[논문]연교(連翹)의 LPS로 유도된 Raw 264.7 Cell에서의 항염증(抗炎症)효과

곡정강; 정승기; 정희재; 김진주

연교(連翹)의 LPS로 유도된 Raw 264.7 Cell에서의 항염증(抗炎症)효과
Research on Anti-inflammatory Effects of Forsythiae Fructus 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.31 no.2, 2010년, pp.242 - 253

곡정강 (경희대학교 한의과대학 폐계내과학 교실) , 정승기 (경희대학교 한의과대학 폐계내과학 교실) , 정희재 (경희대학교 한의과대학 폐계내과학 교실) , 김진주 (경희대학교 한의과대학 폐계내과학 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to examine the anti-inflammatory effects Forsythiae Fructus on LPS-activated RAW264.7 cells. Methods : Statistical significance was examined through measuring MTT, nitric oxide (NO), TNF $\alpha$, IL 6, NOS2 and COX2 of LPS-activated RAW264.7 cells. Results : In the toxicity experiment of FFE, NO significant toxicity was shown on cells in the concentration ranges of 100, 200 and 300 ${\mu}g/ml$. FFE dose dependently decreases 5.49, 25.41, 33.64 % in LPS induced NO production (p<0.05, p<0.001 and p<0.001), however, FFE don't show significant difference in LPS-induced TNF $\alpha$ and IL 6. Furthermore, FFE showed inhibiting tendency against the revelation of NOS2 and COX2 in LPS-activated RAW264.7 cells, dose-dependently according to concentration. Conclusions : These results mean that FFE is effective for anti-inflammation via inhibition of NOS2 and COX2 expression.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 저자는 連翹의 항염증 작용을 LPS로 활성화된 Raw264.7 cell의 NO분비, IL-6 및 TNF-α 생산, COX2 및 NOS2 발현에 미치는 영향을 통하여 기전을 연구 관찰하였다.
이에 저자는 呼吸器炎症疾患에 빈용되며, 실험적으로 炎症에 유의한 효과가 인정된 連翹의 抗炎症 효과가 어떤 기전에 의한 것인지 연구하기 위하여 본 실험에서 LPS로 활성된 Raw264.7 cell를 이용하여 連翹의 NO분비에 미치는 영향, IL-6 및 TNF-α 생산에 미치는 영향, COX2 및 NOS2 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과를 보고하는 바이다.

제안 방법

100, 200, 300 μg/ml 농도의 連翹가 LPS로 활성된 Raw264.7 cell의 NO분비, IL-6와 TNF-α 생산, COX2 및 NOS2 발현에 미치는 영향을 연구 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
8mA/cm)하여 nitrocellulose membrane으로 이동시키고, blocking buffer(5% skim milk)와 상온에서 1시간 반응시켰다. COX2, NOS2와 GAPDH에 대한 항체는 0.05 %(v/v)의 tween 20이 함유된 TBS-T(tris-bufferd saline)에 1:1000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 4℃에서 overnight하였으며, 2차 항체인 anti-rabbit IgG conjugated horse-radish peroxidase(HRP)를 TBS-T로 희석(1:5000)하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 enhanced chemilluminescence(ECL) kit(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 ECL 필름에 감광, 현상하였다
Fig. 2에 나타낸 것과 같이 連翹를 LPS 1 μg/ml 과 같이 100, 200, 300μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 배양 후에 아무런 처리를 하지 않은 그룹 (control)과 LPS만 처리한 그룹과 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 비교하였다.
세포배양 상층액을 flat bottom 96well plate에 50μl씩 넣고 여기에 Greiss 시약 sulfanilamide solution을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 다시 N-(1-naphtyl) erthylenediamine dihydrochloride (NED) solution을 동량 첨가하여 10분간 반응 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite를 100nM에서부터 1.56nM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 계산하였다.
RAW264.7에 대식세포의 NO 생산을 유도하는 것으로 알려진 LPS를 連翹와 함께 처리하여 24시간 배양한 후, 배양액 중 대식세포가 생산한 NO로부터 산화된 형태인 NO2-농도를 측정하였다. LPS를 단독으로 처리하였을 때의 NO2-농도가 37.
그 다음 0.22µm syringe filter를 이용하여 여과하여 10, 20, 30mg/ml으로 희석하여 냉장 보관하여 사용하였다.
배양 후 MTT 용액 \(5 μg/ml)을 첨가하고 4시간 후 상등액을 제거하고 DMSO (dimethylsulfoxide) 300 또는 100μl를 넣어 보라색의 formazan이 용출되도록 하여 micro plate reader로 565nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
배양한 세포주를 LPS 단독 또는 검액과 같이 배양한 상층액을 24시간 후에 회수하여 ELISA kit로 상층액에 포함된 IL-6와 TNF-α의 양을 측정하였다.
세포독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosman²⁵의 방법을 변형하여 측정하였다. Raw264.
세포배양 상층액을 flat bottom 96well plate에 50μl씩 넣고 여기에 Greiss 시약 sulfanilamide solution을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 다시 N-(1-naphtyl) erthylenediamine dihydrochloride (NED) solution을 동량 첨가하여 10분간 반응 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에 sodium bicarbonate (NaHCO3, 2g/L), 항생제 (100units/ml penicillin, 100mg/ml streptomycin), 10% FBS (fetal bovine serum)를 첨가한 것을 이용하였다.
수거된 상층액의 단백질을 bicinchoninic acid(BCA)법으로 정량하고, 동량의 단백질 (10μg)은 5× sample buffer와 섞어 100℃에서 5분간 끓인 후 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다.
안정된 NO 산화물인 NO₂^- (nitrite)는 Griess reagent system (Promega, USA)반응을 이용하여 측정하였다. 세포배양 상층액을 flat bottom 96well plate에 50μl씩 넣고 여기에 Greiss 시약 sulfanilamide solution을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 다시 N-(1-naphtyl) erthylenediamine dihydrochloride (NED) solution을 동량 첨가하여 10분간 반응 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
즉, 連翹 100, 200 and 300μg/ml와 함께 24시간 배양한 RAW264.7 세포주에서 단백질을 추출하여 COX2과 NOS2의 발현량을 살펴보았다.
連翹에 의한 NO 생산 억제가 직접적으로 대식 세포의 NO 생산을 억제함으로써 일어나는지 또는 NO 생산을 유도하는 다른 물질의 생산을 억제한간접적인 결과인지를 알아보기 위하여 대식세포가 생산하는 대표적인 Cytokine인 IL-6와 TNF-α의 양을 측정하였다.
連翹의 Raw 264.7cell에 대한 세포 독성과 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 連翹를 100, 200, 300μg/ml의 농도로 처리하고 24, 48 그리고 72시간 배양 후에 무처리군을 100%으로 하여 세포생존율을 측정하였다(Fig. 1A, B 그리고 C).
連翹의 Raw264.7 cell 에 미치는 독성의 영향을 알아보기 위해 MTT분석법을 이용하였으며, 100, 200, 300μg/ml 농도의 連翹를 24, 48 그리고 72시간 배양 후에 무처리한 대조군을 100%으로 하여 세포 생존율을 측정하였다.

대상 데이터

DMEM 배지, FBS와 penicillin (10,000U/ml)/streptomycin(10,000U/ml)(P/S)는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)회사 제품을 사용하였으며, LPS(Lipopolysaccharides)는 Difco Laboratories(Detroit, MI, USA)회사 제품을 사용하였다. 그 외 시약인 sodium bicarbonate (NaHCO₃)는 Sigma (MO, USA)회사 제품을 사용하였다.
생쥐 단핵/대식세포 계열의 세포주인 Raw 264.7은 한국세포주은행(서울대학교 의과대학 암연구소)에서 구입하였다. 세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에 sodium bicarbonate (NaHCO₃, 2g/L), 항생제 (100units/ml penicillin, 100mg/ml streptomycin), 10% FBS (fetal bovine serum)를 첨가한 것을 이용하였다.
그 외 시약인 sodium bicarbonate (NaHCO₃)는 Sigma (MO, USA)회사 제품을 사용하였다. 효소중합 연쇄반응에 사용한 Greiss 시약은 Promega (Madison, WI, USA) 회사제품을, IL-6와 TNF 측정에 필요한 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 BD Pharmingen (CA, USA) 회사제품, COX2 (Cyclooxygenase 2), NOS2 (Nitric oxide synthase-2)와 GAPDH같은 antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA) 회사제품을 사용하였다.
連翹(Forsythiae Fructus, FF)의 시료는 Sun Ten Pharmaceutial (Taipei, Taiwan)에서 구입한 후 증류수로 30mg/ml로 녹인 후, 다음 날 3,000rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 그 다음 0.

데이터처리

통계 처리는 Prism 4 software (GraphicPad Software Inc., CA, USA)을 사용하여 post test (Dunnett)을 포함한 one-way ANOVA test로 유의성을 측정하였다. 결과는 mean ± S.

이론/모형

본 실험에서는 COX2 및 NOS2의 세포 내 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot 분석법으로 확인하였다. 連翹는 각 100, 200, 300μg/ml 농도별로 처리한 결과, LPS 만을 처리한 대조군에서는 강하게 COX2 및 NOS2 발현이 유도 되었고, 連翹를 같이 처리한 군에서는 LPS만을 처리하였을 때보다, COX2 및 NOS2 발현이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다.
염증매개물을 생성하는 효소인 COX2와 NO생산 단백질인 NOS2의 세포내 단백질 발현 정도를 western blot 분석법을 이용하여 관찰하였다. 즉, 連翹 100, 200 and 300μg/ml와 함께 24시간 배양한 RAW264.

성능/효과

1. Raw 264.7 cell에 100, 200, 300μg/ml 농도의 連翹를 LPS 1μg/ml과 같이 처리하여 24시간 배양한 결과 세포 성장억제가 보이지 않았다.
2. Raw 264.7 cell을 LPS 1μg/ml로 자극한 후 생산된 NO는 連翹를 100, 200, 300μg/ml의 농도로 처리 하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 (p<0.001) 감소시켰다.
3. Raw 264.7 cell을 LPS 1μg/ml로 자극한 후 생산된 IL-6와 TNF-α는 連翹를 100, 200, 300μg/ml 의 농도로 처리 하였을 때 IL-6와 TNF-α 생산을 감소시키지 않았다.
4. Raw 264.7 cell을 LPS 1μg/ml로 자극한 후 발현된 COX2와 NOS2는 連翹를 100, 200, 300μg/ml 의 농도로 처리 하였을 때 COX2와 NOS2 발현을 농도 의존적으로 억제 하였다.
COX는 arachidonic acid을 prostaglandin으로 전환시키는 데 중요한 역할을 하는 효소로, COX에는 2가지 형태의 동형효소가 존재하는 것이 알려졌고, 각각 발견된 순서에 따라 COX1과 COX2로 명명되었다. COX1은 대부분의 정상 조직에서 발현되어 있으며, 위점막의 보호, 혈액응고작용, 신장 기능조절 등의 관리역할을 하지만, COX2는 매개체에 의해 유도되어 나타나며, 통증, 염증, 발열작용 등에 관여하며, 근래에는 세포의 자연사억제 및 여러 가지 종양의 증식 과정에 관여함이 밝혀졌다⁴⁶.
LPS를 단독으로 처리하였을 때는 IL-6와 TNF-α의 농도가 각 2,500과 17,479ng/ml 정도까지 증가하였으며, 連翹를 같이 처리하였을 때는 IL-6와 TNF-α농도는 LPS 단독 처리군과 비교하여 유의한 감소 효과가 관찰되지 않았다(Fig. 4).
그 결과 24시간 배양 시 連翹 100, 200 그리고 300μ g/ml 농도에서 각각 107.7, 109.1 그리고 110.1%로나타났고, 48시간 배양 시 각각 105.2, 89.69, 60.14% (p < 0.001) 로, 72시간 배양 시 각각 92.60, 84.22, 60.92% (p < 0.001) 가 나타났다.
그 결과 무처리군에서는 COX2과 NOS2가 유도되지 않았고, LPS 1μg/ml 만을 처리한 군에서는 강하게 COX2와 NOS2 발현이 유도되었다.
그 결과, 24시간 배양 시 連翹 100, 200 그리고 300μg/ml 농도에서 각각 107.7, 109.1 그리고 110.1%, 48시간 배양 시 각각 105.2, 89.69 그리고 60.14% (p < 0.001), 72시간 배양 시 각각 92.60, 84.22 그리고 60.92% (p < 0.001) 를 나타내어 連翹 300μg/ml 농도에서 48과 72간 배양 시 무처리군에 비해 유의성 있는 독성을 나타내었다.
그러나, Fig. 1D에서 보는 것과 같이 24시간 배양한 무처리군을 100%으로 보았을 때 24, 48 그리고 72시간 배양 시에 세포 성장을 살펴본 결과, 連翹 300μg/ml 농도에서 48시간과 72시간 배양 시에 나타난 유의한 독성은 Raw 264.7 cell의 성장 억제에 기인한 것으로 보인다.
그리고 連翹를 같이 처리한 군에서는 LPS만을 처리하였을 때보다, COX2 발현이 농도 의존적으로 100, 200, 300μg/ml에서 각각 68.89, 88.89, 91.67% 억제되고 NOS2 발현도 농도 의존적으로 100, 200, 300μg/ml에서 각각 13.64, 27.27, 36.36% 억제되는 것이 관찰되었다(Fig. 5).
단지 TNF-α 분비가 300μg/ml 連翹에서 약간 감소하는 효과를 관찰 할 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 連翹가 LPS로 활성된 Raw264.7 cell에서 NO분비에 미치는 효과, IL-6 및 TNF-α생산에 미치는 효과, COX2 및 NOS2 발현에 미치는 영향을 연구 관찰하여 NO의 생성을 감소시키는 항염증작용은 COX2 및 NOS2 등의 염증 매개물질들을 생성 억제하여 나타난 항염증 작용임을 확인할 수 있었다.
또한 iNOS의 과잉 발현은 만성관절염, 심근염, 사구체염, 인슐린 의존성 당뇨병, 과민성 대장염 등을 초래 한다고 하였고⁴⁷ , 유 등⁴⁸은 連翹 추출물이 COX2, NOS2의 발현을 조절, NO의 생성을 억제함으로써 항염증작용이 있음을 밝혔고, 이 등¹⁴은 連翹가 전립선의 선조직의 보호작용과결합조직의 증식억제 작용을 나타내 TNF-α 및 NOS2의 발현을 억제하여 항염증작용이 있음을 밝혔다. 또한 고용량의 連翹 투여가 간장 및 신장의 독성을 유발하지 않는다는 것도 확인하였다.
무처리군을 100%로 보았을 때, LPS만 처리하였을 경우와 連翹를 LPS 1μg/ml과 같이 100, 200, 300μg/ml의 농도로 처리한 경우 각각 세포 생존율이 100.1, 102.9, 97.93 그리고 102.4%로 나타났다.
본 실험에서는 連翹가 NO 생산 억제효과에 대한 기전을 알아보기 위하여 시행한 TNF-α 및 IL-6 분비 농도 측정에서 LPS를 단독으로 처리하였을 때의 TNF-α 및 IL-6의 농도와 100, 200, 300μ g/ml 連翹를 같이 처리하였을 때의 TNF-α 및 IL-6 농도는 거의 변화가 없었다.
본 실험에서는 連翹의 대식세포주 NO 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해 100, 200, 300μg/ml 連翹를 처리한 결과, LPS를 단독으로 처리하였을 때의 NO2- 농도가 37.84nM 정도까지 증가하였지만, 連翹와 동시에 처리하였을 때는 NO2- 농도가 농도의존적으로 감소하였다.
이러한 결과로 보아 Raw 264.7 cell에서의 連翹에 의한 항염증 효과는 TNF-α 및 IL-6의 억제 보다는 NO 생산을 주로 억제하여 나타나는 것으로 생각된다.
84nM 정도까지 증가하였지만, 連翹와 동시에 처리하였을 때는 NO₂- 농도가 농도의존적으로 감소하였다. 이러한 결과로 보아 連翹는 NO의 생산을 억제함으로써 염증반응에 의한 조직손상을 감소할 수 있을 것으로 생각된다.
즉 100, 200μg/ml 농도 連翹에서는 24, 48 그리고 78시간 모두에서 성장억제가 보이지 않았으나, 300μg/ml 連翹에서는 48과 72간 배양 시에 무처리군에 비해 세포의 성장 억제가 관찰되었다.
즉, 連翹는 100, 200, 300μg/ml의 농도에서 LPS로 유도된 대식세포의 NO생산에 대해 각각 5.49, 25.41, 33.64% 억제 효과가 관찰되었다.
連翹는 각 100, 200, 300μg/ml 농도별로 처리한 결과, LPS 만을 처리한 대조군에서는 강하게 COX2 및 NOS2 발현이 유도 되었고, 連翹를 같이 처리한 군에서는 LPS만을 처리하였을 때보다, COX2 및 NOS2 발현이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다.

후속연구

7 cell에서 NO분비에 미치는 효과, IL-6 및 TNF-α생산에 미치는 효과, COX2 및 NOS2 발현에 미치는 영향을 연구 관찰하여 NO의 생성을 감소시키는 항염증작용은 COX2 및 NOS2 등의 염증 매개물질들을 생성 억제하여 나타난 항염증 작용임을 확인할 수 있었다. 이는 連翹가 염증성 질환에 대해 치료제로 유용하게 쓰여질 수 있음을 시사하였고, 임상의 활용과 항염증작용과 관련된 작용 기전을 확인하기 위하여 보다 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증이란?	염증은 조직손상이나 상해를 입었을 때 표출되는 반응이며 발적, 발열, 종창, 통증을 수반하는 생체 방어작용이다. 염증 반응 매개체로 알려진 cytokine 과 chemokine 중 대표적인 cytokine은 IL-1, IL-6, TNF이고, chemokine은 MCP-1과 M-CSF등이다26.
	만성염증은 어떤 질환의 병인이 되는가?	염증매개물질이 과량 생산되면, 과도한 면역반응을 야기하여 각종 염증성 질환을 유발시키고 악화시키게 된다. 특히 만성염증에서는 NOS, COX와 같은 효소 및 signaling proteins의 상승 조절 작용을 일으켜, NO와 prostaglandins(PG)를 과량 생성하게 되고, 이는 류마티스관절염, 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 대장암과 같은 질환의 병인이 된다27.
	連翹의 藥理作用으로 보고된 것은?	46%나 함유되어 있다. 정유성분은 주로 α, β -pinene, terpinen-4-ol 等의 terpenoids 화합물로 구성되어 있으며, 果皮 중에는 미량의 β-cymene, terpinen-4-ol가 있으며, 藥理作用으로 Lignan계인 pinoresino, matairesinol 등에는 염증발생시 활성이 증가하는 cyclic AMP phosphodiesterase의 저해작 용이 있고, 배당체인 forsythiaside, suspensoside에 황색포도상구균에 대한 항균작용이 있으며, phillyrin 은 혈압강하 작용이 있다고 보고되었다17,32 . 連翹에관한 연구로 김 등12 은 連翹 추출물이 Microglia에서 LPS에 의해 유도되는 염증매개물질 생성 억제 효과에서 NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-β을 효과적 으로 억제 시켰다는 보고를, 김 등13 은 連翹 추출물이 항노화 작용이 있어 주름 개선효과가 있다는 보고를, 이 등14 은 連翹가 만성 비세균성 전립선염에 미치는 영향에서 IL-1B, TNF-α, iNOS의 발현을 억제한다고 보고하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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