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문제 정의
- 이 시도한 Eosin 검색법을 이용하였다. 이는 MTT 검색법을 응용하여 세포질의 염기성 물질과 반응한 Eosin을 1% acid alcohol로 탈색시킨 용액의 흡광도를 530 nm에서 측정해서 그 농도를 구해 간접적으로 치주인대세포의 양을 알아보는 것이다. 이렇게 구한 MTT 환원 흡광도를 Eosin 흡광도로 나누어 표준화하면 치주조직의 양이 다른 제1, 2대구치를 치주인대 단위면적으로 환산해 서로간 상호 비교가 가능하다고 하였다.
- 이번 연구의 목적은 흰 쥐의 상악 대구치를 발거한 후 치주인대세포를 0℃/2 MPa의 압력하에 1주간 보관한 치주인대세포의 활성도를 저속 냉동법(No Additional Pressure, 2 MPa, 3 MPa), 급속 냉동법(No Additional Pressure, 2 MPa), 초고압 저온 보존법(-5℃/90 MPa)과 비교, 평가하여 치주 인대세포를 장기간 보존할 수 있는 치아 은행의 최적의 조건을 찾는 것이다.
- 아직까지 치주인대세포의 보존에 대한 정확한 온도와 압력에 대한 최적의 방법이 개발되지 못한 실정이다. 이에 온도와 압력의 여러 조건하에 최적의 여건을 찾고자 본 연구가 진행되었다.
가설 설정
- 10) 정상적인 온도 보다 낮은 온도에서 세포에 부정적인 면은 지방의 상변이를 일으킨다는 데에 있다. 지방은 세포의 모든 막구조에 영향을 미치며 특히 세포막에 그러하다.
- -5℃ 에서 -15℃ 사이에서는 세포 외부의 보존액에 얼음이 형성되기 시작하나 세포막이 얼음 성장을 막기 때문에 세포 자체는 얼지 않고 과냉각(super-cooling)된다.25) 세포내의 과냉각된 수분은 세포 외부의 일부 동결된 보존액보다 화학적 반응성(chemical potential)이 높아 삼투압 차이로 수분이 세포 밖으로 빠져나가 세포 외부에서 얼게 된다. 이후의 물리학적인 변화는 냉동 속도에 의하여 결정된다.
제안 방법
- 2 ml 냉동튜브 속의 보관용액이 완전히 액체 상태로 되었을 때 수욕조에서 꺼내 치아를 7.5%, 5%, 2.5%, 0% DMSO가 첨가된 용액에 5분씩 순차적으로 담궈 DMSO를 제거한 후 MTT 검색, WST-1 검색에 사용하였다.
- 대표적인 동해방지제로서 DMSO가 널리 사용되며 Schwartz와 Andreasen1,2)은 속도조절기로 저속 냉동을 했을 때 10% DMSO를 사용한 경우 정상 치근단막 생성이 제일 좋았다고 하였고 Kim 등36)도 급속 냉동시 10% DMSO를 사용했을 때 치주인대 활성도가 제일 높았다고 보고하였으므로 본 실험에서는 동해방지제로 10% DMSO를 선택하여 실험하였다.
- -35℃ 이하 온도에서는 세포 내부에 얼음결정이 생기지 않고,34) 세포 외부의 냉동환경에 반응해서 세포가 수축하기 때문에 -196℃까지 빠르게 냉동할 수 있다고34,35) 보고되고 있으므로 -35℃ 이하부터 -196℃ 까지는 액체 질소통을 사용하여 급속 냉동을 시행하였다. 또, Gao와 Crister25)는 급속 해동을 하면 재결정화 현상을 막을 수 있으므로 많은 세포를 살릴 수 있다고 보고하여 본 실험에서는 급속 해동을 시행하였다.
- 마취는 tiletamine (Zoletil50, Virbac, Carros, France) 1 cc를 이용하여 피하 주사하였다. 마취가 유도된 후 날카로운 탐침으로 peritomy를 시행한 후 조직 겸자를 이용하여 치관을 잡고 최소한의 외상을 가하면서 접근이 가장 용이한 좌우측 상악 제1, 2대구치를 모두 발거하였다. 이때 발치와 주변의 출혈은 면봉으로 조절하고 발치 후에는 치근의 파절 여부를 현미경을 사용하여 확인하였다.
- 발거된 치아를 PBS에 세척하고 4℃에서 보관한 Fmedium에 2.5%, 5%, 7.5% DMSO를 첨가한 용액에 5분간씩 단계적으로 담근 뒤 2 ml 냉동튜브에 F medium과 10% DMSO 혼합용액 1 ml와 함께 넣고 5분 후 -196℃ 액화질소 냉동고에 넣어 냉동시켜 일주일간 보관하였다.
- 발거된 치아를 PBS에 세척하고 4℃에서 보관한 Fmedium에 2.5%, 5%, 7.5% DMSO를 첨가한 용액에 5분간씩 단계적으로 담근 뒤 2 ml 냉동튜브에 F medium과 10% DMSO 혼합용액 2 ml를 넣고 뚜껑 부위를 완전히 잠근후 다시 반대 방향으로 반바퀴 회전시켜 압력이 통할 수 있도록 하였다. 5분 기다리는 동안 압력통(Geumsung Science, Seoul, Korea) 안에 냉동튜브를 4개 넣고 스패너로 잠근 뒤 속도조절 냉동기(Low Temp Freezer Drying Chamber KS5045, Geumsung Science, Seoul, Korea)에 넣고 압력통에 압력을 3 MPa로 가한 상태로 4℃에서 -35℃까지 -0.
- 발거된 치아를 PBS에 세척하고 비닐 팩에 4℃에서 보관한 F-medium에 DMSO없이 담근 뒤, 비닐팩의 개봉 부위를 열을 가하여 이중으로 압접한 후 초고압장치(DPSHPL-01L-100, Dima Puretech, Incheon, Korea) 용기통 안에 넣고 온도는 -5℃, 압력은 90 MPa로 설정한 후 일주일간 보관하였다.
- 하지만, 통계적 유의차는 보이지 않았다. 본 실험의 예비 실험에서도 0℃ 저온 압력 보존시 2 Mpa 군이 3 MPa보다 더 높은 활성도를 나타내어 급속 냉동군과 저속 냉동군, 저온 보존군의 실험시 2 MPa의 동일한 압력 조건으로 실험하였다.
- 본 연구는 흰쥐 상악 대구치를 발거 후 고압-저온 보관하에 치아냉동 시 치주인대세포의 활성도를 MTT 검색법, WST-1 검색법을 이용해 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험에 사용된 치아의 치근면에 붙어있는 치주조직의 양을 정량적으로 측정하기 위해 MTT 검색법과 WST-1 검색법 실험 후 각 군의 well에서 제거된 치아를 각 군별로 96-well plate에 넣고 Eosin (Accustain, sigma-aldrich chemie, Gmbh, Germany) 350 μl를 첨가하여 12시간 정도 염색을 한 후 치아를 제거하고 다른 well에 넣어 1% acid alcohol (70% ethyl alcohol, 1% HCL) 350 μl에 30분간 담가두어 치근면에 염색된 치주조직을 탈색시켰다.
- 마취가 유도된 후 날카로운 탐침으로 peritomy를 시행한 후 조직 겸자를 이용하여 치관을 잡고 최소한의 외상을 가하면서 접근이 가장 용이한 좌우측 상악 제1, 2대구치를 모두 발거하였다. 이때 발치와 주변의 출혈은 면봉으로 조절하고 발치 후에는 치근의 파절 여부를 현미경을 사용하여 확인하였다.
- -5℃/90 MPa 초고압 저온 보존군은은 MTT검색법과 WST-1 검색법 모두에서 가장 낮은 세포 활성도를 나타내었다. 초고압 저온 보존군은 높은 압력에 의해 얼지 않는 과 냉각(supercooling) 상태가 되기 때문에 불필요한 동해 방지제에 의한 화학적 독성을 막기 위하여 DMSO를 사용하지 않고 F-media만 사용하였다. 이 번 실험을 위해 제작된 초고압장치(DP-SHPL-01L-100, Dima Puretech, Incheon, Korea)는 압력을 풀 때 속도를 조절할 수 없다는 약점이 있다.
대상 데이터
- 냉동시 세포질내 동해방지제로는 10% dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- 대조군으로는 즉시 발치군을 사용하였다. 각 군 당 4마리의 쥐에서 12개의 치아를 발거하여 MTT 검색법과 WST-1 검색법에 사용하였다.
- 생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 72마리를 사용하였다. 마취는 tiletamine (Zoletil50, Virbac, Carros, France) 1 cc를 이용하여 피하 주사하였다. 마취가 유도된 후 날카로운 탐침으로 peritomy를 시행한 후 조직 겸자를 이용하여 치관을 잡고 최소한의 외상을 가하면서 접근이 가장 용이한 좌우측 상악 제1, 2대구치를 모두 발거하였다.
- 생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 72마리를 사용하였다. 마취는 tiletamine (Zoletil50, Virbac, Carros, France) 1 cc를 이용하여 피하 주사하였다.
- 실험에 사용한 보관 용액인 F medium은 Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, NY, USA)과 Ham's nutrient mixtures F12 (Gibco-BRL, NY, USA)를 3 : 1의 비로 섞고 10% fetal bovine serum (FBS)와 항생제 penicillin (100 units/μl), streptomycin (100 μl/ml), fungizone (0.3 μg/ml)을 첨가하여 제조하였다.
데이터처리
- 대조군과 각 실험군에서 MTT 검색법, WST-1 검색법에서 얻은 흡광도와 이를 Eosin 염색에서 얻은 흡광도로 나눈 수치의 차이를 SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA)을 이용한 ANOVA를 사용하여 분석하였으며 사후검정으로는 Tukey HSD 의 방법을 썼다.
이론/모형
- 대조군으로는 즉시 발치군을 사용하였다. 각 군 당 4마리의 쥐에서 12개의 치아를 발거하여 MTT 검색법과 WST-1 검색법에 사용하였다.
- 본 실험에서는 쥐의 구강 내에서 발수하는 것이 불가능하고 발거 후에 발수를 하는 경우 치근의 손상이 우려되고 시간을 일정하게 조절할 수 없어 변수로 작용할 수 있으므로 발수하지 않고 그대로 MTT 검색법과 WST-1 검색법에 사용하였다.
- 이렇게 발거된 상악 제1대구치와 제2대구치를 직접 MTT 검색법과 WST-1 검색법에 이용할 경우 치아의 치근면에 붙어있는 치주조직의 양이 일정치 않고 같은 치아 부위라 할지라도 치근의 길이와 지름에 있어 제각기 다 다르므로 치주인대세포 활성도를 비교하기 위해 Kim 등36)이 시도한 Eosin 검색법을 이용하였다. 이는 MTT 검색법을 응용하여 세포질의 염기성 물질과 반응한 Eosin을 1% acid alcohol로 탈색시킨 용액의 흡광도를 530 nm에서 측정해서 그 농도를 구해 간접적으로 치주인대세포의 양을 알아보는 것이다.
성능/효과
- -5℃/90 MPa 초고압 저온 보존군은은 MTT검색법과 WST-1 검색법 모두에서 가장 낮은 세포 활성도를 나타내었다. 초고압 저온 보존군은 높은 압력에 의해 얼지 않는 과 냉각(supercooling) 상태가 되기 때문에 불필요한 동해 방지제에 의한 화학적 독성을 막기 위하여 DMSO를 사용하지 않고 F-media만 사용하였다.
- 1. MTT 검색법 및 WST-1검색법 결과 0℃/2 MPa 고압 저온 보존군이 즉시 발치군보다 세포 활성도가 낮았으나 통계적 유의차는 없었으며, 저속 압력 냉동군(NAP, 2 MPa, 3 MPa)과, 급속 압력 냉동군(NAP, 2 MPa), 저온보존군 (0℃/NAP) , 초고압 저온 보존군(-5℃/9 MPa)보다 통계적으로 유의차 있게 높은 세포 활성도를 나타내었다(p < 0.05).
- 2. MTT검색법 및 WST-1 검색법 결과 -5℃/90 MPa 초고압 저온 보존군이 가장 낮은 세포 활성도를 나타내었으며, MTT 검색법 결과에서는 모든 군에 대해 통계적으로 유의성 있는 결과를 보였다(p < 0.05).
- 3. MTT검색법 및 WST-1 검색법 결과, 2 MPa 저속 압력 냉동군은 3 MPa 저속 압력 냉동군보다 높은 활성도를 나타내었으나, 통계적 유의차는 없었다.
- 4. MTT검색법 및 WST-1 검색법 결과, 저속 냉동군과 저온 보존군에서 2 MPa의 압력을 가한 군이 압력을 가하지 않은 군(NAP)에 비해 통계적으로 유의성 있게 높은 세포활성도를 나타내었다(p < 0.05).
- Pribenszky 등21)은 성숙한 돼지의 난모세포를 이용한 실험에서 치사량 이하의 압력은 shock-protein을 활성화 시켜 저항력을 높여주고, 발생능력을 높여 준다고 하였다. 가장 좋은 결과는 30분간 20 MPa의 압력하에 있는 것이 가장 좋은 결과를 보였다. 그러나 40 MPa 이 한계 압력으로 그 압력이상으로는 배반포(blastocyst)를 만들어 내지 못했다고 했다.
- 그리고, 저속 냉동군, 급속 냉동군, 0℃ 저온 보존군에서 모두 압력을 가한 군이 압력을 가하지 않은 군에 비해 높은 세포 활성도를 나타내었다. 또, 2 MPa 저속 압력 냉동군(Group 3)은 3 MPa 저속 압력 냉동군(Group 2)보다 높은 세포 활성도를 나타내었으나, 통계적 유의차는 보이지 않았다.
- 본 실험에서는 0℃/2 MPa 고압 저온 보존군(Group 7)이 MTT 및 WST-1검색법 모두에서 양성 대조군인 즉시발치군(Group 1)과 비슷한 결과를 나타냈고, 두 군간의 통계적 유의차는 존재하지 않았다.
- 본 실험에서도 MTT에 비해 WST-1은 환경의 영향을 더더욱 많이 받고, 술자의 숙련도에 따라 그 편차가 있을 수 있음을 보였다. 세포가 아닌 치주인대조직에 대한 평가의 적절성에 대한 연구가 더 필요하리라 생각된다.
- 본 실험에서도 각 군에서 2 MPa의 압력을 준 군이 압력을 가하지 않은 군에 비해 높은 세포활성도를 보였으며, 급속 냉동군을 제외한 저속 냉동군과 저온 보존군에서는 통계적 유의차를 보였다(p < 0.05).
- 본 연구에서는 쥐 치주인대세포의 1주간 보관에 있어 온도와 압력간 최적의 조건을 찾고자 하였으며, MTT검색법과 WST-1검색법 모두에서 0℃/2 MPa의 고압 저온 보존한 군이 급속냉동군, 저속 냉동군, 초고압-저온 보관군보다 통계적으로 유의성 있게 높은 활성도를 나타내었다(p <0.05).
- 본 연구에서도 2 MPa 저속 압력 냉동군(Group 3)이 3 MPa 저속 압력 냉동군(group 2)에 비해 두 검사법 모두에서 더 높은 세포 활성도를 나타내었다. 하지만, 통계적 유의차는 보이지 않았다.
- 위의 결과를 통해, 0℃/2 MPa (20기압)의 고압-저온 보존법이 다른 급속 냉동 보관법(2 MPa, NAP)이나 저속냉동보관법(2, 3 MPa, NAP), -5℃/90 MPa 초고압 저온 보존법에 비해 우수한 쥐 치아의 치주인대세포의 활성도를 보여 차후 치아의 재이식시 치아보관을 위한 방법으로의 가능성을 제시하였다.
- 치근면의 면적으로 나누어진 값인 WST-1/Eosin 비율은 MTT검색법 결과와 마찬가지로, 즉시 발치군이 가장 높은 세포활성도 값을 나타내었으며, 0℃/2 MPa 고압 저온 보존군은 다른 모든 군보다 통계적으로 유의성 있는(p <0.05) 차이를 보이며 높은 세포 활성도를 나타내었다.
후속연구
- 그러나, 2 MPa의 압력이 3 MPa의 압력보다 더 높은 활성도를 나타내는 것의 정확한 기전은 더욱 연구가 필요한 부분이다.
- 그러나, 이것은 1주 보관의 결과로, 그 이상의 기간에서 더 발전된 연구가 진행되어야 하리라 생각된다. 또한 쥐 치주인대세포가 견딜수 있는 한계 압력을 찾아 내는 것도 매우 의미있는 일이라 할 수 있을 것이다.
- 본 실험에서도 MTT에 비해 WST-1은 환경의 영향을 더더욱 많이 받고, 술자의 숙련도에 따라 그 편차가 있을 수 있음을 보였다. 세포가 아닌 치주인대조직에 대한 평가의 적절성에 대한 연구가 더 필요하리라 생각된다. 또한, MTT와 WST-1의 비용 면에서 WST-1보다 MTT가 상대적으로 저렴하여 쉽게 이용할 수 있다는 장점도 있다.
- 이번 실험의 90 MPa의 압력은 쥐 치주인대세포의 한계 압력을 넘는 압력이었을 가능성도 있을 것이다. 앞으로 쥐 치주인대세포의 압력에 따른 세포의 활성도 평가를 통하여 한계압력에 대한 연구가 더 필요하리라 생각된다.
- 이러한 치주인대세포의 건강성과 활성도를 유지할 수 있는 이상적인 보존방법을 찾는다면, 교정 치료 중 발거된 치아를 미래의 자신의 치아 결손부위에 이식하고자 예비로 보관할 수 있을 것이며, 외상이나 수여부 발치와의 감염으로 인하여 바로 재식할 수 없는 경우에도 치아를 장기보관 하였다가 다시 사용할 수 있을 것이다.8,9) 즉, 장기간 보관된 자신 또는 타인의 치아를 이용하여 상실된 치아를 대신할 수 있는 치아은행도 만들 수 있게 될 것이다.
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