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문제 정의
- 바이오센서의 배경신호 설정과 바이오센서에 살모넬라균이 비선택적으로 결합하는지 조사하기 위해, 항체를 고정화 하지 않은 센서에 살모넬라균 시료와 살모넬라균이 접종되지 않은 멸균 TSB 시료를 각각 반응시키는 실험을 하였다. 센서 준비는 고정화 단계에서 멸균 PBS를 항체 대신 사용하는 것을 제외하고는 그림 1에 나타낸 절차에 따랐다.
- Son 등(2007)은 센서의 감도를 높이기 위해 살모넬라균을 반응시키기 전에 초음파를 이용하여 살모넬라 세포의 조각을 추출하였다. 본 실험에서는 적절한 분쇄요인을 조사하기 위해 초음파 분쇄에 따른 결합반응을 조사하였다. 살모넬라균의 분쇄를 위해 탁상형 초음파세정기(1505P, Kodo Kiyon, Korea)가 사용되었으며 강도는 low에 설정하고 사용하였다.
- 본 연구는 Spreeta® SPR 바이오센서(TSPR1A170100, Texas Instruments, USA)를 이용하여 버퍼와 우유시료를 대상으로, 살모넬라균(Salmonella enterica serotype Enteritidis)의 신속한 검출 가능성을 조사하기 위해 수행되었으며, 고정화될 항체의 적절한 농도를 결정하고, 살모넬라 검출절차를 개발하고, 살모넬라균 검출에 대한 측정감도를 평가하였다.
- 본 연구에서는 식중독을 일으키는 대표적 병원균인 살모넬라(Salmonella spp.)를 신속하게 검출할 수 있는 SPR 바이오센서를 개발하고 버퍼시료와 식품시료를 이용하여 검출성능을 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
제안 방법
- (1) 소형이며 구매가 가능한 Spreeta® SPR 센서와 면역반응을 이용하여 살모넬라균을 검출하는 SPR 바이오센서 시스템을 구성하였다.
- (2) 항체를 고정화하기 위해, 공유결합으로 결합력이 강한 SAM(자기조립단분자막)방법을 사용하였고, 항체의 농도는 1.0 mg/mL로 선택하였다.
- SPR 바이오센서로 측정할 때 시료에 포함된 TSB의 영향을 조사하기 위하여, 항체를 센서에 고정화한 상태에서 살모넬라균을 접종하지 않고 멸균 TSB를 순차 희석한 시료에 의한 배경신호를 3회 반복 측정하였다. 측정결과를 고정화된 항체 없이 측정된 배경신호와 비교하여 항체의 고정화에 따른 통계적 차이를 조사하였다.
- SPR 바이오센서의 감도를 평가하기 위해, 항체를 고정화한 센서에 살모넬라균을 농도별(106~109 CFU/mL)로 희석하여 3회 반복 실험하였다. 실험에 사용된 시료는 TSB에서 배양된 살모넬라균을 PBS 버퍼에 희석하여 사용하였다.
- SPR 바이오센서의 검출한계는 살모넬라균을 음의 대조군과 비교하여 통계적으로 유효한 변화가 있는 농도로 결정하였다. ANOVA 분석을 통해 SPR 바이오센서의 살모넬라균 검출한계는 버퍼의 경우 106 CFU/mL로 확인되었다.
- SPR 바이오센서의 출력은 표면플라즈몬공명이 발생할 때의 굴절률(RI)이며, 시료군의 RI 측정값과 대조군에 의한 RI 측정값의 차인 상대굴절률(ΔRI)을 구하였다.
- SPR 바이오센서의 측정 결과를 이용하여 식품이 살모넬라에 오염된 후 경과한 시간을 예측하고자 살모넬라 성장곡선을 구하는 실험을 따로 수행하였다. 성장곡선을 위한 배양실험은 3 세트가 동시에 수행되었으며, 103 CFU/mL의 배양액 1 mL를 멸균수 100 mL에 희석하여 20개로 분주한 후, 30분 간격으로 10시간 동안 100 μL의 배양액을 순차적으로 희석하여 표준평판법을 이용하여 생균수를 측정하였다.
- 측정결과를 고정화된 항체 없이 측정된 배경신호와 비교하여 항체의 고정화에 따른 통계적 차이를 조사하였다. 그리고 이 결과를 음성 대조군으로 사용하여 항체를 고정화하고 살모넬라균의 접종 없이 멸균 TSB 시료와 반응하여 측정된 배경신호와 비교하였다.
- 항체고정화 과정을 간략히 설명하면, 우선 금막을 Triton X-100로 세척하고 실온에서 충분히 건조한 다음, 100 μL의 DSP/DMSO 용액(4 mg/mL)을 가하고 상온에서 30분간 배양하여 표면을 티올기화하였다. 다음 DMSO 용액으로 2~3분간 세척하여 미 부착된 티올기를 제거한 후 증류수로 2~3분간 세척하여 티올기의 활성도를 높였다. 항체(1~2 mg/mL)를 PBS 버퍼에 용해하여 150 μL 씩 40분 간격으로 3회 가해상온에서 반응시켜 공유결합을 통해 항체 층을 형성시켰다.
- 항체 고정화를 위하여 SAM 방법으로 DSP와 DMSO를 이용할 경우, 항체의 적절한 농도는 1~2 mg/mL로 권장되고 있다(Thermo Fisher Scientific Inc, 2008). 따라서 최적의 농도 결정을 위해 항체를 1.00, 1.25, 및 1.50 mg/mL의 농도로 준비하여 실험하였다. 항체의 농도 변화에 따른 SPR 바이오센서의 반응을 분석하기 위하여 살모넬라균의 최대농도인 109 CFU/mL 시료를 사용하였다.
- 마지막으로 PBS 버퍼로 1~2분 간 세척 후 10% Blocker™ BSA로 10분 간 비선택적 결합 억제 처리를 하였다.
- 살모넬라 병원균이 포함된 시료는 항체가 고정화된 센서의 금막 표면에 flow cell을 부착하고 연동펌프로 유속을 조절하여 살모넬라 병원균 시료를 공급하였다. 주입된 시료는 센서의 금막 표면에서 항체와 결합반응을 하고 나머지는 배출되도록 하였다.
- 성장곡선을 위한 배양실험은 3 세트가 동시에 수행되었으며, 103 CFU/mL의 배양액 1 mL를 멸균수 100 mL에 희석하여 20개로 분주한 후, 30분 간격으로 10시간 동안 100 μL의 배양액을 순차적으로 희석하여 표준평판법을 이용하여 생균수를 측정하였다.
- 센서 초기화를 위해 분석용 프로그램을 실행한 후, 센서 헤드부, 신호변환기, RS-232C, 컴퓨터와의 연결 상태를 확인하였다. 조명강도는 7-medium을 적분시간(integration time)은 0.
- 살모넬라균의 분쇄를 위해 탁상형 초음파세정기(1505P, Kodo Kiyon, Korea)가 사용되었으며 강도는 low에 설정하고 사용하였다. 예비실험에서 2분 이내의 초음파 분쇄는 효과가 별로 없는 것으로 확인되어, 분쇄하지 않은 경우를 대조군으로 하고 3분과 5분 씩 분쇄한 경우와 비교하였다.
- 5 ms를 선택하였다. 유량 시스템을 가동하여, 공기 주입상태에서 센서를 초기화하고, 일정 시간동안 증류수를 센서에 공급하여 기준선을 정하였다.
- 3분간의 분쇄가 5분간 분쇄한 경우보다 반응 감도를 증가시킨 것으로 나타났는데 5분의 경우 과도한 분쇄로 인해 항체와의 결합이 불충분한 것으로 판단된다. 이후 수행된 실험에서는 검출 전에 살모넬라균을 3분 간 분쇄하여 실험을 계속하였다.
- 균이 접종되지 않은 멸균 TSB시료는 살모넬라균 시료의 농도와 동등한 비율로 TSB를 멸균 PBS에 희석하여 준비하였다. 접종되지 않은 멸균 PBS 시료를 대조군으로 사용하여, 살모넬라균의 측정결과와 멸균배지의 측정결과 사이에 유효한 차이가 있는지를 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 살모넬라균의 농도는 순차 희석에 의한 표준평판법으로 확인하였다.
- 식품시료에 사용된 살모넬라균의 농도는 버퍼시료의 경우와 동일하게 준비하였다. 접종되지 않은 우유시료를 센서에 반응시켜 기준신호를 구하였다.
- 최적의 항체 농도 결정을 위해 항체의 농도를 1.00, 1.25, 및 1.50 mg/mL로 하여 각각 제작된 바이오센서를 이용하여 PBS 버퍼에 접종된 109 CFU/mL의 살모넬라균 검출 실험을 수행하였다. 그림 4는 항체농도에 따른 굴절률 변화를 보여준다.
- SPR 바이오센서로 측정할 때 시료에 포함된 TSB의 영향을 조사하기 위하여, 항체를 센서에 고정화한 상태에서 살모넬라균을 접종하지 않고 멸균 TSB를 순차 희석한 시료에 의한 배경신호를 3회 반복 측정하였다. 측정결과를 고정화된 항체 없이 측정된 배경신호와 비교하여 항체의 고정화에 따른 통계적 차이를 조사하였다. 그리고 이 결과를 음성 대조군으로 사용하여 항체를 고정화하고 살모넬라균의 접종 없이 멸균 TSB 시료와 반응하여 측정된 배경신호와 비교하였다.
- 항체고정화를 위해 티올화된 리간드를 금속 표면에 화학적으로 흡착시키는 방법을 사용하였다. 이 방법은 아비딘-바이오틴 결합 방법과 공유결합을 사용하여 결합력이 매우 강한 자기조립단분자막(Self Assembled Monolayer, SAM) 방법으로 널리 활용되는 고정화 방법으로 알려져 있다(Lazcka et al.
대상 데이터
- PBS 완충용액은 실험에 필요한 완충용액의 용매 또는 센서의 금막 표면을 세척하는 세척액으로 이용하였으며, 1 정제(tablet)의 PBS를 초순도 3차 증류수 200 mL에 용해하여 실온에서 보관하면서 사용하였다.
- SPR 바이오센서의 감도 평가에 필요한 공시균주 Salmonella Entritidis(KCTC 12401)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 공급 받았다. 분양된 균주는 배양체 상태였으며 계대배양으로 평판 tryptic soy broth(TSB)에 넣어 37℃에서 16시간의 적응기간을 거쳐 생육배양을 실행하였다.
- SPR 바이오센서의 검출성능 실험을 위해 PBS 버퍼에 살모넬라균을 101~109 CFU/mL로 희석한 시료와 시중에서 유통 중인 저지방 우유에 살모넬라균을 동일한 농도로 접종한 식품시료를 사용하였다.
- 고정된 항체의 비선택적 결합 억제를 위해 합성상태로 시판되는 Blocker™ BSA(10% in PBS, bovine serum albumin, Pierce, USA)를 구입하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
- 고정화된 항체를 포함한 센서 표면의 세척을 위하여 계면활성제인 Triton X-100(Fluka, Japan) 1%를 포함한 PBS-Triton 용액을 사용하였다. 고정된 항체의 비선택적 결합 억제를 위해 합성상태로 시판되는 Blocker™ BSA(10% in PBS, bovine serum albumin, Pierce, USA)를 구입하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
- 금막 표면(gold surface)에 고정할 항체와 결합할 티올기(-SH)를 코팅하기 위해 티올화 가교제(thiolation cross-linker)로 DSP(3,3’-dithiodipropionic acid, Sigma, USA)를 사용하였으며, DSP는 용매 DMSO(dimethyl solfoxide, Cica, USA)에 4 mg/mL의 비율로 용해하여 사용하였다.
- 병원균 시료의 주입을 위해 정격유속 0.03~1.00 mL/min을 갖는 저용량 변속 연동펌프(KH-73160-00, Cole-Parmer, USA)와 Viton 튜빙 재료를 사용하였다.
- 살모넬라 항체는 KPL사(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., MD, USA)로부터 구입해서 사용하였으며, PBS, Triton X-100, DMSO, DSP 등의 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입해서 사용하였다.
- 살모넬라균을 검출하기 위해 SPR 원리로 제작되어 소형이며 저가인 Spreeta® SPR 바이오센서를 사용하였다.
- 실험에 사용된 시료는 TSB에서 배양된 살모넬라균을 PBS 버퍼에 희석하여 사용하였다. 식품에 오염된 살모넬라균의 검출실험을 위해 시중대형마트에서 저지방 우유를 구입하여 살모넬라균을 접종하여 사용하였다. 식품시료에 사용된 살모넬라균의 농도는 버퍼시료의 경우와 동일하게 준비하였다.
- CFU/mL)로 희석하여 3회 반복 실험하였다. 실험에 사용된 시료는 TSB에서 배양된 살모넬라균을 PBS 버퍼에 희석하여 사용하였다. 식품에 오염된 살모넬라균의 검출실험을 위해 시중대형마트에서 저지방 우유를 구입하여 살모넬라균을 접종하여 사용하였다.
- 50 mg/mL의 농도로 준비하여 실험하였다. 항체의 농도 변화에 따른 SPR 바이오센서의 반응을 분석하기 위하여 살모넬라균의 최대농도인 109 CFU/mL 시료를 사용하였다. 항체 농도의 변화에 따른 SPR 바이오센서 응답의 유효한 차이를 확인하기 위해 실험결과를 생균수 측정값과 비교하였고, 생균수는 표준평판법으로 측정되었다.
데이터처리
- 항체의 농도 변화에 따른 SPR 바이오센서의 반응을 분석하기 위하여 살모넬라균의 최대농도인 109 CFU/mL 시료를 사용하였다. 항체 농도의 변화에 따른 SPR 바이오센서 응답의 유효한 차이를 확인하기 위해 실험결과를 생균수 측정값과 비교하였고, 생균수는 표준평판법으로 측정되었다.
이론/모형
- 접종되지 않은 멸균 PBS 시료를 대조군으로 사용하여, 살모넬라균의 측정결과와 멸균배지의 측정결과 사이에 유효한 차이가 있는지를 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 살모넬라균의 농도는 순차 희석에 의한 표준평판법으로 확인하였다.
- 센서로부터의 신호 측정은 본 연구진이 선행연구(Kim et al., 2009a)에서 구성한 Spreeta® SPR 바이오센서 측정시스템을 사용하여 수행하였다.
성능/효과
- (4) SPR 바이오센서의 살모넬라균 검출한계는 버퍼 및 우유시료에서 106 CFU/mL 이며, 검출에 필요한 시료의 양은 10 μl 이하이며, 검출에 소요된 시간은 준비시간을 포함하여 1시간 이내로 확인되었다.
- 그림 4는 항체농도에 따른 굴절률 변화를 보여준다. ANOVA 및 Tukey 분석 결과, 5% 유의수준에서 실험에 사용된 3수준(1.00, 1.25, 1.50 mg/mL)의 항체 농도에 따른 굴절률 변화에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 이후 계속된 센서의 감도분석 실험에서는 항체소요량을 최소로 할 수 있는 1.
- SPR 바이오센서의 검출한계는 살모넬라균을 음의 대조군과 비교하여 통계적으로 유효한 변화가 있는 농도로 결정하였다. ANOVA 분석을 통해 SPR 바이오센서의 살모넬라균 검출한계는 버퍼의 경우 106 CFU/mL로 확인되었다. 105 CFU/mL 이하의 농도에서는 106 CFU/mL의 경우와 통계적 차이(5% 유의도 수준)를 보이지 않았다.
- PBS 버퍼 시료와 비교할 때 우유 매트릭스로 인해 검출감도에 특별히 부정적인 효과는 없지만 감도가 다소 낮아지는 것으로 확인되었다. 우유시료에 대한 검출한계는 Mazumdar 등(2007)의 Plasmonic® SPR 장치(HS System, Plasmonic Biosensoren AG, Germany)를 사용한 연구결과인 5×106 CFU/mL와 유사하게 나타났다.
- 검출결과의 ANOVA 분석을 통해 SPR 바이오센서의 살모넬라균 검출한계는 PBS 버퍼 시료의 경우 106 CFU/mL로 확인되었다. 우유시료의 경우에서도 PBS 버퍼 시료에서와 마찬가지로 105 CFU/mL 이하의 농도에서는 106 CFU/mL의 경우와 통계적 차이(5% 유의도 수준)를 보이지 않았다.
- 가로축은 살모넬라균의 농도를, 세로축은 굴절률 차이 값을 각각 상용대수눈금으로 나타내고 있다. 상용대수값으로 나타낸 살모넬라균의 농도와 상대굴절률과의 선형관계식을 최소자승법으로 구한 결과 기울기와 절편은 각각 0.645와 -8.527로, 결정계수는 0.998로 확인되었다.
- 가로축은 살모넬라균의 농도를, 세로축은 굴절률 차이 값을 각각 로그눈금으로 나타내고 있다. 저지방 우유에 접종된 살모넬라균 농도의 대수값과 상대굴절률과의 대수값 사이에 최소자승법을 이용하여 선형관계식을 구한 결과 기울기와 절편은 각각 0.325와 -5.648로, 결정계수는 0.900으로 확인되었다.
후속연구
- (6) Spreeta® 센서의 소형성, 저렴한 가격으로 현장에서 농식품의 안전관리에 충분히 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
- 우유시료에 대한 검출한계는 Mazumdar 등(2007)의 Plasmonic® SPR 장치(HS System, Plasmonic Biosensoren AG, Germany)를 사용한 연구결과인 5×106 CFU/mL와 유사하게 나타났다. SPR 원리를 바탕으로 한 다른 바이오센서들의 실험결과와 비교할 때 센서의 가격 대비 성능에서 현재로서는 수용 가능한 검출한계로 판단된다.
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