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문제 정의
- 저자들도 이전에 진행성 자궁내막증 여성의 월경혈에서 채취한 자궁내막세포 중에 3 μm 미만의 극소형 추정줄기세포 (very small putative stem cell)가 다수 발견된다고 처음 보고한 바 있는데,16 이번 연구에서는 극소형 추정줄기세포가 정상 여성의 자궁내막조직에서도 존재하는지 조사하고, 이 세포가 줄기세포의 특성 및 줄기세포 표지자를 발현시키는지 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 2% BSA에 20 μg/mL 농도로 희석된 일차항체 rabbit polyclonal-Oct4 (ab18976, abcam, Cambridge, UK)와 1/300로 희석시킨 goat polyclonal-CXCR4 (ab1671, abcam)를 처리하여 4℃에서 overnight한 뒤 PBS로 10분씩 3회 세척하였다.
- 먼저 45° 각도로 기울인 cornical tube에 100%, 75%, 50% percoll을 각각 섞이지 않도록 0.5 mL씩 순서대로 담은 후에 자궁내막세포를 마지막으로 가장 위에 흘려 올려놓았으며, 이후 1,450 rpm에서 20분간 원심분리를 시행한 후 가장 아래에 위치한 극소형 추정줄기세포들을 따로 회수하였다.
- 이번 연구에서는 극소형 추정줄기세포가 정상 여성의 자궁내막조직에서도 존재하는지 조사하고, 이 세포가 줄기세포의 특성 및 줄기세포 표지자를 발현시키는지 확인하고자 하였다. 먼저 자궁내막조직검사에서 채취한 인간 자궁내막세포를 배양한 후, 극소형 추정줄기세포를 다시 분리 및 배양하여 줄기세포 고유의 특성을 나타내는지 관찰하였으며, 추가적으로 세포의 배양 과정 중 줄기세포의 특징적인 소견들이 관찰될 때 줄기세포의 표지자로 알려진 alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4 면역화학염색을 이용하여 줄기세포 여부를 재확인하였다.
- 배양 과정 중 줄기세포의 특징적인 소견을 나타내는 세포들이 관찰될 때, alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4 염색을 시행하여 줄기세포 표지자 발현 여부를 확인하였다.
- 48시간 배양 이후 적혈구 등의 부유물을 제거하기 위해 phospate buffered solution (PBS) 용액으로 3회 수세한 뒤 다시 10% FBS가 첨가된 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. 배양액은 1주일에 2회 간격으로 교체하였으며, 배양접시의 70~80% 가량 세포가 배양된 후에는 0.05% trypsin-EDTA (Invitrogen-Gibco) 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포의 일부는 10% FBS가 첨가된 DMEM/F-12 배지에서 다시 지속적으로 배양하면서 세포의 증식 양상을 관찰하였으며, 나머지 세포들은 percoll density gradient method 방법을 이용하여 극소형 추정줄기세포를 분리하였다.
- 2% BSA에 20 μg/mL 농도로 희석된 일차항체 rabbit polyclonal-Oct4 (ab18976, abcam, Cambridge, UK)와 1/300로 희석시킨 goat polyclonal-CXCR4 (ab1671, abcam)를 처리하여 4℃에서 overnight한 뒤 PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 이차항체 anti rabbit IgG-FITC (sc-2365, Santa cruz, CA, USA)와 anti goat IgG-TRITC (sc-2094, Santa cruz)를 1/200로 희석하여 45분간 반응시키고 10분씩 3번 세척한 후 형광현미경 (Axioskop2 plus, ZEISS, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다.10
- 이후 알칼라인 염색 혼합액 (sodium nitrate solution 1 mL + FRV-alkaline solution 1 mL + deionized water 45 mL)에 슬라이드를 넣은 다음 직사광선을 차단한 실온에서 15분 동안 염색시킨 후 deionized water에서 2분 동안 세척하였다. 이후 Hematoxylin 용액으로 2분 동안 대비 염색을 시행하였으며, 물로 세척 후 건조시킨 다음 발색반응 결과를 현미경으로 관찰하였다.
- 자궁내막세포를 cover glass 위에서 배양 후 alkaline phosphatase kit (Sigma, St. Loise, MO, USA)를 사용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 먼저 배양액을 제거하고 PBS로 수세한 후 자궁내막세포 슬라이드를 Citrate-Aceton-Formaldehyde로 30초 동안 고정시킨 다음 deionized water에 45초 동안 부드럽게 세척하였다.
- 저자들은 줄기세포 여부를 평가하기 위해 in vitro에서 줄기세포의 형태학적 및 기능적 특징을 응용하여 평가하였으며, 보조적으로 줄기세포의 특징적 소견을 나타내는 세포들이 관찰될 때 줄기세포 표지자인 alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4 면역화학염색을 통하여 줄기세포 여부를 재확인하였다. 기존에 알려진 in vitro 평가방법을 일부 사용하지 못한 이유는 세포가 3 μm 미만의 극소형 크기이고, 부유세포와 부착세포가 활발하게 공존하며, 세포간 응집 및 새로운 분화세포 형성이 짧은 기간에도 매우 흔하여 기존의 방법으로는 한계가 있었다.
- 채취된 자궁내막세포들은 24시간 이내에 1 mm3 이하의 크기로 세절하고, 이후 digestion 용액 (DMEM/F-12 + 5% fetal bovine serum [FBS, Hyclone, Logan, UT, USA] + 0.2% collagenase [Invitrogen, Carlsbad, CA, USA]) 10 ml를 첨가한 후 20분마다 부드럽게 피펫팅하면서 5% CO2, 37℃ 환경에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 1,000 rpm 조건에서 10분간 원심분리를 시행하였으며, 회수된 세포들은 10% FBS, 1% penicillin/ streptomycin이 첨가된 DMEM/F-12 배지로 옮겨 배양을 시작하였다.
- 05% trypsin-EDTA (Invitrogen-Gibco) 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포의 일부는 10% FBS가 첨가된 DMEM/F-12 배지에서 다시 지속적으로 배양하면서 세포의 증식 양상을 관찰하였으며, 나머지 세포들은 percoll density gradient method 방법을 이용하여 극소형 추정줄기세포를 분리하였다.
대상 데이터
- 2009년 3월부터 9월까지 본원 산부인과를 방문한 25세에서 40세 사이의 가임기 여성 5명을 대상으로 하였다. 자궁내막세포는 기저층 조직을 포함시키기 위하여 초기 증식기의 자궁내막을 채취하였으며, 조직검사상 자궁내막증식증, 자궁내막암, 자궁내막용종과 같은 부인과 질환이 없는 것으로 판명된 여성의 자궁내막세포를 연구대상으로 하였다.
- 2009년 3월부터 9월까지 본원 산부인과를 방문한 25세에서 40세 사이의 가임기 여성 5명을 대상으로 하였다. 자궁내막세포는 기저층 조직을 포함시키기 위하여 초기 증식기의 자궁내막을 채취하였으며, 조직검사상 자궁내막증식증, 자궁내막암, 자궁내막용종과 같은 부인과 질환이 없는 것으로 판명된 여성의 자궁내막세포를 연구대상으로 하였다.
성능/효과
- 3 μm 미만의 극소형 추정줄기세포들을 percoll density gradient method로 분리시켜 배양해보면 줄기세포의 전형적인 특징인 자가재생과 비대칭 분열을 관찰할 수 있었다.
- 가임기 여성 5명의 자궁내막세포의 배양 결과는 모두 유사하였으며, 극소형 추정줄기세포의 분리 배양 시에는 세포의 농도가 높을수록 빠른 분화 현상이 일어나는 차이점을 나타내었다.
- 이 때 구형 세포 내에서 흔히 일어나는 과정은 마치 상실배, 배반포, 부화를 거치는 배아의 발달 과정과 흡사하였으며, 이주하는 도중 혹은 부착하는 과정 중에 주변여건에 따라 세포질이 잘 발달된 다양한 세포로 분화하였다 (Figure 2). 구형세포는 초기에는 세포들이 없는 장소로 이주하여 부착하였으며, 세포들이 배양접시를 가득 채울수록 극소원형세포들, 과다염색질 원형세포들 혹은 구형세포들끼리 서로 부착하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 이 때 면역화학염색을 시행해보면 극소형 추정줄기세포에서 유래하여 형성된 5~15 μm의 과다염색질 원형세포, 구형세포, 그리고 세포질이 발달된 지지세포들 모두에서 OCT-4, CXCR4 발색을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 극소형 추정줄기세포 그 자체에서 발색하는지는 세포의 크기가 너무 작아 정확히 판단하기 힘들었지만, 일부 지지세포나 구형세포 내에 존재하는 극소형 추정줄기세포들은 발색하는 것으로 관찰되었다.
- 이 중에서도 과다염색질 원형세포들과 구형세포들이 가장 강한 발색을 나타내었으며, 세포질이 잘 발달된 세포일수록 발색 정도가 약해졌다. 극소형 추정줄기세포 단독으로 각각 발색하는지는 크기가 너무 작아 정확히 판단하기 힘들었으나, 일부 지지세포나 구형세포 내에 존재하는 극소형 추정줄기세포들은 OCT-4, CXCR4 염색에서 발색을 나타내는 것으로 관찰되었다 (Figure 9).
- 배양 4일 이후에도 군집으로 남겨진 세포들은 핵이 진하고 세포질 발달이 거의 없는 원형세포들이었는데, 주로 적혈구보다 더욱 작은 3 μm 미만 극소형 추정줄기세포들과 5~15 μm 과다염색질 원형세포들 (hyperchromatic round cells)로 구성되어 있었다 (Figure 1B). 극소형 추정줄기세포들은 배양 초기에 군집성 세포군에 많이 포함되어 있다가 시간이 지날수록 배양접시에 전반적으로 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이 세포들은 지지세포 없이 단독으로 움직이거나 지지세포 위를 타고 이동하거나 지지세포 위에 부착되어 있었으며, 어떤 세포들은 다발적으로 존재하거나 점차 응집되어 구형세포 (sphere-shaped cells)를 형성하기도 하였다 (Figure 1C).
- 배양 1주일 이후, 초기에 군집성 세포들이 있었던 장소 위주로 자갈돌 모양의 세포군 형성을 관찰할 수 있었으며, 시간이 흐를수록 더욱 큰 군집을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 군집을 구성하는 세포들은 극소형 추정줄기세포들과 5~15 μm 과다염색질 원형세포들이 대부분이었다.
- 배양 2~4일 째, 다각형 과립모양의 상피세포들과 이질적 형태의 기질세포가 배양접시에 부착된 것을 관찰할 수 있었다. 배양 초기 기질세포들은 편평형, 원형, 원주형, 방추형, 아메바형, 별모양형 등으로 다양하게 관찰되었으며, 이후 지지세포들이 배양접시를 가득 채울수록 길쭉한 섬유아세포 유사세포들이 흔히 관찰되었다.
- 배양 과정 중 OCT-4, CXCR4 면역화학염색을 시행하여 각각의 세포들을 확인한 결과, 극소형 추정줄기세포가 응집되어 형성된 5~15 μm 과다염색질 원형세포, 10~20 μm 구형세포, 그리고 세포질이 발달된 지지세포들은 대부분 발색을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 이 때 면역화학염색을 시행해보면 극소형 추정줄기세포에서 유래하여 형성된 5~15 μm의 과다염색질 원형세포, 구형세포, 그리고 세포질이 발달된 지지세포들 모두에서 OCT-4, CXCR4 발색을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 배양 과정 중 OCT-4, CXCR4 면역화학염색을 시행하여 각각의 세포들을 확인한 결과, 극소형 추정줄기세포가 응집되어 형성된 5~15 μm 과다염색질 원형세포, 10~20 μm 구형세포, 그리고 세포질이 발달된 지지세포들은 대부분 발색을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이 중에서도 과다염색질 원형세포들과 구형세포들이 가장 강한 발색을 나타내었으며, 세포질이 잘 발달된 세포일수록 발색 정도가 약해졌다. 극소형 추정줄기세포 단독으로 각각 발색하는지는 크기가 너무 작아 정확히 판단하기 힘들었으나, 일부 지지세포나 구형세포 내에 존재하는 극소형 추정줄기세포들은 OCT-4, CXCR4 염색에서 발색을 나타내는 것으로 관찰되었다 (Figure 9).
- 이후 군집성 세포들 중 다수 관찰되는 3 μm 미만의 극소형 추정줄기세포들이 줄기세포인지를 다시 확인하기 위하여 percoll을 이용하여 분리 및 배양하였더니 자가재생, 세포 응집 및 구형세포 형성, 비대칭 분열, 군집 형성, 배아 체양 형성, 세포융합 혹은 핵의 재조합을 통한 새로운 분화세포 형성과 같은 줄기세포의 전형적인 특징들을 관찰할 수 있었다.
- 저자들은 먼저 자궁내막세포를 배양시켜 특징적으로 나타나는 군집성 세포들을 면역화학염색으로 확인하였는데, 이 세포들은 alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4 염색에서 강한 발색을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이후 군집성 세포들 중 다수 관찰되는 3 μm 미만의 극소형 추정줄기세포들이 줄기세포인지를 다시 확인하기 위하여 percoll을 이용하여 분리 및 배양하였더니 자가재생, 세포 응집 및 구형세포 형성, 비대칭 분열, 군집 형성, 배아 체양 형성, 세포융합 혹은 핵의 재조합을 통한 새로운 분화세포 형성과 같은 줄기세포의 전형적인 특징들을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 한편 극소형 추정줄기세포에서 유래한 지지세포들 중에서 섬유아세포 유사세포들이 가장 흔히 발견되는데, 이들 중 상당수가 중간엽줄기세포로 추정된다. 그 이유는 극소형 추정줄기세포들이 응집되어 구형세포를 형성하는 과정이 섬유아세포 유사세포 내에서 흔히 발견되며, 중간엽줄기세포도 OCT-4, CXCR4를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문인데, 향후 이에 대한 추가 확인 과정이 필요할 것으로 생각된다.9~11
- 이번 연구에서 발견된 자궁내막에 존재하는 극소형 추정줄기세포의 특성을 자세히 규명한다면, 자궁내막세포가 어떻게 다양한 조직으로 분화할 수 있는지를 이해할 수 있을 것으로 생각되며, 성체줄기세포를 이용한 재생 의학의 발전에도 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 더 나아가 자궁내막증, 자궁선근증, 자궁근종, 자궁내막증식증, 자궁내막암과 같은 증식성 자궁내막질환을 이해하는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이번 연구에서 발견된 자궁내막에 존재하는 극소형 추정줄기세포의 특성을 자세히 규명한다면, 자궁내막세포가 어떻게 다양한 조직으로 분화할 수 있는지를 이해할 수 있을 것으로 생각되며, 성체줄기세포를 이용한 재생 의학의 발전에도 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 더 나아가 자궁내막증, 자궁선근증, 자궁근종, 자궁내막증식증, 자궁내막암과 같은 증식성 자궁내막질환을 이해하는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
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