(0, 5, 10, 20, 40, 80㎍/㎖) 및 양성대 조물질 Polymyxin B (100 U/mL)을 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지에 분비된 80% 메탄올 층은 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 에틸아세테이트와 물을 동량 처리하여 분획깔대기로 에틸아세테 이트와 수층으로 분획 화하였다. 순차적으로 분획화한 헥산, 에틸아세테이트 분획물은 감압농축기를 이용하여 각각 농축한 후, 동결건조하였다. 각 동결 건조하여 얻은 80% 메탄올 추출물(C&Met)과 헥산 분획물 (CE-Hex), 에틸아세테이트 분획물 (CE-EA)을 실험에 사용하였다 (Fig.
- iphenyl tetrazolium bromide) (Sigma, MO, USA) assay를 실시하였다. 이 방법은 MTT가 fdrmazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 96 well plate에 lxloMiis/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 클로렐라 추출믈을 농도별(0, 5, 10, 20, 40, 80 ㎍/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고, MTT를 최종 농도 500 ㎍/mL이 되도록 각 well에 가하고 추가로 4시간 동안 37℃에서 반응시켰다.
- 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea로 부터 추출한 유기용매 추출물 CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA를 이용하여 마우스 대식세 포인 RAW 264.7세포에 대한 독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA 을 농도별(0, 5, 10, 20, 40, 80 ㎍/mL)로 처리하여 24시간 후 세포 생존율을 즉정한 결과, 모든 농도에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다 (Fig.
- 해수산 클로렐라 유기용 매 추출물의 세포독성을 확인하고자 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazo]-2-yl)-2, 5-d.iphenyl tetrazolium bromide) (Sigma, MO, USA) assay를 실시하였다. 이 방법은 MTT가 fdrmazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 96 well plate에 lxloMiis/well의 RAW 264.
대상 데이터
- 순차적으로 분획화한 헥산, 에틸아세테이트 분획물은 감압농축기를 이용하여 각각 농축한 후, 동결건조하였다. 각 동결 건조하여 얻은 80% 메탄올 추출물(C&Met)과 헥산 분획물 (CE-Hex), 에틸아세테이트 분획물 (CE-EA)을 실험에 사용하였다 (Fig. 1).
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 구입하였고, 세포배양은 10% FBS, 100 unit/mL penicillin, 그리고 100 ㎍/mL streptomycin을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea는부산 사상구에 위치한 (주)클로랜드에서 농축된 배양액을 제공받았다.
- 또한, CE-Met는 CE-EA와 CE-Hex에 비해 IL-6와 TNF-α 생성 억제 효과가 모두 높음이 확인되었다. 양성 대조군으로는 LPS의 활성을 저해하는 물질로 알려진 polymyxin B를 사용하였다.
- 27%, CE-EA 53%에 비해 NO 생성 억제 효과가 높음이 확인되었다. 양성대조군으로는 L-nrginine과의 기질경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 b-NMMA을 사용하였고 54% 정도의 NO 생성 억제 효과를 나타내었다.
- 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea를 초음파 파쇄 후 얻은 건조분말 시료 100 g을 80% 메탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추줄액을 감압 농죽하고 조추줄물 44.8 g을 획득하였다. 그리고 메탄올 추출물을 10배량의 80% 메탄올을 넣고 헥산, 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 헥산 층에서 8.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3회 이상 실험을 반복하여 얻은 자료를 Microsoft Excel을 이용하여 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 데이터에 대한 분산의 동질성을 확인하고 그룹 간의 유의성을 검증하기 위하여 SPSS 14.0 program (version 14.0 KO for Windows Release 14.0.2)을 사용하여 통계학적 해석을 실시하였다. 실험군 간 비교에는 ANOVA t* est 실시하였으며, 유의한 차이를 나타낼 경우 Dunnetfs t-test를 이용하여 사후 분석을 실시하였다 (유의 수준 P<0.
- 2)을 사용하여 통계학적 해석을 실시하였다. 실험군 간 비교에는 ANOVA t* est 실시하였으며, 유의한 차이를 나타낼 경우 Dunnetfs t-test를 이용하여 사후 분석을 실시하였다 (유의 수준 P<0.05).
이론/모형
- 세포에 LPS 500 ng/mL와 클로렐라 추출물(0, 5, 10, 20, 40, 80 zzg/mL) 및 양성대 조물질 L-NMMA (NG-Methyl-L-arginine acetate salt, Sigma) (80 μM)을 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후배지에 분비된 NO양을 Griess 반응에 기초하여 측정하였다. 배양 상층 액 각 50 ㎕씩을 96 well plate에 취하고, 여기에 동량의 Griess 시약을 넣어 상온의 어두운 곳에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 UV 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- of CE-Met? CE-Hex, and CE-EA for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. Three independent assays were performoi in triplicate and the data shown are the mean ± SD,
성능/효과
- 그 결과 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 NO가 소량 생성되었으나, LPS 처리 후 약 96배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE+A는 대조군인 LPS에의해 유도된 높은 NO 생성에 대해 농도의존적으로 유의성있게 억제 효과를 나타내었다, 특히, CE-Met는 최고농도인 80㎍/mL에서 73% 정도의 높은 억제 효과를 나타내어 CE-Hex. 27%, CE-EA 53%에 비해 NO 생성 억제 효과가 높음이 확인되었다. 양성대조군으로는 L-nrginine과의 기질경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 b-NMMA을 사용하였고 54% 정도의 NO 생성 억제 효과를 나타내었다.
- 7세포에 대한 독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA 을 농도별(0, 5, 10, 20, 40, 80 ㎍/mL)로 처리하여 24시간 후 세포 생존율을 즉정한 결과, 모든 농도에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다 (Fig. 2).
- 4). IL-6 생성량은 정상 세포에 비하여 LPS를 처리 후약 96배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA는 대조군에 비해 농도의존적으로 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 4A). LPS 처리 후 TNF-tf 생성링은 정상 대조군 세포에 비해 97배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA을 처리한 군에서는 대조군에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig.
- 4A). LPS 처리 후 TNF-tf 생성링은 정상 대조군 세포에 비해 97배 증가하였으며, CE-Met, CE-Hex 그리고 CE-EA을 처리한 군에서는 대조군에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4B). 또한, CE-Met는 CE-EA와 CE-Hex에 비해 IL-6와 TNF-α 생성 억제 효과가 모두 높음이 확인되었다.
- 7 마우스대식세포를 이용하여 염증 매 개 인자들의 분비에 대한 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea 유기용 매 추출물의 억제효과를 조사하여, 이들이 염증 반응에 미치는 영향을 비교하고자 하였다. LPS에 24시간 노출시키게 되면 뚜렷하게 NO가 축적되는데 해수 클로렐라 유기용 매 추출물은 LPS에 의한 NO와 interleukin-6 (IL-6), TNF-q 발현을 억제함을 확인하였다. 염증전구물질인 TNF-α와 IL-6는 in vivo 및 in vitro에서 모두염증반응을 조절하는 물질로 알려져 있다.
- 4B). 또한, CE-Met는 CE-EA와 CE-Hex에 비해 IL-6와 TNF-α 생성 억제 효과가 모두 높음이 확인되었다. 양성 대조군으로는 LPS의 활성을 저해하는 물질로 알려진 polymyxin B를 사용하였다.
- 해수산 클로렐라 Chlorella ellipsoidea 유기용 매 추출물에 의한 TNF-α 및 IL-6의 생성저해는 염증 전구물질의 형성 억제를 나타내는 것이다. 본 실험 결과를 요약하면 해수클로렐라 Chlorella ellipsoidea 유기용 먜 추출물 (CE-Met CE-Hex 그리고 CE-EA) 의 RAW 264.7세포에서 LPS에 의한 NO와 염증성 사이토카인 interleukin-6 (IL-6), TNF-α발현 억제 효능이 있음이 확인되었고, 특히 CE-Mㄷㅅ는 피부 트러블의 보완 가능한 천연 항염증소재로의 가치가 있음을 제시하고 있다.
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