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문제 정의
- 따라서 본 연구에서도 우리나라에서 청정지역 중 하나로 알려진 지리산 일대에서 많이 재배되고 있는 참당귀의 이용가치를 향상시킬 목적으로 다량의 탄수화물을 함유[28,35]한 당귀 뿌리를 발효시키기 위하여 3종류의 곰팡이 균주, Aspergillus oryzae, Aspergillus kawachii 및 Monascus purpureus로 발효시킨 발효 당귀의 생리활성 물질 및 그 활성에 대하여 검토하였다.
- 이에 본 연구에서도 참당귀 뿌리에 탄수화물(68.75%)이 많이 함유된 점을 감안하여 당질 분해력이 높은 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주를 접종하여 발효시킴으로서 생리활성 성분 및 효능 역시 증가될 수 있을 가능성에 대하여 검토하였다[26]. 특히 국내에서 자생되고 있는 참당귀의 대표적인 약효 성분인 decursin 및 decursinol angelate는 부위별, 산지별 및 추출 방법에 따라서도 함량이 달라지는 것으로 분석되었으며[13,20,32,33], decursin과 decursinol angelate 분자량이 각각 329 및 351로 확인되었다[20].
제안 방법
- Tyrosinase 활성은 Masamoto 등[23]의 실험 방법에 준하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 저해 활성을 측정하기 위하여 2.5 mM 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)0.3 ml, 발효 당귀 분말의 0.1%(w/v) 시료 용액 0.05 ml에 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)을 혼합하여 25℃에서 preincubation시키고, 여기에 1,380 units/ml mushroom tyrosinase (2,500 unit, Sigma, St. Louis MO, USA) 0.05 ml를 넣은 후 25℃에서 2분간 반응시키면서 spectrophotometer (HITACHI U-2900, Kyoto, Japan)의 475 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성 대조구는 tyrosinase 저해제로 알려진 albutin, ascorbic acid 및 kojic acid를 사용하였다.
- 발효 당귀 분말의 미네랄 함량은 AOAC 분석 방법에 준하여 측정하였다. 각 분말 1 g을 정확히 취해 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산 분해시켜 수욕상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HCl을 가하여 여과한 후 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 메탄올에 녹인 시료는 HPLC-DAD(Agilent 1200, Agilent Techologies, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 Waters symmetry C18 column (4.5×250 mm, 5 μm), 용매 A는 HPLC용 water, 용매 B acetonitrile을 사용하여 gradient 조건으로 분석하였다[2].
- Flavonoid 함량은 Jia 등[15]의 방법에 따라 측정하였다. 발효 당귀 분말의 0.1%(w/v) 시료 용액 0.25 ml에 1.25 ml의 정제수와 5% NaNO2 용액 5 ml을 가하고, 5분 후 10% AlCl3∙6H2O 0.15 ml를 잘 혼합한 후 Spectrophotometer (HITACHIU-2900, Kyoto, Japan)의 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 플라보노이드 함량은 표준 물질로서 (+)-catechin hydrate을 20~200 μg/ml 농도로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 5×250 mm, 5 μm), 용매 A는 HPLC용 water, 용매 B acetonitrile을 사용하여 gradient 조건으로 분석하였다[2]. 분석 조건은 Table 1과 같이 column oven 온도 25℃, 이동상의 속도 1 ml/min, DAD 분석파장은 328 nm로 용매 gradient 조건으로 분석하였다.
- 세 균주의 seed culture는 glucose 10%, peptone 5%, KNO3 2%, NH4H2PO4 2%, MgSO4·7H2O 0.5% 및 CaCl2 0.1% 함유 배지에서 30℃, 150rpm으로 72시간 배양한 후 참당귀 분말에 각각 5% (v/w) 수준으로 첨가하여 30℃에서 12일간 고체배양 시켰다.
- 원료 참당귀 및 발효 참당귀 분말의 20배에 해당하는 메탄올로 2시간씩 5회 환류 추출 한 다음 Sartorius Minisart 0.45 μm filter (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany)로 여과 한 후 진공농축기(Buchi Rotavapor R-215)로 농축하였다.
- 이 때 플라보노이드 함량은 표준 물질로서 (+)-catechin hydrate을 20~200 μg/ml 농도로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 이때 polyphenolic compounds의 함량은 tannic acid를 0-500 μg/ml 농도로 하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 05 ml를 넣은 후 상온에서 30분간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 환원력 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 천연 항산화 ascorbic acid와 합성 항산화제 BHT를 각각 시료와 동일 농도로 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시료 반응액에서 흡광도가 증가된 만큼 강한 환원력을 나타내어 준다.
- 05% (w/v) 시료 용액 1 ml을 취하고, 여기에 DPPH반응 용액 5 ml을 넣어 잘 혼합한 후 암소에서 30분간 반응시킨 후 Spectrophotometer (HITACHI U-2900, Kyoto, Japan)의 528 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 합성 항산화제 BHT를 0.05% 농도로 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. DPPH를 이용한 항산화 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율(%)로 표시하였다.
대상 데이터
- 05 ml를 넣은 후 25℃에서 2분간 반응시키면서 spectrophotometer (HITACHI U-2900, Kyoto, Japan)의 475 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성 대조구는 tyrosinase 저해제로 알려진 albutin, ascorbic acid 및 kojic acid를 사용하였다. 이때 tyrosinase 활성 저해율(%)은 다음의 공식에 의하여 산출하였다.
- 본 실험에 사용한 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 2009년 9월에 경상남도 산청군 지리산 일대에서 재배되고 있는 것을 농가로부터 직접 구입하여 뿌리를 깨끗하게 물로 씻은 후 흙과 이물질을 제거하고 건조시켜 분쇄 후 시료로 사용하였다. 참당귀 분말 시료에 3종류의 곰팡이 균주 Aspergillus oryzae KCCM 11372, Aspergillus kawachii KCCM 32819 및 Monascus purpureus KCCM 12002를 한국미생물보존센터로부터 분양받아 참당귀 발효에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 2009년 9월에 경상남도 산청군 지리산 일대에서 재배되고 있는 것을 농가로부터 직접 구입하여 뿌리를 깨끗하게 물로 씻은 후 흙과 이물질을 제거하고 건조시켜 분쇄 후 시료로 사용하였다. 참당귀 분말 시료에 3종류의 곰팡이 균주 Aspergillus oryzae KCCM 11372, Aspergillus kawachii KCCM 32819 및 Monascus purpureus KCCM 12002를 한국미생물보존센터로부터 분양받아 참당귀 발효에 사용하였다. 세 균주의 seed culture는 glucose 10%, peptone 5%, KNO3 2%, NH4H2PO4 2%, MgSO4·7H2O 0.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean±SE)로 표시하였다[10].
이론/모형
- Fe-환원력 측정은 Zhu 등[41]의 방법에 따라 측정하였다. 발효 당귀분말의 0.
- Flavonoid 함량은 Jia 등[15]의 방법에 따라 측정하였다. 발효 당귀 분말의 0.
- Polyphenolic compounds의 함량은 Folin-Denis법[36]으로 측정하였다. 발효 당귀 분말의 0.
- Tyrosinase 활성은 Masamoto 등[23]의 실험 방법에 준하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 저해 활성을 측정하기 위하여 2.
- 발효 당귀 분말의 미네랄 함량은 AOAC 분석 방법에 준하여 측정하였다. 각 분말 1 g을 정확히 취해 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산 분해시켜 수욕상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HCl을 가하여 여과한 후 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 항산화 활성 측정은 Abe 등[1]의 방법에 따라 측정하였다. DPPH (α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 16 mg을 에탄올 100 ml에 녹인 후 동량의 증류수를 혼합하여 Whatman filter paper NO.
성능/효과
- 국내산 참당귀 뿌리의 미네랄 성분 조성 비율을 보면 K가 가장 많이 함유되어 있었고, 그 다음으로 Mg, Fe, Ca, Na, Mn, Zn 순으로 함유되어 있었다(Table 4). 국내산 참당귀 뿌리를 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효당귀에서는 Na을 제외하고 모두 증가한 것으로 나타났다(Table 4). 국내산 참당귀, 일본산 당귀, 중국산 당귀의 미네랄 분석결과에서도 모두 K가 각각 329, 283, 223 ppm으로 가장 많이 함유되어 있었고, 그 다음으로 Mg, Fe, Na 순으로 함유되어 본 실험 결과와 일치하였다[22].
- 국내산 참당귀 뿌리의 미네랄 성분 조성 비율을 보면 K가 가장 많이 함유되어 있었고, 그 다음으로 Mg, Fe, Ca, Na, Mn, Zn 순으로 함유되어 있었다(Table 4). 국내산 참당귀 뿌리를 A.
- 1% 처리 농도에서 tyrosinase 저해 활성이 각각 76, 73 및 77%로 Kim 등[17]이 동일 농도로 처리한 ascorbic acid에 의해 71%의 저해 활성 결과와 비슷한 수준을 나타내었다. 그러나 당귀 뿌리 추출물의 tyrosinase 저해 활성은 18%로 상당히 낮았으나, A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효 당귀에서는 각각 34, 37 및 45%로 2배 이상 증가한 것으로 나타났다(Table 7). Kim 등[17]도 초고압으로 추출한 당귀 추출물 1 mg/ml 농도에서 69.
- 9%로 당귀의 항산화 활성은 본 실험 결과와 비슷하였다[9]. 그러나 참당귀 뿌리를 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효당귀에서는 항산화 활성이 각각 46, 49 및 56%로 모두 2배 이상 증가한 것으로 나타났다(Table 5). 이러한 DPPH 전자공여능에 의한 항산화 활성이 누에 분말에 비해 A.
- 485의 흡광도를 나타내어 가장 높았다(Table 6). 당귀 뿌리 0.05% 처리농도의 Fe-환원력은 0.066에 비해 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효 당귀에서는 각각 0.036, 0.051 및 0.036으로 발효에 의해 다소 낮아지는 경향을 보였다(Table 6). 또한 Cu-환원력은 대조구로 사용한 BHT 및 ascorbic acid 0.
- 036으로 발효에 의해 다소 낮아지는 경향을 보였다(Table 6). 또한 Cu-환원력은 대조구로 사용한 BHT 및 ascorbic acid 0.05%의 농도 처리에서 1.436 및 1.749의 흡광도를 나타내어 가장 높았으며, A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효 당귀에서는 각각 0.061, 0.084 및 0.065로 발효에 의해 Fe-환원력과 마찬가지로 낮아지는 경향을 보였다. 한방 생약재인 원료 복령 및 후박추출물의 환원력은 각각 0.
- 본 실험에서 사용한 참당귀 뿌리의 polyphenolic compounds 함량은 2.78% 였으나, A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효당귀에서는 각각 2.36, 2.42 및 2.32%로 나타나, 발효에 의해 약간씩 낮아진 결과를 얻었다(Table 3). 국내산 식용식물 자원 중 뿌리 부분의 페놀성 화합물 함량을 분석한 결과 쇠무릎 1.
- 본 실험에서 양성 대조군으로 사용한 시판 합성 항산화제인 BHT 0.05% 처리 농도에서는 92%로 DPPH 전자공여능에 의한 항산화 활성이 높았으나, 동일 농도의 참당귀 뿌리의 항산화 활성은 19%로 상당히 낮은 것으로 나타났다(Table 5). 약용식물의 수용성 추출물 0.
- 특히 국내에서 자생되고 있는 참당귀의 대표적인 약효 성분인 decursin 및 decursinol angelate는 부위별, 산지별 및 추출 방법에 따라서도 함량이 달라지는 것으로 분석되었으며[13,20,32,33], decursin과 decursinol angelate 분자량이 각각 329 및 351로 확인되었다[20]. 본 실험에서 참당귀뿌리의 decursin과 decursinol angelate를 분석한 결과 총 면적에 대한 이들의 함량 비율은 각각 44.0 및 27.3%로서 뿌리에 decursin이 많이 함유되어 있다고 하는 다른 연구자들의 결과와 일치하였다[20,33]. 한편 A.
- 66%가 함유되어 있다고 보고하였다[9,11]. 본 연구 결과에서는 당귀 뿌리에 flavonoid가 1.03% 함유되었으나, A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효당귀에서는 각각 0.90, 1.04 및 1.18% 함유되어 있었다(Table 3). 다른 연구자들은 당귀 뿌리의 flavonoid 함량이 수용성 추출물 중에는 0.
- 53% 함유되어 있었다고 하였다[26]. 본 연구자들도 한방 생약재 중에 들어있는 폴리페놀 화합물 함량의 변화를 관찰하기 위하여 버섯 균사체로 40종의 한방 생약재의 열수 추출물을 발효시킨 결과 14종에서만 증가하였고, 나머지 26종에서는 감소한 것으로 나타났는데, 당귀의 경우도 발효에 의해 낮은 농도를 나타내어 발효에 의해 대부분 페놀성 화합물 함량이 낮아지는 것으로 사료되어진다[8]. 이러한 이유는 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있는 식물체 추출물 사용에 의한 세포독성 작용이 추출물의 발효에 의해 독성 작용이 경감되는 것과 무관하지 않을 것으로 추측되어진다[30].
- 3%로서 뿌리에 decursin이 많이 함유되어 있다고 하는 다른 연구자들의 결과와 일치하였다[20,33]. 한편 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 당귀에서는 decursin 함량비율이 각각 52.0, 54.4 및 53.7%로 모두 발효에 의해 증가되었으나, decursinol angelate 함량비율은 각각 27.9, 27.5 및 28.2%로 decursin과는 달리 발효에 의한 변화는 없었다(Table 2). 당귀의 주요 약리적 성분인 decursin이 미생물 발효에 의해 증가된 것은 발효 과정 중에 다른 물질로부터 전환되었을 가능성과 효소적 작용으로 성분 상호간의 결합이 분해되면서 용출이 용이해져 함량이 증가되었을 가능성이 있지만 정확한 기작에 대해서는 좀 더 심도 있는 검토가 있어야 할 것으로 사료되어진다.
후속연구
- 2%로 decursin과는 달리 발효에 의한 변화는 없었다(Table 2). 당귀의 주요 약리적 성분인 decursin이 미생물 발효에 의해 증가된 것은 발효 과정 중에 다른 물질로부터 전환되었을 가능성과 효소적 작용으로 성분 상호간의 결합이 분해되면서 용출이 용이해져 함량이 증가되었을 가능성이 있지만 정확한 기작에 대해서는 좀 더 심도 있는 검토가 있어야 할 것으로 사료되어진다.
- 또한 Ahn 등[3]은 라벤더 추출물의 ethyl acetate 분획과 자연 미생물 발효 추출물의 ethyl acetate 분획에서 tyrosinase 활성 저해 효과(IC50)는 각각 145 및 122 μg/ml로 발효에 의해서 활성이 높았다고 하였고, Yang 등[39]도 레몬밤 추출물과 발효 추출물의 경우 tyrosinase 저해 활성(IC50)이 각각 365 및 122 μg/ml으로 역시 발효에 의해 활성 저해작용이 높아졌다고 하였다. 따라서 한방 생약재 유래의 미백 기능성 화장품 개발을 위해서는 추출물 사용보다는 미생물 또는 균사체로 발효시켜 사용함으로서 세포 독성 경감, tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 생합성 억제 작용과 같은 효과를 기대 할 수 있을 것으로 사료 되어진다.
- 이상과 같이 당귀에 함유된 K, Mg, Ca, Fe 등은 인체에 중요한 필수 미네랄 성분으로 영양적인 측면에서도 매우 중요하며, 또한 당귀는 생리불순, 무월경, 빈혈치료 등의 여성 혈관계질환에도 널리 사용됨으로서 여성들에게 유효한 약재로 인식되고 있어, 이를 이용한 여성용 건강지향 제품개발 소재로 활용한다면 그 효용가치가 높아질 것으로 사료된다.
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