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문제 정의
- 저자 등은 우심낭에서 무세포화 처치를 시행하고’ 이어 고농도의 GA 처리와 알코올 전처치를 포함한 여러 고정방법을 시행함으로써, 무세포화와 고정 방법이 이식편의석회화와 기계적 특성에 끼치는 영향을 평가하고자 하였다. 우심낭 고정 시의 GA 농도는, 임상에서 통상적으로 사용하는 1% 이하와 기존의 연구에서 항석회화 효과가 관찰된 3% 이하에서 0.
제안 방법
- 측정하였다. 장력의 측정은 Automated Materials Testing System with Digital Force Gauge (Model 5FGN, Japan Tech & Manufacture)를 사용하여 100 mm/min의 속도로 심낭 절편 양측을 신장하여 끊어질 때 나타난 값을 그 심낭 절편의 장력(tensile strength)으로 하였으며 단위는 "Kgf/ width 5 nun”로 표시하였다. 두께 측정 시, 각각의 심낭편을 장력 측정 전 캘리퍼스 Mitutoyo Thickness Gauge (Digi- matic 543-122-15, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 양쪽 끝과 그 중간의 두께를 측정하여 세 값의 평균을, 측정한 심낭 편의 두께 값이 되도록 하였다.
- Thermal stability 검사의 경우 shrinkage temperature test의 방식을 취하였는데, 분당 2℃ 상승하도록 만든 생리 식염수가 담겨있는 욕조에서 8x10 mm 의 절편에 일정한 부하를 유지시킨 후 온도 상승 시 1%의 길이 단축이 있는 온도를 그 값으로 정하였다.
- ① 0.5 % GA로 2주간 처치한 군과, ② 0.5% GA로 5일간 처치한 후 2일간 2% GA와 7일간 0.25% GA 로 순차적으로 처치한 군, ③ 0.5% GA로 5일간 처치하고 2일간 2% GA와 7일간 0.25% GA로 순차적으로 처치한 후 70% 에탄올에서 2일간 처치한 군, ④ 0.5% GA로 5일간 처치하고 2% GA와 70% 에탄올의 혼합액으로 2일간 처치한 후, 0.25% GA로 7일간 처치한 군, 그리고 ⑤ 0.5% GA 로 5일간 처치하고 2% GA, 65% 에탄올 그리고 5% octa- nediol의 혼합액으로 2일간 처치한 후, 0.25% GA로 7일간 처치한 군의 상기 다섯 가지 방법으로 처리한 군으로 구분하였다. ③, ④, ⑤의 방법에서는 유기용매 처치 후 Hanks' solution으로 1시간 처치 후 다음 과정을 시행하였으며 모든 처치는 상온에서 시행하였다.
- 25% GA로 7일간 처치한 군의 상기 다섯 가지 방법으로 처리한 군으로 구분하였다. ③, ④, ⑤의 방법에서는 유기용매 처치 후 Hanks' solution으로 1시간 처치 후 다음 과정을 시행하였으며 모든 처치는 상온에서 시행하였다. 처치 후 심낭편은 0.
- 각각의 방법의 석회화 정도를 평가하기 위해서 쥐의 피하조직에 우심낭편을 이식하였다. 기존의 보고에서는 3 주령 쥐의 피하조직에 조직을 이식하는 경우 이식 후 8주 정도에 최대한도(200~250ug/mg)의 석회화 효과를 얻을 수 있는 것으로 되어 있으몌 1], 본 실험에서는 석회화의 정도는 무세포화나, 알코올 전처치를 시행하지 않은 경우 최대 70ug/mg 정도의 수치를 보였다.
- 각각의 처치가 끝난 심낭편은 10% 포르말린 용액에 후 고정한 후 파라핀포매 조직을 만들어 2~4“m 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 각각의 처치가 끝난 우심낭편을 homogenized 한 후, 2 : 1 chloroform/methanol을 이용하여 지질을 추출하여 중성지방과 콜레스테롤 양을 측정하였다.
- 각각의 처치된 우심낭편에 대하여 한 군 당 각각 5개의 5x50 mm 장방형 절편을 취하여 폭 5 mm에 대한 인장강도를 측정하였다. 장력의 측정은 Automated Materials Testing System with Digital Force Gauge (Model 5FGN, Japan Tech & Manufacture)를 사용하여 100 mm/min의 속도로 심낭 절편 양측을 신장하여 끊어질 때 나타난 값을 그 심낭 절편의 장력(tensile strength)으로 하였으며 단위는 "Kgf/ width 5 nun”로 표시하였다.
- 채취한 절편을 건조하고 칼슘을 추출한 후, atomic absorption spectrophotometer를 사용하여 그 양을 측정하였다. 대조군은 무세포화 처치를 시행하지 않고 0.5% GA에 고정한 심낭편의 칼슘 양을 이용하였다.
- 장력의 측정은 Automated Materials Testing System with Digital Force Gauge (Model 5FGN, Japan Tech & Manufacture)를 사용하여 100 mm/min의 속도로 심낭 절편 양측을 신장하여 끊어질 때 나타난 값을 그 심낭 절편의 장력(tensile strength)으로 하였으며 단위는 "Kgf/ width 5 nun”로 표시하였다. 두께 측정 시, 각각의 심낭편을 장력 측정 전 캘리퍼스 Mitutoyo Thickness Gauge (Digi- matic 543-122-15, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 양쪽 끝과 그 중간의 두께를 측정하여 세 값의 평균을, 측정한 심낭 편의 두께 값이 되도록 하였다.
- 후 석회화의 정도를 측정하였다. 또한 고정 시 etha- nol과 octanediol-i- 사용한 유기용매 처치를 시행한 군도 추가함으로써 이식편의 GA 고정 시 알코올 전처치가 끼치는 영향도 평가하였다.
- 무세포화 처치를 시행한 우심낭과 무세포화 처치를 시행하지 않은 우심낭을 각각 5가지의 방법으로 고정하여 분류하였다. ① 0.
- 실험실에 도착 즉시 심낭 주변의 지방 조직과 심근을 깨끗이 제거한 후 우심낭의 무세포화 처치를 위해 회전분 탕기(rotator shaker) 내의 저장성 용액(Tris, 10 mmol/L; ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA), 0.05%; aprotinin, 5 KIU/mL; Neomycin trisulfate 50 mg/L; pH 8)에 분당 200회의 constant shaking 상태로 12시간 동안 담가둔 후, 0.25% SDS를 첨가한 6 ~ 8P의 저장성 용액에 분당 200회의 constant shaking 상태로 24시간 동안 담가두었다. 이후 4℃의 고장 성 용액 (Tris, 100 mmol; NaCl, 0.
- 동일한 고정방법으로 처리한 무세포화를 시행한 군과 시행하지 않은 군끼리 비모수적 방법으로 Mann-Whitney test를 통해 그 차이를 검증하였다. 심낭편의 두께와 장력의 관계는 Spearman 상관 분석을 2개의 그룹에서 각각 시행하였다. 지질과 칼슘의 양은 전체 군과 무세포화를 시행한 군, 그리고 무세포화를 시행하지 않은 군에서 각각 비모수 적 방법으로 Kruskal Wallis test를 시행하고, one way ANOVA post-hoc test (Turkey test)로 다중비교를 하였다.
- 05%; aprotinin, 5 KIU/mL; Neomycin trisulfate 50 mg/L; pH 8)에 constant shaking 상태로 12시간 동안 저장하였다. 저장성과 등장성 용액에는 단백분해효소의 억제를 위해 aprotinin과 EDTA, Neomycin trisulfate를 투여하였다.
- 절편을 만들었다. 주령 6주 정도의 150~200 그람 무게가 나가는 암컷 Sprague-Dawley rat을 0.2 cc Zoletil과 0.1 cc Rompun 복막주사를 통하여 마취를 시행하고, 제모를 시행한 배부에 피부절개를 가한 후 피하조직에 우심낭편을 이식하였다. 심낭편 이식 8주가 지난 후 Thiopental 복막 주사를 통하여 안락사 시킨 후 이식하였던 절편을 채취하였다.
- 지질량을 비교할 때 유기용매 처치의 효과를 보기 위하여, 무세포화를 시행하거나 시행하지 않은 2개의 그룹 안에서, GA만으로 고정한 군과 유기용매를 처치한 군 2개의 군으로 각각 나누어 총 4개의 군을 비교하였다. 유기용매를 처치하는 경우 무세포화와 상관없이 콜레스테롤의 감소가 관찰되었으며, 중성지방의 경우 무세포화를 시행한 그룹에서만 그 값이 감소하였다.
- 심낭편 이식 8주가 지난 후 Thiopental 복막 주사를 통하여 안락사 시킨 후 이식하였던 절편을 채취하였다. 채취한 절편을 건조하고 칼슘을 추출한 후, atomic absorption spectrophotometer를 사용하여 그 양을 측정하였다. 대조군은 무세포화 처치를 시행하지 않고 0.
대상 데이터
- 도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 소를 도살 직후 심낭을 적출하여 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1 M, pH 7.4, 4℃)에 담가 아이스박스에 넣어 실험실로 이동하였다.
- 1 cc Rompun 복막주사를 통하여 마취를 시행하고, 제모를 시행한 배부에 피부절개를 가한 후 피하조직에 우심낭편을 이식하였다. 심낭편 이식 8주가 지난 후 Thiopental 복막 주사를 통하여 안락사 시킨 후 이식하였던 절편을 채취하였다. 채취한 절편을 건조하고 칼슘을 추출한 후, atomic absorption spectrophotometer를 사용하여 그 양을 측정하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 통계적 차이는 기계적 특성의 경우, 무세 포화를 시행한 그룹과 시행하지 않은 그룹 안에서 각각 비모수 적 방법으로 Kruskal Wallis test를 시행하였으며, one way ANOVA post-hoc test (Turkey test)로 다중비교를 하였다. 동일한 고정방법으로 처리한 무세포화를 시행한 군과 시행하지 않은 군끼리 비모수적 방법으로 Mann-Whitney test를 통해 그 차이를 검증하였다.
- 동일한 고정방법으로 처리한 무세포화를 시행한 군과 시행하지 않은 군끼리 비모수적 방법으로 Mann-Whitney test를 통해 그 차이를 검증하였다. 심낭편의 두께와 장력의 관계는 Spearman 상관 분석을 2개의 그룹에서 각각 시행하였다.
- 심낭편의 두께와 장력의 관계는 Spearman 상관 분석을 2개의 그룹에서 각각 시행하였다. 지질과 칼슘의 양은 전체 군과 무세포화를 시행한 군, 그리고 무세포화를 시행하지 않은 군에서 각각 비모수 적 방법으로 Kruskal Wallis test를 시행하고, one way ANOVA post-hoc test (Turkey test)로 다중비교를 하였다.
성능/효과
- 05). 0.5% GA 처치만을 시행한 군을 대조군으로 비교하였을 때 무세포화 처치를 시행한 모든 군에서 석회화의 감소를 보였으며, 이는 고농도의 GA 처치를 시행한 군에 대해서도 같은 양상을 보였다.
- 3). 고정 방법에 따라 분류한 군을 다중비교하였을 때, 장력의 경우, 10군이 다른 모든 군과 유의한 차이가 있었으며 (p< 0.05), Thermal stability test 결과 10군과 9군 간에 유의한 차이가 있었다(p< 0.05).
- 우심낭편을 이식하였다. 기존의 보고에서는 3 주령 쥐의 피하조직에 조직을 이식하는 경우 이식 후 8주 정도에 최대한도(200~250ug/mg)의 석회화 효과를 얻을 수 있는 것으로 되어 있으몌 1], 본 실험에서는 석회화의 정도는 무세포화나, 알코올 전처치를 시행하지 않은 경우 최대 70ug/mg 정도의 수치를 보였다. 무세포화는 강한 항 석회화의 효과가 있었으며, 유기용매 전처치를 시행하는 경우 무세포화를 시행하지 않은 그룹에서 석회화의 정도가 줄어들었고, 유기용매 전처치와 무세포화를 병행 시석회화의 양이 더욱 의미있게 감소하였다.
- 세분화된 유기용매의 구분에서는 octanediol 전처치를 시행하는 경우 석회화 정도가 가장 낮은 것으로 나타났다. 기존의 연구 결과와는 달리 이 실험에서는 고농도의 GA 고정은 항석회화 효과를 보이지 않았다.
- 동일한 고정 방법을 사용하였을 때 장력의 비교는 두께의 보정을 위해 index값을(장력/두께, kgf/5 mm/mm) 사용하였으며, 무세포화를 시행하는 경우 4, 5번을 제외한 고정 방법에서 유의한 장력의 변화가 있는 것으로 나타났다 (p<0.05). 또한 고농도의(2%) GA로 고정시키는 경우와 octanediol을 투여하는 두 가지 경우를 제외하고 유의한 thermal stability의 감소가 있었다(Fig.
- 05). 또한 고농도의(2%) GA로 고정시키는 경우와 octanediol을 투여하는 두 가지 경우를 제외하고 유의한 thermal stability의 감소가 있었다(Fig. 4, Table 2).
- 무세포화 처리를 시행한 그룹 안에서 유기용매 전처치는 의미 있는 항석회화 효과를 보이지 않았으며 이는 무세포화 처리에 의해 유기용매의 항석회화 효과가 감소되었기 때문일 것으로 생각된다(Table 3, 4, Fig. 7).
- 기존의 보고에서는 3 주령 쥐의 피하조직에 조직을 이식하는 경우 이식 후 8주 정도에 최대한도(200~250ug/mg)의 석회화 효과를 얻을 수 있는 것으로 되어 있으몌 1], 본 실험에서는 석회화의 정도는 무세포화나, 알코올 전처치를 시행하지 않은 경우 최대 70ug/mg 정도의 수치를 보였다. 무세포화는 강한 항 석회화의 효과가 있었으며, 유기용매 전처치를 시행하는 경우 무세포화를 시행하지 않은 그룹에서 석회화의 정도가 줄어들었고, 유기용매 전처치와 무세포화를 병행 시석회화의 양이 더욱 의미있게 감소하였다. 세분화된 유기용매의 구분에서는 octanediol 전처치를 시행하는 경우 석회화 정도가 가장 낮은 것으로 나타났다.
- 무세포화는 동일한 고정 방법을 사용하였을 때 우심낭에 평균 32% 정도의 장력의 감소를 가져오는 것으로 나타났으며, (8-68%) octanediol을 투여하는 경우 무세포화 시 장력이 떨어지는 것을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다, 또한 octanediol 투여나 고농도의 GA 처치를 하지 않는 경우 thermal stability도 감소하는 것으로 나타났다.
- 무세포화를 시행하지 않은 심낭편에서는 두께와 장력이 고정 방법에 따라 유의한 차이가 있는 것으로 나타났으며 (p <0.05) 다중 비교를 통해서 비교하였을 때, 장력의 경우 4군은 다른 모든 군과 유의한 차이가 있었고(P<0.001), 3군과 5 군 사이에도 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.05). 두께의 경우 5 군이 다른 모든 군에 비해 유의하게 두터 웠으며(p<0.
- 무세포화를 시행한 경우 신선 우심낭을 바로 고정한 경우보다 장력에서 32% 정도의 감소가 있었으며, 특이하게 octanediol 처리를 병행한 경우 무세포 처리를 시행하지 않은 경우에 비해 의미있는 장력의 감소가 없는 것으로 관찰되었다. 무세포화에 의한 기계적 특성의 약화는 무세 포화 처리 방법에 변화의 필요를 시사할 수 있으며, 이는 향후 재실험을 통해 검증되어야 할 것이다.
- 무세포화를 시행한 심낭편에서도 두께와 장력은 연관성이 있는 것으로 나타났으며(P<0.001, r=0.855), 각 심낭편은 고정 방법에 따라 두께와 장력의 차이가 있었다(p< 0.001) (Fig. 3). 고정 방법에 따라 분류한 군을 다중비교하였을 때, 장력의 경우, 10군이 다른 모든 군과 유의한 차이가 있었으며 (p< 0.
- 유기용매를 처치하는 경우 무세포화와 상관없이 콜레스테롤의 감소가 관찰되었으며, 중성지방의 경우 무세포화를 시행한 그룹에서만 그 값이 감소하였다. 무세포화를 시행한 후 중성지방과 콜레스테롤의 양이 오히려 늘어나는 양상을 보였으나 통계적 의미는 없었으며, octanediol 전처치를 시행한 경우, 무세포화 처치된 우심낭 그룹 안에서 유기용매 처치를 시행하지 않은 군에 비해 유의하게 지질량이감소되었다(p<0.05)(Fig. 5, 6).
- 각각 나누어 총 4개의 군을 비교하였다. 유기용매를 처치하는 경우 무세포화와 상관없이 콜레스테롤의 감소가 관찰되었으며, 중성지방의 경우 무세포화를 시행한 그룹에서만 그 값이 감소하였다. 무세포화를 시행한 후 중성지방과 콜레스테롤의 양이 오히려 늘어나는 양상을 보였으나 통계적 의미는 없었으며, octanediol 전처치를 시행한 경우, 무세포화 처치된 우심낭 그룹 안에서 유기용매 처치를 시행하지 않은 군에 비해 유의하게 지질량이감소되었다(p<0.
- 유기용매를 투여하지 않고 GA만으로 고정을 시행하였을 때 무세포화 처치가 석회화 정도를 낮추는 것으로 나타났다(p<0.05). 0.
후속연구
- 무세 포화와 고정을 동반하였을 때 생기는 이식편의 강도 저하는 실제 임상 상황에서 석회화를 심화시켜 이식편의 조기 부전을 가져오는 원인이 될 수 있으며, 이러한 면에서 대동물에서의 체순환 회로 내 이식 실험이, 현 실험에서 보인 기계적 강도 저하의 임상적 의미를 보다 가까이 판단할 수 있는 방법이 될 수 있을 것이다.
- 무세포화에 의한 기계적 특성의 약화는 무세 포화 처리 방법에 변화의 필요를 시사할 수 있으며, 이는 향후 재실험을 통해 검증되어야 할 것이다.
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