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문제 정의
- 그 외에도 free radical은 단백질의 -SH기와 반응하여 효소의 활성을 잃게 하고, DNA, RNA, 효소 및 세포막 등에 손상을 일으켜 세포사를 유발하므로26 H2O2에 대한 산약의 세포 보호 효과 및 세포 분절화 억제를 확인해 보기로 하였다.
- 등에 대한 연구가 보고된 바 있다. 그러나 항종양효과에 중점을 둔 과거 실험과는 달리 본 연구에서는 항산화효과를 보다 중점적으로 실험하기 위하여 대식세포주인 Raw264.7을 대상으로 연구를 시행하기로 하였다. Raw264.
- 본 연구에서는 산약의 항염증 효과를 알아보기 위하여 산약의 Cox-2의 발현 조절능력을 확인하는 실험을 하였다. 우선 산약이 LPS로 유도된 Raw264.
- 이에 저자는 DPPH와 SOD를 이용한 항산화 실험과 murine macrophage인 Raw264.7 세포를 대상으로 산약추출물의 H2O2에 의한 세포 보호 효과 및 DNA 분절 억제 효과, LPS로 유도된 염증에서의 Cox-2 발현 억제 효과 등을 실험하고 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- H2O2의 처리 6시간 경과한 시점과 18시간 경과한 시점에서 Trypan Blue로 염색 후 Hemocytometer로 측정하였다. 전체 세포 중 염색된 세포수를 백분율로 나타내었다.
- 7을 대상으로 연구를 시행하기로 하였다. Raw264.7 세포에 H2O2를 처리하여 세포 보호 효과 및 DNA 분절 억제 효과를 살펴보고, Cox-2의 발현 억제를 살펴보았다.
- 이 때 대조군에는 희석용 buffer를 사용하였다. 그 다음 각 well에 미리 정해놓은 농도의 SOD 효소(enzyme working solution)를 처리하고 37℃에서 20분 동안 방치 후에 450 ㎚의 흡광도에서 염색시약의 정도를 정량적으로 측정하고, 제조사의 실험방법에 따라 SOD 활성 정도를 계산한다.
- 5×10-4 M농도로 메탄올에 용해시킨 DPPH 용액 800 ㎕를 첨가 혼합하여 30분간 실온에서 방치하였다. 그 후 520 ㎚에서 UV-VIS Spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Blank는 DPPH대신 에탄올을 사용하였고, control은 산약추출물 대신 증류수를 사용하였으며, DPPH에 의한 항산화능(%)는 다음과 같다.
- 또한 본 실험에서는 산약의 항산화능을 SOD를 이용하여 측정하였는데, SOD는 과도한 활성산소 로부터 신체를 보호하는 효소 중 하나로 hydrogen ion과 superoxide radical이 H2O2로 전환되는 반응을 촉매한다. 이 때 생성된 H2O2는 catalase, GSH -Px(glutatione peroxidase)에 의해 O2와 H2O로 분해됨으로써 superoxide radical과 H2O2에 의한 조직 손상을 방어한다25(Fig.
- 산약추출물을 다양한 농도로 처리한 배양세포를 수거하여 얼음으로 차갑게 한 PBS로 한번 세척한 후 세포 침전물을 700 ㎕의 lysis buffer(20 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)로 현탁시키고, 얼음에서 45분간 항온 시키면서 가끔씩 침전된 세포를 현탁시켜 세포의 lysis를 용이하게 하였다. 파쇄된 세포를 4℃에서 13,000 × G로 20분간 원심 분리하여 세포질을 회수하였다.
- 약 3시간 정도 배양 해 준 후, 1 mM의 농도로 H2O2를 처리한다. 실험은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군(Normal)과 천연물 시료를 처리하지 않고 H2O2만을 처리한 양성대조군(Control)을 시료군(Treat)과 같이 수행하였다.
- 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 free radical 로서 비교적 안정한 515-520 ㎚에서 최대 흡광도를 가지며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 DPPH radical에 전자를 공여함으로써 free radical이 소멸되고 색깔이 탈색된다. 이러한 성질로 인하여 항산화능 측정에 다용되며13, 본 연구에서도 DPPH를 이용해 산약의 농도별에 따른 소거 효과를 측정하였다(Table 1).
- Xanthine oxidase(XOD)에 의해 생성된 superoxide radical들은 반응액에 포함된 NBT와 반응하여 보라색의 NBT-diformazan을 형성하므로, SOD의 활성이 높을 경우 XOD에 의해 형성된 oxygen radical이 SOD에 의해 제거됨으로서 상대적으로 formazan의 형성이 감소하게 된다. 이에 형성된 formazan을 450 nm에서 흡광도를 측정하여 SOD의 활성을 검증하였다.
- 이 세포질 용액을 phenol/chloroform으로 두 번 extraction하여 단백질을 제거하고 세포질내로 유출된 DNA와 RNA를 sodium acetate/isopropanol로 침전시켰다. 침전된 핵산을 40 ㎕의 TE buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA)로 용해시키고, 200 ㎍/㎖의 농도가 되게 DNase-free RNase를 넣고 37℃에서 1시간 동안 온도를 유지시킨 다음 RNA가 제거된 DNA 용액을 1.5% agarose gel에서 전기영동하고, DNA를 ethidium bromide로 염색한 후 UV light하에서 사진을 찍어 가시화하였다.
대상 데이터
- H2O2에 대한 세포 보호와 DNA 분절 억제 실험 및 Cox-2의 억제실험에 사용한 세포주는 Raw264.7로서 한림대학교에서 분양받아 사용하였다. 분양 즉시, 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone, USA), penicillin(100 units/㎖)(Sigma, USA), streptomycin(100 ㎍/㎖)(Sigma, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Hyclone, USA) 배지로 5% CO2 ,37℃에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 산약은 상지대학교 한의과대학 본초학교실의 검수를 거쳐 사용하였으며, 건조된 산약 100 g을 증류수 1000 ㎖에 넣어 전탕 한 후 동결 건조하여 13.5 g을 얻었다. 실험에 앞서 필요한 농도로 조정하여 사용하였다.
데이터처리
- 기술통계와 Student t-test를 Graphpad Prism(Ver. 5.02, Graphpad. software, USA)로 수행하였으며, 사후검정으로 tukey's multiple comparison을 수행하고, P<0.05인 경우를 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)에 의한 산약추출물의 라디칼 소거능을 Blois법13에 의하여 분석하였다. 산약추출물 200 ㎕에 1.
성능/효과
- 1. DPPH에 의한 산약의 항산화능은 0.1 ㎎/㎖에서 0.0125 ㎎/㎖사이에서 나타났다.
- 18시간 경과 후에는 H2O2를 처리하지 않았을 때 86.6±0.07%였던 것이 H2O2를 처리하면 25.3±3.1%로 감소하였고, 산약을 처리한 경우 30.25±9.26으로 증가하였다(Fig. 2).
- 2. SOD에 의한 산약의 항산화능은 0.025 ㎎/㎖이상에서 나타났다.
- 3. 산약의 H2O2에 대한 세포보호 효과를 확인한 결과 H2O2만을 처리했을 때 보다 山藥을 처리한 경우의 생존율이 증가했다.
- 4. 산약이 LPS로 유도된 Raw264.7세포에서의 Cox-2발현억제를 확인한 결과 산약의 농도가 0.0125㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖로 진해질수록 Cox-2 단백질의 발현을 저해하여 농도 의존적으로 Cox-2의 발현을 억제함을 확인하였다.
- 5. 산약의 H2O2에 대한 DNA분절 실험에서 시간이 지남에 따라 DNA 분절이 억제됨을 확인하였다. 이상으로 산약이 항산화능 및 세포보호 효과를 확인하였으며, 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- LPS로 유도된 Raw264.7세포에서의 Cox-2의 발현을 조절하는지 확인한 결과 농도 의존적으로 발현이 조절됨을 확인하였다(Fig. 4).
- Raw264.7 세포에서 H2O2를 처리 후 산약추출물이 DNA 분절을 억제하는지 여부를 확인 한 결과 H2O2처리 후 6시간째 보다 18시간에서 분절화를 억제하는 것을 확인 하였다(Fig. 3).
- SOD를 이용한 결과에서는 산약의 농도가 1 ㎎/㎖ 일 때 72.95±1.52%로 높은 항산화능을 확인하였다.
- 26%로 증가하여 산약이 세포 보호에 유효한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그리고, DNA 분절실험 결과 산약에서 6시간 노출된 실험군보다 18시간동안 노출된 실험군의 경우에 DNA 분절화가 보다 더 억제된 것이 확인 되었다(Fig. 2, Fig. 3).
- 다양한 농도에서 산약의 항산화능을 DPPH법으로 측정한 결과 1 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖, 0.05 ㎎/㎖, 0.025 ㎎/㎖, 0.0125 ㎎/㎖에서 각각 8.1±0.9, 45.8±0.8, 43.4±0.8, 43.1±1.2, 37.6±0.9(%)로 나타났다(Table 1)
- 반면 1 (㎎/㎖) 일 때는 8.1±0.9(%)로 항산화능이 급격히 저하됨을 확인할 수 있었다.
- 산약의 H2O2에 대한 세포 보호 효과를 확인하였을 때 H2O2만을 처리했을 때 6시간 경과 시 28.9±5.5%, 18시간 경과 시 25.3±3.1%였던 생존률이 산약을 처리한 경우 6시간 경과 시 41.9±4.7%, 18시간 경과 시 30.25±9.26%로 증가하여 산약이 세포 보호에 유효한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 산약의 농도가 낮아짐에 따라 그 효능도 약화되다 0.0125 ㎎/㎖시에는 -39.28±2.40%로 오히려 반작용을 함을 알 수 있었다.
- 산약의 항산화능을 SOD를 이용하여 측정한 결과 산약의 농도 1 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖, 0.05 ㎎/㎖, 0.025㎎/㎖, 0.0125 ㎎/㎖에서 각각 72.95±1.52, 37.16±3.40, 32.29±4.21, 39.68±2.10, -39.28±2.40(%)로 나타났다(Fig. 1).
- 산약이 H2O2에 대한 세포 보호가 있는지 확인한 결과, 6시간 경과에서는 H2O2를 처리하지 않았을 때 82.6±0.7%였던 것이 H2O2를 처리하면 28.9±5.5%로 감소하였고, 산약을 처리한 경우 41.9±4.7로 증가하였다.
- 실험 결과 다양한 농도에서 산약의 항산화능을 DPPH법으로 측정 시 그 소거 효과는 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1, 1 (㎎/㎖)의 농도에서 각각 37.6±0.9, 43.1±1.2, 43.4±0.8, 45.8±0.8, 8.1±0.9(%)로 나타나 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 (㎎/㎖)의 농도에서는 항산화능이농도 의존적인 경향을 나타내었다.
- 40%로 오히려 반작용을 함을 알 수 있었다. 양 실험에서 0.025, 0.05, 0.1(㎎/㎖)의 농도에서 산약 추출물의 농도 증가에 따라 항산화능의 발현이 증가하는 양상을 띄어 산약의 농도에 대한 항산화능 발현 증가가 어느 정도 유의성이 있다 볼 수 있었다. 그러나 1 ㎎/㎖에서는 두 실험에서 항산화능이 상이한 결과가 나타났는데, 이는 두 검사를 비교해 보았을 때 SOD실험에서 나타난 높은 수치가 산약 추출물의 색이 고농도로 인해 과발현되어 실험결과에 영향을 미쳤을 가능성을 무시할 수 없으므로 이에 고농도의 산약에서의 항산화능을 보다 자세히 연구할 필요성이 있다고 사료되었다.
- 본 연구에서는 산약의 항염증 효과를 알아보기 위하여 산약의 Cox-2의 발현 조절능력을 확인하는 실험을 하였다. 우선 산약이 LPS로 유도된 Raw264.7세포에서의 Cox-2 발현 억제를 확인하기 위하여 산약추출물을 1, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎎/㎖의 농도로 Raw 264.7세포에 처리하여 대조군과 비교해본 결과 Cox-2의 경우는 산약의 농도가 0.125 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖로 진해질수록 Cox-2 단백질의 발현을 저해하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 위의 실험들을 통하여 산약의 항산화능 및 항염증효과를 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구는 산약의 고농도에서 급격히 저하되는 항산화능 및 일정 농도 이하에서는 발휘되지 못함 또한 확인하였으나 이에 대한 보다 정밀한 실험은 하지 못하였다.
후속연구
- 1(㎎/㎖)의 농도에서 산약 추출물의 농도 증가에 따라 항산화능의 발현이 증가하는 양상을 띄어 산약의 농도에 대한 항산화능 발현 증가가 어느 정도 유의성이 있다 볼 수 있었다. 그러나 1 ㎎/㎖에서는 두 실험에서 항산화능이 상이한 결과가 나타났는데, 이는 두 검사를 비교해 보았을 때 SOD실험에서 나타난 높은 수치가 산약 추출물의 색이 고농도로 인해 과발현되어 실험결과에 영향을 미쳤을 가능성을 무시할 수 없으므로 이에 고농도의 산약에서의 항산화능을 보다 자세히 연구할 필요성이 있다고 사료되었다.
- 위의 실험들을 통하여 산약의 항산화능 및 항염증효과를 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구는 산약의 고농도에서 급격히 저하되는 항산화능 및 일정 농도 이하에서는 발휘되지 못함 또한 확인하였으나 이에 대한 보다 정밀한 실험은 하지 못하였다. 또한 산약의 항염증 효과를 확인하였으나 이는 Cox-2에 관한 실험으로 차후 염증매개물질들에 대한 연구가 보다 상세히 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 그러나 본 연구는 산약의 고농도에서 급격히 저하되는 항산화능 및 일정 농도 이하에서는 발휘되지 못함 또한 확인하였으나 이에 대한 보다 정밀한 실험은 하지 못하였다. 또한 산약의 항염증 효과를 확인하였으나 이는 Cox-2에 관한 실험으로 차후 염증매개물질들에 대한 연구가 보다 상세히 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 산약의 H2O2에 대한 DNA분절 실험에서 시간이 지남에 따라 DNA 분절이 억제됨을 확인하였다. 이상으로 산약이 항산화능 및 세포보호 효과를 확인하였으며, 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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