[논문]금은화의 NF-<tex>${\\kappa}B$</tex> 활성 억제를 통한 iNOS 조절이 NC/Nga 생쥐의 아토피 피부염에 미치는 영향

안상현; 김호현

금은화의 NF-${\\kappa}B$ 활성 억제를 통한 iNOS 조절이 NC/Nga 생쥐의 아토피 피부염에 미치는 영향
Lonicera Japonica Inhibits Atopy Dermatitis in NC/Nga Mouse through Regulation of iNOS by NF-${\\kappa}B$ Suppression 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.24 no.2, 2010년, pp.278 - 283

안상현 (동국대학교 한의과대학 해부학교실) , 김호현 (세명대학교 한의과대학 생리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Inducible nitric oxide synthase (iNOS) are important inflammation enzyme and severe up-nitric oxide (NO) production by this enzyme has been intricate with pathogenesis of atopy dermatitis. The present study was designed in order to determine whether Lonicera japonica could inhibit atopy dermatitis through modulation of iNOS by NF-${\kappa}B$ suppression. We found that IKK mRNA and iNOS mRNA expression in RAW 264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide dose-dependantly decreased by Lonicera japonica (0.4 - 1.0 mg/$m{\ell}$) and NO production decreased. The distribution of NF-${\kappa}B$ p65 and iNOS positive reacted cell in NC/Nga mice with atopy dermatitis were decreased by Lonicera japonica (45 mg/kg/day) and apoptosis were increased. These data likely indicate that Lonicera japonica may act as inflammatory regulator for atopy dermatitis through iNOS modulation by NF-${\kappa}B$B suppression and may be possible to develop useful agent for chemoprevention of NO intricate inflammatory diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 금은화의 NF-κB 활성 억제를 통한 iNOS 생성 조절이 아토피 피부염에 미치는 영향을 조사하였는데, lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW 264.7 macrophages에서 금은화 추출물 농도에 따른 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현 그리고 NO의 생성 변화를 조사하였고, 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 NF-κB 활성과 iNOS 생성 변화를 면역조직학적으로 관찰하였다.

제안 방법

Avidin biotin complex (DAKO)에 1시간동안 실온에서 반응시키고 0.05%3,3'-diaminobenzidine (DAB, Sigma)과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
D. pteronyssinus crude extract solution 처리 시작 후 3주후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. D.
pteronyssinus crude extract solution 처리 시작 후 3주후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. D. pteronyssinus crude extract solution 처리부위 피부를 10% NBF에 실온에서 24시간 동안 고정한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하고 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 피부절편내 NF-kB 활성과 iNOS 생성 변화를 관찰하기 위해 항 NF-κB와 항 iNOS 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 감압․농축 후 동결 건조하여 추출물 (수득률 31%)을 얻었다. LT군에 D. pteronyssinus crude extract solution 처리 시작 후 3주 동안 45㎖/㎏/day 량으로 구강투여 하였다.
Anti-digoxigenin-peroxidase 에 1시간 동안 반응시킨 후 DAB를 처리하였다. Methyl green에대조염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
Nitrite assay를 통해 NO 생성량을 측정하였는데, 12시간 배양된 RAW 264.7 macrophages - 5 × 105 cells/well에 LPS (1 ㎍/㎖) 2시간 처리 후 금은화 추출물을 농도별 (0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖)로 첨가하여 24시간 배양하였다.
RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 IKK primer (sense, 5' CCA CCC AGT TCC ACA AGT CT 3'; antisense, 5' CCT CCA CTG CGA ATA GCT TC 3')와 iNOS primer (sense, 5'-AGA CTG GAT TTG GCT GGT CCC TCC-3'; antisense, 5'-AGA ACT GAG GGT ACA TGCT GGA GCC-3')를 PCR machine으로 반응시켰다. PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin (sense, 5'-GGA GAA GAT CTG GCA CCA CACC-3'; antisense, 5'-CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GCT GG-3')의 증폭을 동시에 실시하였다.
RAW 264.7 macrophages - 5×105 cells/well을 6 well에 plating 하고 12시간 후에 lipopolysaccharide (1 ㎍/㎖)를 2시간 처리하여 IKK와 iNOS mRNA 발현을 유도한 후 금은화 추출물 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다.
RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 IKK primer (sense, 5' CCA CCC AGT TCC ACA AGT CT 3'; antisense, 5' CCT CCA CTG CGA ATA GCT TC 3')와 iNOS primer (sense, 5'-AGA CTG GAT TTG GCT GGT CCC TCC-3'; antisense, 5'-AGA ACT GAG GGT ACA TGCT GGA GCC-3')를 PCR machine으로 반응시켰다.
아토피 피부염은 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 cellophane tape (3M, USA) 5회 첩포를 통해 각질층 (stratum corneum)의 최상부 (desqumatation)를 제거하였다. 그런 다음 계면활성제의 하나인 5% sodium dodecyl sulfate (SDS : Sigma, USA) 1 ㎖을 면봉으로 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거한 후 D. pteronyssinus crude extract solution (10 ㎎/㎖, Woongbee meditech, Korea) 25 ㎕을 3주 동안 주 3회씩 도포하였다.
그리고 1차 항체인 mouse anti mouse NF-κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA) mouse anti mouse iNOS (1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, biotinylated goat anti-mouse IgG (DAKO)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
대한실험동물센타에서 분양 받은 태령 6주된 NC/Nga계 암컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군, 아토피 피부염 유발군 (AD군), 아토피 피부염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 아토피 피부염은 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 cellophane tape (3M, USA) 5회 첩포를 통해 각질층 (stratum corneum)의 최상부 (desqumatation)를 제거하였다.
7 macrophages에서 금은화 추출물 농도에 따른 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현 그리고 NO의 생성 변화를 조사하였고, 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 NF-κB 활성과 iNOS 생성 변화를 면역조직학적으로 관찰하였다. 아울러 apoptosis 유발 변화도 확인 하였다.
대조군, 아토피 피부염 유발군 (AD군), 아토피 피부염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 아토피 피부염은 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 cellophane tape (3M, USA) 5회 첩포를 통해 각질층 (stratum corneum)의 최상부 (desqumatation)를 제거하였다. 그런 다음 계면활성제의 하나인 5% sodium dodecyl sulfate (SDS : Sigma, USA) 1 ㎖을 면봉으로 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거한 후 D.
세포는 37℃, 5% CO₂ incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin (Gibco/BRL, USA) 을 첨가하였다.
피부절편내 NF-kB 활성과 iNOS 생성 변화를 관찰하기 위해 항 NF-κB와 항 iNOS 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 우선 절편을 proteinase K (20 ㎍/㎖, DAKO, Denmark)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum (DAKO)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse NF-κB p65 (1:500, Santa Cruz Biotec, USA) mouse anti mouse iNOS (1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, biotinylated goat anti-mouse IgG (DAKO)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
배양액 상층액 50 ㎕에 Greiss reagent (Sigma) 50 ㎕을 가하여 5분간 실온에서 반응시킨다음 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준품으로 아질산나트륨 (NaNO₂)을 사용하여 표준용량곡선을 작성하고, 질소산화물 (nitric oxide, NO₂^-) 생성을 산출하였다.
피부절편내 NF-kB 활성과 iNOS 생성 변화를 관찰하기 위해 항 NF-κB와 항 iNOS 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin (sense, 5'-GGA GAA GAT CTG GCA CCA CACC-3'; antisense, 5'-CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GCT GG-3')의 증폭을 동시에 실시하였다.

대상 데이터

금은화 추출물은 아토피 유사 피부염 유발 NC/Nga 생쥐의 진피 유두에서 NF-κB p65와 iNOS 양성반응세포의 분포 감소와 apoptosis 증가를 유도하였다.
대한실험동물센타에서 분양 받은 태령 6주된 NC/Nga계 암컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군, 아토피 피부염 유발군 (AD군), 아토피 피부염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
본 연구에서 인위적으로 아토피 피부염을 유발하기위해 자발적으로 아토피 유사 피부염을 일으킨다고 보고³³⁾된 Nc/Nga 생쥐를 이용하였다. 우선 지질방어막을 제거하기 Christophers와 Mrowietz의 방법³⁴⁾으로 각질층의 상부의 desqumatation을 제거한 다음 Minehiro 들의 방법³⁵⁾으로 계면활성제인 SDS (sodium lauryl sulfate)을 도포하여 각질층내 지질을 제거하였다.
세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다.
실험에 사용한 마우스의 RAW 264.7 macrophages는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Korea)에서 구입하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다.

데이터처리

Relative intensity, 면역조직화학 그리고 TUNEL method 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2 (Optima Co., USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 유의성은 ANOVA test (SPSS17, SPSS.
, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 유의성은 ANOVA test (SPSS17, SPSS. USA)를 통해 확인하였고, Scheffe로 사후검증 하였다.

이론/모형

NF-κB 활성에 관여하는 IKK (IκB kinase), 염증효소인 induce nitric oxide synthase (iNOS)의 mRNA 발현 양상을 조사 하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다.
금은화의 apoptosis 유도 변화를 조사하기 위해서 in situ apoptosis detection kit (Intergen, USA)를 이용한 terminal deoxynucleotid transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labelling (TUNEL) 방법을 실시하였다. 먼저 조직 절편을 proteinase K에 5분간 처리한 다음 equilibration buffer에서 20초간 반응시켰다.
된 Nc/Nga 생쥐를 이용하였다. 우선 지질방어막을 제거하기 Christophers와 Mrowietz의 방법³⁴⁾으로 각질층의 상부의 desqumatation을 제거한 다음 Minehiro 들의 방법³⁵⁾으로 계면활성제인 SDS (sodium lauryl sulfate)을 도포하여 각질층내 지질을 제거하였다. 지질방어막이 제거된 Nc/Nga 생쥐 피부에 아토피 유발원으로 보고된³⁶⁾ D.

성능/효과

IKK mRNA 발현은 LPS 처리군에 비해 LPS 처리 후 금은화 추출물이 처리된 RAW 264.7 macrophages에서 감소하였는데, 0.4 ㎎/㎖에서 4.9%, 0.6 ㎎/㎖에서 28.3%, 0.8 ㎎/㎖에서 48.3%그리고 1.0 ㎎/㎖에서 48.4%로 농도-의존적 감소를 보였다. 또한 iNOS mRNA 발현도 LPS 단독 처리군보다 LPS 처리 후 금은화 추출물 처리된 RAW 264.
이는 금은화 추출물이 IkB kinase (IKK) 생성 감소를 통해 IkB의 인산화를 억제함으로써 NF-kB/Rel 활성 억제를 유도 하였다. 그 결과 생쥐 iNOS 유전자의 TATA box 앞쪽 55bp와 917bp 위치의 NF-kB /Rel 결합부위^6,31)에 결합하여 전사 유도해야 할 NF-kB/Rel가 감소되어 iNOS mRNA 발현 감소가 유도된것으로 사료된다. 이러한 iNOS 생성 감소는 L-arginine을 전구물질로 이용한 NO 생성³²⁾에 영향을 미쳐 RAW 264.
4%로 농도-의존적 감소를 보였다. 또한 iNOS mRNA 발현도 LPS 단독 처리군보다 LPS 처리 후 금은화 추출물 처리된 RAW 264.7 macrophages에서 감소하였는데, 0.4㎎/㎖에서 8.9%, 0.6 ㎎/㎖에서 25.7%, 0.8 ㎎/㎖에서 33.3% 그리고 1.0 ㎎/㎖에서 40.2%로 농도-의존적 감소를 보였다(Fig. 1).
3A). 또한 세포질에서 강한 양성반응을 보이는 iNOS 양성반응세포의 분포 증가도 아토피 피부염 유발부위 후 진피 유두에서 관찰되었는데, LT군은 AD군에 비해 낮은 폭의 증가를 보였다. 영상분석 결과 AD군은 대조군 (380±2 /100,000 pixel)에 비해 742% 증가한 3198±186/100,000 pixel로 관찰된 반면, LT군에서는 AD군에 비해 62% 적은 1222±74/100,000 pixel로 관찰되었다(Fig.
. 본 실험에서도 진피유두에서 세포자기살해 증가가 관찰되지 않았으나, 금은화 처리군에서 apoptotic 세포의 분포가 증가된 것으로 관찰되었다.
본 연구에서 금은화 추출물의 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현 그리고 NO 생성 억제를 조사하기 위해 RAW 264.7 macrophages에 LPS를 처리하였는데, LPS 처리 후 RAW 264.7 macrophages에서의 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현은 증가하지만, 금은화 추출물 처리 시 IKK mRNA와 iNOS mRNA 발현은 감소되었다. 이는 금은화 추출물이 IkB kinase (IKK) 생성 감소를 통해 IkB의 인산화를 억제함으로써 NF-kB/Rel 활성 억제를 유도 하였다.
본 연구에서도 NF-κB 활성과 iNOS 생성 변화를 항 NF-κB p65와 항 iNOS 항체를 이용한 면역조직화학으로 조사하였는데, 아토피 유사 피부염이 심한 피부 진피 유두에서는 NF-κB p65와 iNOS 양성반응세포의 분포가 급격하게 증가된 양상을 보였다.
아토피 피부염의 한의학적 범주로는 胎熱, 乳癬, 奶癬, 胎斂瘡 등에 해당하며, 그 병인병기를 稟性不耐濕熱內蘊한 상태에서 다시 風濕熱邪의 浸淫을 받아 內外邪氣가 相搏하여 肌膚에 발생하는 것으로 보았다. 아토피 피부염에 대한 한의학적 內治法으로 증상의 발현양상, 病因病機, 발병시기에 따라 다양한 처방이 사용되고 있다⁸⁾.
영상분석 결과 AD군은 대조군 (380±2 /100,000 pixel)에 비해 742% 증가한 3198±186/100,000 pixel로 관찰된 반면, LT군에서는 AD군에 비해 62% 적은 1222±74/100,000 pixel로 관찰되었다(Fig. 3B, C).
영상분석 결과 AD군이 대조군 (258±27/100,000 pixel)에 비해 1438% 증가한 3968±1 7/100,000 pixel로 관찰된 반면, LT군에서는 AD군에 비해 40% 적은 2395±125/100,000 pixel로 관찰되었다(Fig. 3A).
영상분석 결과 TUNEL 양성반응은 AD군이 대조군 (181±13/100,000 pixel)에 비해 252% 증가한 638±51/100,000 pixel로 관찰되었고, LT군은 AD군보다 162% 증가한 1671±75/100,000 pixel로 관찰되었다(Fig. 4).
그 결과 생쥐 iNOS 유전자의 TATA box 앞쪽 55bp와 917bp 위치의 NF-kB /Rel 결합부위^6,31)에 결합하여 전사 유도해야 할 NF-kB/Rel가 감소되어 iNOS mRNA 발현 감소가 유도된것으로 사료된다. 이러한 iNOS 생성 감소는 L-arginine을 전구물질로 이용한 NO 생성³²⁾에 영향을 미쳐 RAW 264.7 macrophage 에서의 NO 생성을 감소로 이어지는데, 본 연구에서도 금은화 추출물에 의한 농도-의존적 NO 생성 감소가 측정되었다.
이상의 결과로 전사인자 NF-κB 활성 억제를 통한 염증효소 iNOS mRNA발현 억제와 NO 생성 저해능을 가진 금은화의 처리는 NC/Nga 생쥐의 아토피 피부염에서 iNOS 생성 억제함으로서 산화적 스트레스에 의한 피부손상을 완화시키고, 염증관여 세포의 세포자기살해를 유도함으로써 항염증작용에 기여하는 것으로 생각되며, 다양한 NO 관련 염증성 질환의 치료제로서의 사용가능성이 인정된다.
핵과 핵막주변 세포질에서 양성반응을 보이는 NF-κB p65양성반응세포는 아토피 피부염 유발 부위 후 진피 유두에서 증가된 양성으로 관찰되었는데, 금은화 추출물이 처리된 LT군에서는 NF-κB p65 양성반응세포 분포가 AD군에 비해 적은 것으로 관찰되었다.
핵에서 강한 TUNEL 양성반응을 보이는 apoptotic 세포는 피부염 유발 진피 유두에서 관찰되었으며, apoptotic 세포의 분포는 대조군에 비해 AD군에서 증가하였으며, LT군은 AD군보다더 큰 폭의 증가를 보였다. 영상분석 결과 TUNEL 양성반응은 AD군이 대조군 (181±13/100,000 pixel)에 비해 252% 증가한 638±51/100,000 pixel로 관찰되었고, LT군은 AD군보다 162% 증가한 1671±75/100,000 pixel로 관찰되었다(Fig.

후속연구

이상의 결과로 전사인자 NF-κB 활성 억제를 통한 염증효소 iNOS mRNA발현 억제와 NO 생성 저해능을 가진 금은화의 처리는 NC/Nga 생쥐의 아토피 피부염에서 iNOS 생성 억제함으로서 산화적 스트레스에 의한 피부손상을 완화시키고, 염증관여 세포의 세포자기살해를 유도함으로써 항염증작용에 기여하는 것으로 생각되며, 다양한 NO 관련 염증성 질환의 치료제로서의 사용가능성이 인정된다. 향후 금은화 추출 성분에 대한 개별적 연구를 통해 NF-κB 활성 억제 기전 해석이 요구되는 바이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아토피 피부염이란?	아토피 피부염은 주로 유아와 소아에 발생하는 만성 혹은 재발성 피부염이다1). 소양증이 심한 습진이 발생하며, 아토피 질환의 과거력이나 가족력이 있는 사람에게서 흔히 나타난다2).
	우리나라의 아토피 유병률은 연도에 따라 어떻게 되는가?	소양증이 심한 습진이 발생하며, 아토피 질환의 과거력이나 가족력이 있는 사람에게서 흔히 나타난다2). 우리나라의 아토피 유병률이 2001년에 인구 1,000당 12명에서 2005년 91.4 명으로 7.6배 증가 하였고3), 또한 아토피 피부염 환자 중 9세 이하가 53.4%를 차지하는 것 초․중․고교생 765만 1000명의 5.7%인 43만 명의 학생이 아토피 피부염을 앓고 있는 것으로 드러났다.으로 보고되었다4). 특히 아토피 질환 학생 통계에 따르면 아토피 피부염에서는 각질층 내 ceramide 감소로 인한 sphingosine 저하가 protein kinase C (PKC) 활성을 유도하여5), IκB kinase (IKKα, β)에 활성에 의한 IκB protein의 serine residue 인산화가 일어나며, 그 후 IκB protein은 ubiquitination 되어 26S proteasom에 의해서 분해 (degradation)되고 그 결과 유리된 전사인자 nuclear factor (NF)-κB가 핵으로 들어가 target 유전자의 NF-κB binding site에 결합하여 iNOS 발현에 의한 NO 생성이 증가되어 염증반응이 유도된다고 보고되었다6,7).
	실험에 사용할 대한실험동물센타에서 분양 받은 생쥐를 어떻게 나누었는가?	대한실험동물센타에서 분양 받은 태령 6주된 NC/Nga계 암컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군, 아토피 피부염 유발군 (AD군), 아토피 피부염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 아토피 피부염은 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 cellophane tape (3M, USA) 5회 첩포를 통해 각질층 (stratum corneum)의 최상부 (desqumatation)를 제거하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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