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제안 방법
- DPPH (α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl) radical에 대한 소거활성은 Blois 등의 방법을 약간 변형하여 실험하였다.
- 5 ㎖ 혼합하여 25℃에서 20분 동안 암실에 방치 한 후 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 대조구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 다음과 같이 계산하였다.
- Fig. 4는 상황 균사체를 이용한 수삼 발효물의 열수 및 초음파 추출 공정을 통한 추출물의 HPLC 분석 결과로, 수삼 열수 추출물을 대조군으로 정하여 상황 버섯을 이용한 발효삼을 일반 수삼 추출물과 비교함으로써 균사체 발효를 통한 수삼에 존재하는 유용성분의 증감 및 본래 수삼에 존재하지 않던 성분의 생성 유무를 알아보았다.
- 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물의 Ginsenosdie 성분을 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석을 위해 시료를 수포화 부탄올 추출법을 통해 전처리한 후 Methanol에 충분히 용해시켜 0.45 ㎛ Filter로 여과한 다음 시료 주입량을 20 ㎕로 하여 ginsenosdie를 분석하였다. Ginsenoside 분석에 사용된 HPLC는 Alltech binary gradient HPLC system model 627 (Alltech associateds, Inc.
- , 1981). 따라서 상황버섯 균사체로 발효된 수삼의 페놀 함량 변화가 생리활성에 기초적인 요인이 될 수 있으므로 일반 수삼과 발효삼의 총 페놀 함량을 측정하여 Table 2에 비교하였다. 일반 수삼의 경우 6.
- 제공받은 발효인삼을 적당한 크기로 자른 후 추출에 사용하였다. 본 연구에서 시행된 열수 추출은 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료 중량의 10배수 증류수를 용매로 100℃에서 60분 추출을 3회 반복하여 추출하여 회전 감압 농축기 (Rotary vaccum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 여과 후 감압 농축과 동결건조를 거쳐 용매를 완전히 제거한 파우더 상태의 추출물을 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 상품성이 떨어지는 파삼을 기질로 하여 생리 활성 작용이 좋은 버섯 균사체를 접종시켜 배양하였다. 이러한 발효로 인해 고분자 구성성분과 연결되어 있어 인체 내 흡수 시 수용 정도가 비효율적이며, 체내 흡수가 용이하지 못하여 물리, 화학적인 작용이나 미생물에 의한 분해가 필요하였던 인삼의 주요 활성성분인 ginsenoside의 생물학적 변환을 유도하여 인삼 본래의 유용 성분의 약리적 효과가 증가되거나 또는 버섯과 인삼의 생리활성 성분 간의 시너지 효과로 인해 새로운 생리활성 성분의 창출에 기인한 생리활성 증진효과를 기대하였다.
- 총 페놀의 함량은 Folin-Denis 방법에 의하여 비색정량하여 측정하였다. 분말형태의 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물을 메탄올에 10 ㎎/㎖로 용해한 용액1 ㎖과 Folin 시약을 1 ㎖을 혼합한 뒤 3분간 정치하여 발색시킨 후 1 ㎖의 10% Sodium carbonate 용액을 서서히 가하였다. 이 혼합액을 90분간 정치한 후 Microplate reader를 사용하여 760 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 0 ㎎/㎖로 조절하여 각각 100 ㎕ 씩 첨가한후 48시간 배양하였다. 상등액을 제거하고 4℃, 10% (w/v) TCA (Trichloroacetic acid) 100 ㎕을 가하여 4℃에서 1시간 동안 정치한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온 건조하였다. 건조된 plate의 각 well에 1% (v/v) acetic acid로 녹인 0.
- 상황버섯 균사체로 발효시킨 발효삼의 항암활성을 평가하기 위해 인간 유래 위암 세포주인 AGS, 대장암 세포주인 Caco2, 폐암 세포주인 A549와 자궁암 세포주인 MCF-7을 이용하여 농도별 추출물 첨가에 따른 암세포 저해 활성 및 선택적 사멸도를 측정하였다.
- 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물의 Ginsenosdie 성분을 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석을 위해 시료를 수포화 부탄올 추출법을 통해 전처리한 후 Methanol에 충분히 용해시켜 0.
- SRB assay (Doll and Peto, 1983)는 세포의 단백질 염색을 통해 세포 증식 및 독성 정도를 평가하는 방법으로 실험에 앞서 상기 세포의 농도를 4~5 × 104 cells/㎖가 되도록 조절하여 96 well plate의 각 well에 100 ㎕ 씩 분주한 후 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CO2 incubator)하였다. 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물의 최종 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖로 조절하여 각각 100 ㎕ 씩 첨가한후 48시간 배양하였다. 상등액을 제거하고 4℃, 10% (w/v) TCA (Trichloroacetic acid) 100 ㎕을 가하여 4℃에서 1시간 동안 정치한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온 건조하였다.
- 4% (w/v) SRB 용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 염색시킨 후 결합되지 않은 SRB 염색액 제거를 위해 1% acetic acid로 4~5회 세척한다. 실온에서 완전히 건조한 후 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 ㎚ 에서 Microplate reader (THERMO max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하여 정상세포에 대한 독성 및 암세포에 대한 생육억제 활성을 계산하고, 각각의 시료 농도에서 정상세포에 대한 세포독성에 대한 암세포 생육 억제 활성비를 Selectivity로 나타내었다.
- DPPH (α,α-diphenyl-βpicrylhydrazyl) radical에 대한 소거활성은 Blois 등의 방법을 약간 변형하여 실험하였다. 용매를 Ethanol로 하여 제조한 0.1 mM DPPH 용액 1 ㎖과 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖의 농도로 조절된 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물을 0.5 ㎖ 혼합하여 25℃에서 20분 동안 암실에 방치 한 후 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 대조구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 다음과 같이 계산하였다.
- 음성 인삼 연구소에서 2008년에 재배된 4년근 파삼을 지원받아 음지의 서늘한 곳에서 자연 건조시켜 수분함량을 70%로 조절한 후 균사의 생육 영양원 5~15%를 첨가하여 고압멸균하였다. 상황버섯 액체 종균을 상기 제조된 인삼 기질 표면에 5~10% 고르게 분무하여 접종시킨 다음 22~23℃, 습도 70%에서 30일 동안 발효시킨 고체 발효물을 충주대학교로부터 지원받았다.
- 본 연구에서는 상품성이 떨어지는 파삼을 기질로 하여 생리 활성 작용이 좋은 버섯 균사체를 접종시켜 배양하였다. 이러한 발효로 인해 고분자 구성성분과 연결되어 있어 인체 내 흡수 시 수용 정도가 비효율적이며, 체내 흡수가 용이하지 못하여 물리, 화학적인 작용이나 미생물에 의한 분해가 필요하였던 인삼의 주요 활성성분인 ginsenoside의 생물학적 변환을 유도하여 인삼 본래의 유용 성분의 약리적 효과가 증가되거나 또는 버섯과 인삼의 생리활성 성분 간의 시너지 효과로 인해 새로운 생리활성 성분의 창출에 기인한 생리활성 증진효과를 기대하였다.
- 인간 유래 소화기계 암세포 주에 대한 농도별 발효삼 추출물의 항암활성을 평가하기 위해 인간 유래 위암 세포인 AGS에 대한 항암활성을 평가였다. 위암 세포에 대한 생육저해 활성과 selectivity를 측정한 결과 (Fig.
- 이 혼합액을 90분간 정치한 후 Microplate reader를 사용하여 760 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 측정하기 위해 Gallic acid를 사용하여 구한 검량선을 이용하여 당량으로 환산하여 시료 중의 총 페놀 함량을 구하였다(Cicco et al., 2009).
대상 데이터
- Ginsenoside 분석에 사용된 HPLC는 Alltech binary gradient HPLC system model 627 (Alltech associateds, Inc., USA)이며, Column은 Prevail carbohydrate ES 5 µ, 250 × 4.6 ㎜, detector는 ELSD 2000ES (203 ㎚)을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Ginsenoside 분석에 사용한 Standard는 아름사이언스 (Yongin, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 연구의 세포배양 시 사용되는 RPMI1640 (Roswell park memorial institute medium)배지와 FBS (Fetal bovine serum) 은 GIBCO (Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였으며, Hepes buffer, Gentamycin sulfate, Trypsin-EDTA는 SIGMA (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Ginsenoside 분석에 사용한 Standard는 아름사이언스 (Yongin, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
- 정상세포에 대한 독성은 인간 신장세포인 HEK293 (Human embryonic kidney cell, ATTC, Manassas, USA)을 통해 측정하였으며, 항암활성을 평가하기 위한 암세포주로는 인간 유래 위암세포인 AGS (Human stomach adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 대장암세포인 Caco-2 (Human epithelial adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 유방암 세포인 MCF-7 (Human breast adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 폐암세포인 A549 (Human lung carcinoma, ATTC, Manassas, USA)를 이용하였다. 상기의 인간 전과립세포의 배양은 37℃, 5% CO2 조건하에서 10% heating inactivated FBS를 포함한 RPMI1640 배지를 이용하여 4~5세대 계대 배양 후 실험에 사용하였다.
- 음성 인삼 연구소에서 2008년에 재배된 4년근 파삼을 지원받아 음지의 서늘한 곳에서 자연 건조시켜 수분함량을 70%로 조절한 후 균사의 생육 영양원 5~15%를 첨가하여 고압멸균하였다. 상황버섯 액체 종균을 상기 제조된 인삼 기질 표면에 5~10% 고르게 분무하여 접종시킨 다음 22~23℃, 습도 70%에서 30일 동안 발효시킨 고체 발효물을 충주대학교로부터 지원받았다. 제공받은 발효인삼을 적당한 크기로 자른 후 추출에 사용하였다.
- 정상세포에 대한 독성은 인간 신장세포인 HEK293 (Human embryonic kidney cell, ATTC, Manassas, USA)을 통해 측정하였으며, 항암활성을 평가하기 위한 암세포주로는 인간 유래 위암세포인 AGS (Human stomach adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 대장암세포인 Caco-2 (Human epithelial adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 유방암 세포인 MCF-7 (Human breast adenocarcinoma, ATTC, Manassas, USA), 폐암세포인 A549 (Human lung carcinoma, ATTC, Manassas, USA)를 이용하였다. 상기의 인간 전과립세포의 배양은 37℃, 5% CO2 조건하에서 10% heating inactivated FBS를 포함한 RPMI1640 배지를 이용하여 4~5세대 계대 배양 후 실험에 사용하였다.
- 상황버섯 액체 종균을 상기 제조된 인삼 기질 표면에 5~10% 고르게 분무하여 접종시킨 다음 22~23℃, 습도 70%에서 30일 동안 발효시킨 고체 발효물을 충주대학교로부터 지원받았다. 제공받은 발효인삼을 적당한 크기로 자른 후 추출에 사용하였다. 본 연구에서 시행된 열수 추출은 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료 중량의 10배수 증류수를 용매로 100℃에서 60분 추출을 3회 반복하여 추출하여 회전 감압 농축기 (Rotary vaccum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 여과 후 감압 농축과 동결건조를 거쳐 용매를 완전히 제거한 파우더 상태의 추출물을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Microsoft excel의 student t-test에 의해 유의성을 검정하였다. 또한 각 실험 결과는 triplicate determinations에 의한 Mean ± standard deviation (SD)로 표시하였으며, 각 평균치 간의 차이는 student t-test에 의해 P < 0.
- 또한 각 실험 결과는 triplicate determinations에 의한 Mean ± standard deviation (SD)로 표시하였으며, 각 평균치 간의 차이는 student t-test에 의해 P < 0.001, P < 0.005, P <0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 총 페놀의 함량은 Folin-Denis 방법에 의하여 비색정량하여 측정하였다. 분말형태의 상황버섯 균사체에 의해 발효된 파삼과 일반 파삼 추출물을 메탄올에 10 ㎎/㎖로 용해한 용액1 ㎖과 Folin 시약을 1 ㎖을 혼합한 뒤 3분간 정치하여 발색시킨 후 1 ㎖의 10% Sodium carbonate 용액을 서서히 가하였다.
- 항산화 활성 측정법 중의 하나인 DPPH 전자공여능 자유라디칼 소거 활성측정 방법을 통해 발효삼 추출물의 항산화 효과를 평가하였다 (Blois, 1958). DPPH는 안정한 free radical로서 이 홀전자로 인해 상자성 (Paramagnetism)을 띄게 되며 전자나 hydrogen radical을 받아들여 안정화시키기 쉽다.
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