V. parahaemolyticus는 국내에서 여름과 가을철에 걸쳐 발생되며 생선이나 패류 등의 해산식품을 날것으로 섭취하거나 불완전하게 익혀 먹을 경우 식중독을 일으키는 병원균이다. 본 연구의 목적은 표준 검출기법인 배지배양법을 이용한 V. parahaemolyticus의 검출과 real-time PCR을 이용한 V. parahaemolyticus의 검출에 있어서 그 유효성과 효율성을 검증하는 것이다. V. parahaemolyticus의 발생기록과 발생가능성이 있는 여러 해산식품과 무순에 적절한 균량을 접종하고 APW로 증균배양하였다. 증균배양이 끝난 후 TCBS선택배지에 배양액을 획선도말하고, 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 real-time PCR을 실시하였다. TCBS에서 초록색이 나온 집락을 1-3개 선별하여 TSI 배지에 접종하여 screening test를 거친 후 API 20NE strip을 사용하여 확인동정하였다. 또한 정상세균총이 목적균의 성장과 검출에 어느 정도의 영향을 미치는지 평가하기 위하여 25 g의 식품 내 정상세균총의 수준을 함께 측정하였다. 실험결과, 자체 제작한 real-time PCR 서열은 V. parahaemolyticus를 특이적으로 검출할 수 있었고 검출 한계는 PBS에서 $10^3\;CFU/mL$ 였다. 또한, 식품 내 정상세균총이 높을 경우 증균배양 시 목적균의 성장에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였다. Real-time PCR은 180개의 전체 샘플 중 76개의 양성 결과를 보여 66개의 양성 결과를 낸 배지배양법에 비해 더 많은 양성 검출율을 보였으나 통계학적인 유의차는 발견되지 않았다. Real-time PCR은 표준검출법인 배지배양법과 비교해 볼 때 동등하거나 우수한 검출력을 지닌 것으로 보이며 이러한 realtime PCR법은 24시간 이내에 확정동정까지 가능하여 시간과 노동력의 소모가 많은 배지배양법에 앞서 선별검사로 사용할 경우 시간, 비용, 노동력 절감에 매우 유효할 것으로 판단된다.
V. parahaemolyticus는 국내에서 여름과 가을철에 걸쳐 발생되며 생선이나 패류 등의 해산식품을 날것으로 섭취하거나 불완전하게 익혀 먹을 경우 식중독을 일으키는 병원균이다. 본 연구의 목적은 표준 검출기법인 배지배양법을 이용한 V. parahaemolyticus의 검출과 real-time PCR을 이용한 V. parahaemolyticus의 검출에 있어서 그 유효성과 효율성을 검증하는 것이다. V. parahaemolyticus의 발생기록과 발생가능성이 있는 여러 해산식품과 무순에 적절한 균량을 접종하고 APW로 증균배양하였다. 증균배양이 끝난 후 TCBS선택배지에 배양액을 획선도말하고, 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 real-time PCR을 실시하였다. TCBS에서 초록색이 나온 집락을 1-3개 선별하여 TSI 배지에 접종하여 screening test를 거친 후 API 20NE strip을 사용하여 확인동정하였다. 또한 정상세균총이 목적균의 성장과 검출에 어느 정도의 영향을 미치는지 평가하기 위하여 25 g의 식품 내 정상세균총의 수준을 함께 측정하였다. 실험결과, 자체 제작한 real-time PCR 서열은 V. parahaemolyticus를 특이적으로 검출할 수 있었고 검출 한계는 PBS에서 $10^3\;CFU/mL$ 였다. 또한, 식품 내 정상세균총이 높을 경우 증균배양 시 목적균의 성장에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였다. Real-time PCR은 180개의 전체 샘플 중 76개의 양성 결과를 보여 66개의 양성 결과를 낸 배지배양법에 비해 더 많은 양성 검출율을 보였으나 통계학적인 유의차는 발견되지 않았다. Real-time PCR은 표준검출법인 배지배양법과 비교해 볼 때 동등하거나 우수한 검출력을 지닌 것으로 보이며 이러한 realtime PCR법은 24시간 이내에 확정동정까지 가능하여 시간과 노동력의 소모가 많은 배지배양법에 앞서 선별검사로 사용할 경우 시간, 비용, 노동력 절감에 매우 유효할 것으로 판단된다.
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus), which is commonly found in raw seafood, causes gastroenteritis in humans. Rapid and effective methods have been developed as culture methods require up to 5-7 days. In this study, real-time PCR was compared with the standard culture method for detecting...
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus), which is commonly found in raw seafood, causes gastroenteritis in humans. Rapid and effective methods have been developed as culture methods require up to 5-7 days. In this study, real-time PCR was compared with the standard culture method for detecting V. parahaemolyticus in seafood and radish sprout samples. Five hundred grams of the samples were artificially contaminated with V. parahaemolyticus then divided into 20 samples. The samples were incubated in alkaline peptone water and then streaked onto thiosulfate-citrate-bile saltssucrose agar. Biochemical tests for suspicious colonies were performed using the API 20NE strip. In parallel, real-time PCR was performed targeting the toxR gene using the enrichment broth. The real-time PCR was sensitive in discriminating V. parahaemolyticus from other foodborne pathogens. The detection limit of the real-time PCR was $10^3\;CFU/mL$ in phosphate-buffered saline. Although the real-time PCR detected more positive samples (76 out of 180, 42%) than the culture method (66 out of 180, 37%), there was no significant statistical difference (p>0.05) between the two methods. In conclusion, real-time PCR assays could be an alternative to the standard culture method for detecting V. parahaemolyticus in seafood and radish sprouts, which has many advantages in terms of detection time, labor, and sensitivity.
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus), which is commonly found in raw seafood, causes gastroenteritis in humans. Rapid and effective methods have been developed as culture methods require up to 5-7 days. In this study, real-time PCR was compared with the standard culture method for detecting V. parahaemolyticus in seafood and radish sprout samples. Five hundred grams of the samples were artificially contaminated with V. parahaemolyticus then divided into 20 samples. The samples were incubated in alkaline peptone water and then streaked onto thiosulfate-citrate-bile saltssucrose agar. Biochemical tests for suspicious colonies were performed using the API 20NE strip. In parallel, real-time PCR was performed targeting the toxR gene using the enrichment broth. The real-time PCR was sensitive in discriminating V. parahaemolyticus from other foodborne pathogens. The detection limit of the real-time PCR was $10^3\;CFU/mL$ in phosphate-buffered saline. Although the real-time PCR detected more positive samples (76 out of 180, 42%) than the culture method (66 out of 180, 37%), there was no significant statistical difference (p>0.05) between the two methods. In conclusion, real-time PCR assays could be an alternative to the standard culture method for detecting V. parahaemolyticus in seafood and radish sprouts, which has many advantages in terms of detection time, labor, and sensitivity.
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문제 정의
Real-time PCR을 통한 장염비브리오의 검출은 효율성과 감도가 좋은 우수한 검출기법으로 사료되나 실제 식품에서 배지배양법에 비교하여 검출능력과 검출감도가 어느 정도인지에 대해서는 정확한 비교검증이 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 real-time PCR과 표준검출법으로 사용되고 있는 배지배양법을 비교검증하여 실제 식품에서 real-time PCR의 검출감도와 검출효율성을 평가하였다. 식품의 성상과 정상세균총의 수준이 다른 다양한 식품샘플에 대해 실험하였으며, 두 방법간의 정확한 통계학적 차이를 분석하기 위해 총 20개의 샘플 중에서 부분양성과 부분음성이 나와 양성검출율의 차이를 비교할 수 있도록 실험을 설계하였다.
본 연구에서는 신속하고 정확한 TaqMan® real-time PCR을 이용한 V. parahaemolyticus의 검출을 통해 real-time PCR이 표준검출기법으로 사용되는 배지배양법과 비교하여 어느 정도의 검출 능력을 지니는지 알기 위해 두 방법간의 비교검증을 시도하였다.
제안 방법
식품접종과 동시에 접종량과 동일한 균량을 3% NaCl이 첨가된 NA에 접종하여 실제 식품샘플에 어느 정도의 균량이 접종되었는지 확인하였다. 3% NaCl이 첨가된 NA에 접종된 균은 35℃에서 18-24시간 배양 후 집락의 수를 계수하여 실제 식품에 접종된 균량을 산정하였다.
8개의 V. parahaemolyticus와 9개의 V. parahaemolyticus가 아닌 균주에서 real-time PCR을 실시하여 특이도를 측정하였으며 특이도 검증을 위한 모든 식중독균 균주는 −70 ℃보관되어 있던 실험실 보유균주를 해동하여 사용하였다.
5 µL, 샘플 DNA 5 µL로 총량을 25 µL로 하였다. ABI PRISM 7500HT sequence detection system(Applied Biosystems)을 사용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후 95℃에서 15초, 60℃에서1분을 1회로 반응조건을 맞추어 40 cycles를 반응시켰다.
배양후 TSI 배지를 관찰하여 사면부분이 빨간색, 고층부분이 노란색을 보이며, 가스와 H2S를 생성하지 않는 경우, 해당집락에 대하여 API 20NE strip(BioMérieuxsa, Marcy l’Etoile, France)을 이용하여 생화학적 테스트를 실시하였다. API 20NE strip은 제조자의 매뉴얼대로 31-32℃에서 24-48시간 배양 후 동정결과를 확인하였다.
APW에서 증균배양이 끝난 샘플에서 선택배지를 이용한 배지배양법과 real-time PCR로 V. parahaemolyticus를 검출하였다(Fig. 1).
parahaemolyticus에 존재하는 toxin regulatory gene인 toxR 유전자(GenBank accession number AY527396)를 타켓으로 하여 primer와 probe 를 제작하여 사용하였다. Primers/probe set의 서열은 Primer Express 3.0 software(Applied Biosystems)를 사용하여 제작하였으며 미국 NCBI사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 통해 검증하였다. Forward primer는 GAG CCA GCT TCT GAT AAC AAT GAC, reverse primer는 CTT CTG GTT CAA CGA TTG CG, Probe는 5'-6-FAM-TAC TAA TGA GGT AGA AAC GATMGBNFQ-3'를 사용하였다.
각 샘플에서의 배지배양법과 real-time PCR 검출율의 차이는 Table 3에서 비교되었다. 각 실험은 샘플당 1-2회에 걸쳐 실시되었으며 통계학적 비교를 위해 20개의 샘플 중 부분양성과 부분음성이 나오는 것을 목표로 접종량을 설정하였다. 배지배양법에서는 총 180개의 샘플 중 총 66개가 양성을 보였고, real-time PCR에서는 180개중 76개의 양성을 보여 real-time PCR이 배지배양법에 비해 더 많은 양성을 검출했으나 두 방법간의 p value는 0.
검출한계는 위에서 언급된 방법으로 균수를 측정하여 1.66×107 CFU/ mL 수준으로 균수가 미리 측정된 순수배양균액을 사용하여 측정되었다.
균수가 측정된 순수 배양균액의 genomic DNA를 PBS로 10진 희석한 후, real-time PCR을 실시하여 각 단계별 농도에서 Ct값을 측정하였다. 측정된 Ct값은 Table 2에 제시되어 있으며 검출 가능한 한계농도는 103 CFU/mL 수준으로 나타났다.
네 종류의 해산물과 한 종류의 채소류에 대해 실험을 실시하였다. 사용된 해산물 샘플은 패류에서는 굴과 홍합, 갑각류에서는 새우살, 어류에서는 연어가 사용되었다.
parahaemolyticus의 검출을 통해 real-time PCR이 표준검출기법으로 사용되는 배지배양법과 비교하여 어느 정도의 검출 능력을 지니는지 알기 위해 두 방법간의 비교검증을 시도하였다. 두 방법은 성상이 다른 여러가지 해산식품 및 채소에서 비교되었으며, 정상세균총을 함께 측정하여 정상세균총이 검출율에 영향을 줄 수 있는지를 살펴보았다. 연구결과, 해산식품 및 채소에서의 V.
반응액의 조성은 TaqMan® universal PCR master mix(Applied Biosystems) 12.5 µL, forward and reverse primer(900 nM) 각각 2.5 µL, probe(250 nM) 2.5 µL, 샘플 DNA 5 µL로 총량을 25 µL로 하였다.
균질화가 끝난 후, 즉시 100 µL를 뽑아서 10진 희석법으로 단계별 희석하여 NA배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 집락을 계수하여 식품에 존재하는 정상세균총의 수준을 산정하였다.
배양후 TSI 배지를 관찰하여 사면부분이 빨간색, 고층부분이 노란색을 보이며, 가스와 H2S를 생성하지 않는 경우, 해당집락에 대하여 API 20NE strip(BioMérieuxsa, Marcy l’Etoile, France)을 이용하여 생화학적 테스트를 실시하였다.
식품내에 원래부터 존재하고 있던 정상세균총이 증균과정에서 V. parahaemolyticus와 경쟁적으로 성장하여 목적균의 성장 및 검출에 영향을 줄 수 있다는 Hyeon 등(19)의 연구를 참조하여 정상세균총의 영향을 적절히 평가하기 위해 샘플로 사용된 해산식품 및 채소 25 g내의 정상세균총을 측정하였다. 균이 접종되지 않은 25 g의 샘플을 stomacher bag에 225 mL buffered peptone water와 함께 넣은 후 bagmixer(Interscience, St Nom, France)를 이용하여 30초간 균질화 시켜주었다.
따라서 본 연구에서는 real-time PCR과 표준검출법으로 사용되고 있는 배지배양법을 비교검증하여 실제 식품에서 real-time PCR의 검출감도와 검출효율성을 평가하였다. 식품의 성상과 정상세균총의 수준이 다른 다양한 식품샘플에 대해 실험하였으며, 두 방법간의 정확한 통계학적 차이를 분석하기 위해 총 20개의 샘플 중에서 부분양성과 부분음성이 나와 양성검출율의 차이를 비교할 수 있도록 실험을 설계하였다.
접종이 끝난 샘플은 4℃에서 18-24시간 동안 보관하여 실제 식품샘플과 유사하도록 안정화 과정을 거쳤다. 식품접종과 동시에 접종량과 동일한 균량을 3% NaCl이 첨가된 NA에 접종하여 실제 식품샘플에 어느 정도의 균량이 접종되었는지 확인하였다. 3% NaCl이 첨가된 NA에 접종된 균은 35℃에서 18-24시간 배양 후 집락의 수를 계수하여 실제 식품에 접종된 균량을 산정하였다.
뒤이어 100℃의 물에서 10분간 가열해준 후, 2분간 상온에서 식히고 14,000 rpm으로 3분간 다시 원심분리 하였다. 원심분리가 끝난 샘플의 상층액을 새로운 튜브에 따로 담아 real-time PCR을 수행할 샘플 DNA로 사용하였다.
parahaemolyticus을 접종한 후 균이 고르게 분포되도록 손으로 적절히 균질화 해주었다. 음성 및 양성대조군은 각각 25 g씩 선정하여 음성에는 1 mL의 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)를 접종하였고 양성에는 106 CFU/mL 이상의 균을 접종하였다. 접종이 끝난 샘플은 4℃에서 18-24시간 동안 보관하여 실제 식품샘플과 유사하도록 안정화 과정을 거쳤다.
자체 제작된 primers/probe set를 이용하여 특이도와 검출한계를 측정하였다. 8개의 V.
채소식품은 일식이나 샐러드 등을 통해 해산물과 함께 조리 및 섭취되어 교차감염 가능성이 높은 무순(radish sprouts)을 샘플로 함께 선정하였다. 접종량은 두 방법간의 유의차를 통계학적으로 비교하기 위해 20개의 샘플이 부분적인 양성과 음성이 나오는 것을 목표로 하였으며 각각의 샘플당 1-2회의 실험을 실시하였다. 실험회차 당 총 550 g의 샘플이 사용되었으며, 500 g의 bulk 샘플에 목적하는 양의 V.
종 단위(species-level)까지 검출이 가능하도록 모든 V. parahaemolyticus에 존재하는 toxin regulatory gene인 toxR 유전자(GenBank accession number AY527396)를 타켓으로 하여 primer와 probe 를 제작하여 사용하였다. Primers/probe set의 서열은 Primer Express 3.
대상 데이터
V. parahaemolyticus는 한국소비자원으로부터 분양 받아 실험실에서 보유하고 있던 식품분리 균주를 사용하였으며 −70℃에 보관하여 필요할 때마다 균주를 해동하여 사용하였다.
증균배양 후APW배지의 균액을 thiosulfate-citrate-bile saltssucrose agar(Oxoid)에 일회용 루프를 사용하여 획선도말(streaking)하여 35℃에서 18-24시간 동안 선택배양하였다. 배양이 끝난 후, 2-4 mm의 진한 청록색의 집락을 보이는 의심집락 1-3개를 선별 하였다. 진한 초록색으로 나온 단일집락을 triple sugar iron(TSI, Difco) 사면배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다.
네 종류의 해산물과 한 종류의 채소류에 대해 실험을 실시하였다. 사용된 해산물 샘플은 패류에서는 굴과 홍합, 갑각류에서는 새우살, 어류에서는 연어가 사용되었다. 해산물은 겉껍데기를 벗겨낸 가공된 해산물을 사용하였고, 해수소독 등의 방법으로 해산물을 위생적으로 취급하는 대형마트에서 모든 샘플을 구입하여 자연오염의 가능성을 배제하였다.
접종량은 두 방법간의 유의차를 통계학적으로 비교하기 위해 20개의 샘플이 부분적인 양성과 음성이 나오는 것을 목표로 하였으며 각각의 샘플당 1-2회의 실험을 실시하였다. 실험회차 당 총 550 g의 샘플이 사용되었으며, 500 g의 bulk 샘플에 목적하는 양의 V. parahaemolyticus을 접종한 후 균이 고르게 분포되도록 손으로 적절히 균질화 해주었다. 음성 및 양성대조군은 각각 25 g씩 선정하여 음성에는 1 mL의 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.
해산물은 겉껍데기를 벗겨낸 가공된 해산물을 사용하였고, 해수소독 등의 방법으로 해산물을 위생적으로 취급하는 대형마트에서 모든 샘플을 구입하여 자연오염의 가능성을 배제하였다. 채소식품은 일식이나 샐러드 등을 통해 해산물과 함께 조리 및 섭취되어 교차감염 가능성이 높은 무순(radish sprouts)을 샘플로 함께 선정하였다. 접종량은 두 방법간의 유의차를 통계학적으로 비교하기 위해 20개의 샘플이 부분적인 양성과 음성이 나오는 것을 목표로 하였으며 각각의 샘플당 1-2회의 실험을 실시하였다.
사용된 해산물 샘플은 패류에서는 굴과 홍합, 갑각류에서는 새우살, 어류에서는 연어가 사용되었다. 해산물은 겉껍데기를 벗겨낸 가공된 해산물을 사용하였고, 해수소독 등의 방법으로 해산물을 위생적으로 취급하는 대형마트에서 모든 샘플을 구입하여 자연오염의 가능성을 배제하였다. 채소식품은 일식이나 샐러드 등을 통해 해산물과 함께 조리 및 섭취되어 교차감염 가능성이 높은 무순(radish sprouts)을 샘플로 함께 선정하였다.
데이터처리
05)를 분석하였다. 검출율의 차이의 통계학적 유의차를 전체 및 각 실험회차별로 비교하였다.
APW에서 증균배양이 끝난 샘플에서 1 mL을 채취하여 DNA를 추출하였으며 DNA 추출과정은 Seo 등(20)의 연구에서 사용된 방법을 참조하였다. 각 샘플에서 채취한 1 mL의 배지액을 14,000 rpm 으로 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 PrepMan Ultra reagent (Applied Biosystems, Foster City, CA) 200 µL를 혼합한 후 남아 있는 고형물(pellet)이 적절히 파쇄될 수 있도록 10초 이상 vortexing을 실시하였다.
성능/효과
parahaemolyticus에서는 양성을 나타내고 9개의 non-V. parahaemolyticus 균주에서는 음성을 나타내어 제작된 primer와 probe가 V. parahaemolyticus의 검출에 적합함을 확인하였다.
05)는 보이지 않았다. 각각의 샘플별로 살펴보면 연어, 굴, 새우살, 무순에서는 real-time PCR에서 더 많은 양성이 검출되었고, 홍합에서는 배지배양법이 더 많은 양성을 검출했다. 샘플과 회차별로 검출율의 차이는 다소 있었으나 통계학적 유의차를 보이지 않았다(Table 3).
이는 무순의 경우 높은 수준의 균을 접종했어도 증균과정에서 정상세균총에 의해 목적균의 성장이 저해되었기 때문으로 보이며 이러한 결과는 높은 수준의 정상세균총이 목적균의 성장을 억제할 수 있다는 Hyeon 등(19)이나 Vold 등(21)의 연구결과와 일치한다. 결론적으로 실제 식품에서 무순 같이 정상세균총의 수준이 높은 식품의 경우에는 목적균의 수가 적으면 위음성의 결과를 보일 수도 있다. V.
parahaemolyticus 검출 시 real-time PCR이 배지배양법에 비해 동등하거나 우수한 검출감도를 지닌 검출법이라는 사실을 확인하였다. 또한 식품 내 존재하는 정상세균총은 증균배양에서 V. parahaemolyticus의 성장을 저해하나 선택배지와 real-time PCR을 활용한 검출에는 큰 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 toxR 유전자를 타겟 유전자로 primer/probe set를 합성하여 사용하였는데, 사용된 primer/probe set는 103 CFU/mL 수준까지 V.
배지배양법에서는 총 180개의 샘플 중 총 66개가 양성을 보였고, real-time PCR에서는 180개중 76개의 양성을 보여 real-time PCR이 배지배양법에 비해 더 많은 양성을 검출했으나 두 방법간의 p value는 0.3318로 통계학적인 유의차(p<0.05)는 보이지 않았다.
본 연구에서 사용된 샘플의 음성과 양성대조군은 배지배양법과 real-time PCR에서 결과가 모두 음성과 양성으로 나타나 사용된 샘플 및 실험방법이 적합했음을 입증하였다. 특히 음성대조군이 적절하게 나왔으므로 사용된 식품들은 자연적으로 오염된 샘플이 없었고 위양성의 가능성도 배제되었다.
parahaemolyticus의 성장을 저해하나 선택배지와 real-time PCR을 활용한 검출에는 큰 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 toxR 유전자를 타겟 유전자로 primer/probe set를 합성하여 사용하였는데, 사용된 primer/probe set는 103 CFU/mL 수준까지 V. parahaemolyticus의 검출이 가능하여 증균된 세균의 검출에 적합함을 확인하였다. 결론적으로 real-time PCR은 여러가지 식품 내 V.
두 방법은 성상이 다른 여러가지 해산식품 및 채소에서 비교되었으며, 정상세균총을 함께 측정하여 정상세균총이 검출율에 영향을 줄 수 있는지를 살펴보았다. 연구결과, 해산식품 및 채소에서의 V. parahaemolyticus 검출 시 real-time PCR이 배지배양법에 비해 동등하거나 우수한 검출감도를 지닌 검출법이라는 사실을 확인하였다. 또한 식품 내 존재하는 정상세균총은 증균배양에서 V.
해산물과 야채는 정상세균총과 접종량에서 차이를 보였으며 야채에서 정상세균총과 접종량이 더 높은 경향을 보였다. 연어, 홍합, 굴, 새우 등 해산물의 경우는 모든 샘플이 105 CFU/g 이하의 정상세균총 수준을 보였으나 무순에서는 107 CFU/g 이상으로 나타나 무순이 해산물에 비해 100배 이상 높은 수준의 정상세균총을 가지고 있음을 확인하였다. 무순은 다양하고 높은 수준의 토양세균을 갖고 있기 때문에 해산물에 비해 정상세균총이 높았던 것으로 보인다.
샘플과 회차별로 검출율의 차이는 다소 있었으나 통계학적 유의차를 보이지 않았다(Table 3). 이러한 연구 결과를 종합하여 볼 때, real-time PCR은 V. parahaemolyticus 의 검출에 있어서 식품의 성상이나 정상세균총의 수에 관계없이 표준검출법인 배지배양법과 동등하거나 더 우수한 검출민감도를 가진 기법으로 사료된다. 이는 육류 및 우유샘플에서 real-time PCR 과 배지배양법을 이용한 Salmonella spp.
무순은 다양하고 높은 수준의 토양세균을 갖고 있기 때문에 해산물에 비해 정상세균총이 높았던 것으로 보인다. 정상세균총이 높은 무순의 경우는 부분음성/부분양성을 보이기 위한 접종량도 해산물에 비해 훨씬 높았는데, 해산물의 경우에는 접종량이 4-32 CFU/500 g 수준이었으나 무순에서는 1,076-2,284 CFU/500 g 수준이었다(Table 3). 이는 무순의 경우 높은 수준의 균을 접종했어도 증균과정에서 정상세균총에 의해 목적균의 성장이 저해되었기 때문으로 보이며 이러한 결과는 높은 수준의 정상세균총이 목적균의 성장을 억제할 수 있다는 Hyeon 등(19)이나 Vold 등(21)의 연구결과와 일치한다.
Table 3에는 각 샘플의 정상세균총의 수준과 샘플에 따른 접종량이 제시되어 있다. 해산물과 야채는 정상세균총과 접종량에서 차이를 보였으며 야채에서 정상세균총과 접종량이 더 높은 경향을 보였다. 연어, 홍합, 굴, 새우 등 해산물의 경우는 모든 샘플이 105 CFU/g 이하의 정상세균총 수준을 보였으나 무순에서는 107 CFU/g 이상으로 나타나 무순이 해산물에 비해 100배 이상 높은 수준의 정상세균총을 가지고 있음을 확인하였다.
후속연구
parahaemolyticus는 국내 모든 식품에서 불검출기준이며(8) 표준검출법인 배지배양법을 표준으로 하여 검출하고 있다. Alkaline peptone water(APW)를 증균배지로 thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar(TCBS)를 선택배지로 사용하는 배지배양법은 증균배양, 선택배양, 생화학적 동정을 포함하여 5-7일 가량의 긴 기간이 소요되고 노동력의 소모가 많으며 실제 병원성이 있는 V. parahaemolyticus를 검출하기 위해서는 추가적인 확인시험이 필요하다. 따라서 배지배양법의 이러한 단점을 보완할만한 빠르고 신속한 검출기법의 개발이 지속적으로 이루어졌으며 실제로 많은 검출방법들이 소개되었다(9).
parahaemolyticus의 검출이 가능하여 증균된 세균의 검출에 적합함을 확인하였다. 결론적으로 real-time PCR은 여러가지 식품 내 V. parahaemolyticus의 검출에 있어 표준검출법인 배지배양법에 앞서 음성샘플을 신속하게 배제 할 수 있는 선별검사에 사용하기에 적합할 것으로 판단된다.
parahaemolyticus 와 유사한 청록색의 집락을 보여, 양성집락구분에 혼동을 주었기 때문으로 보인다. 이러한 경우, TCBS 배지에 염도를 추가하여 선택성을 강화한다면 V. parahaemolyticus를 더 효과적으로 검출할 수 있을 것으로 판단된다.
측정된 Ct값은 Table 2에 제시되어 있으며 검출 가능한 한계농도는 103 CFU/mL 수준으로 나타났다. 해당 검출한계는 증균을 거치는 정성실험에서 활용가능할 것으로 보이며 정량실험에서의 활용여부에 대해서는 추가적인 정량평가 실험이 필요할 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
V. parahaemolyticus 이란 무엇인가?
V. parahaemolyticus는 국내에서 여름과 가을철에 걸쳐 발생되며 생선이나 패류 등의 해산식품을 날것으로 섭취하거나 불완전하게 익혀 먹을 경우 식중독을 일으키는 병원균이다. 본 연구의 목적은 표준 검출기법인 배지배양법을 이용한 V.
V. parahaemolyticus에 의한 식중독은 어떻게 발생하는가?
V. parahaemolyticus에 의한 식중독은 주로 수온이 높은 여름철에 어패류나 갑각류 등의 해산물을 날것으로 혹은 부적절하게 조리하여 섭취하는 경우 발생하며(3,4) 조리기구 및 해산물과 함께 섭취되는 채소류 등에서 교차오염 되는 경우도 있다(5,6). 보통 수온이 높은 여름에서 가을에 걸쳐 발생하는데 국내의 경우 해산물에서 V.
real-time PCR기법의 장점은 무엇인가?
특히 real-time PCR은 독소유전자를 이용해서 병원성 장염비브리오만을 선택적으로 검출할 수 있는 장점이 있다(11). V.
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