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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 xylose로 유전자 발현을 유도하여 외래의 단백질을 생산하는 대장균 발현벡터를 구축하기 위하여 양방향으로 발현되는 xylAF 프로모터중 xylA 유전자 쪽으로 발현되는 프로모터(xylA 프로모터)를 분리하여 xylose 존재 하에서 xylA 프로모터에 의한 유전자 발현 수준을 확인하였다. 이러한 벡터를 구축하기 위한 골격 플라스미드로 세포 내에 500~700 복제수를 가진 pUC18을 선택하여 목적단백질을 대량 생산할 수 있는 벡터의 개발을 시도하였다. 우선 600 bp의 xylA 프로모터를 pUC18에 삽입하여 xylose존재 하에서 xylA 프로모터에 의하여 발현되는 벡터 pXA600을 구축하고 lacZ 구조유전자를 연결하여 xylose 유도 하에서 발현되는 βgalactosidase의 활성을 측정하여 이 벡터의 발현 수준을 조사하였다.
- 또한 현재까지 외래 유전자의 발현을 위해 제작된 대장균 발현벡터는 대부분 유도성인 대장균 유래의 프로모터로써 lac[Gronenborn, 1976], trc 및 tac[Brosius 등, 1985], araBAD[Guzman 등, 1995] 프로모터 등을 이용한 발현벡터와 대장균에 감염하는 파아지 유래의 λPL[Elvin 등, 1990] 및 T7 RNA polymerase[Studier 와 Moffatt, 1986] 프로모터을 이용하여 개발되었다. 이에 본 연구에서는 xylose로 유전자 발현을 유도하여 외래의 단백질을 생산하는 대장균 발현벡터를 구축하기 위하여 양방향으로 발현되는 xylAF 프로모터중 xylA 유전자 쪽으로 발현되는 프로모터(xylA 프로모터)를 분리하여 xylose 존재 하에서 xylA 프로모터에 의한 유전자 발현 수준을 확인하였다. 이러한 벡터를 구축하기 위한 골격 플라스미드로 세포 내에 500~700 복제수를 가진 pUC18을 선택하여 목적단백질을 대량 생산할 수 있는 벡터의 개발을 시도하였다.
제안 방법
- 600 bp의 xylA프로모터 영역을 pUC18에 삽입하고자 AatII와 HindIII-NheI-NdeI 제한인식 서열이 삽입된 정방향 및 역방향 프라이머(정방향, 5'- GGCGACGTCCTCGAGCGGTTTATCATGTTTTCA-3'; 역방향, 5'-CCCAAGCTTGCTAGCCATATGATTGAACTCCATAATC AG-3')를 각각 사용하여 대장균 K802의 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭하였다.
- Xylanase의 활성을 측정하기 위하여 100 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 200 µL와 배양 상징액 200 µL 그리고 1.0% xylan 용액 400 µL를 혼합하여 60℃에서 20 분간 반응시킨 후 dinitrosalicylic acid(DNS)용액[Miller, 1959] 800µL를 가하여 효소반응을 정지시키고 생성된 환원당을 정량하였다.
- Shin의 보고[2001]에 의하면 xylA 프로모터는 xylF 프로모터보다 2배 정도 높은 발현 강도를 나타내고 발현의 조절도 xylose 유도 시에만 발현되고 xylose가 존재하지 않으면 전사가 강하게 억제된다. xylA 프로모터 영역을 pUC18에 삽입하고자 대장균 K802의 염색체 DNA를 주형으로 하여 600 bp의 xylA 프로모터를 PCR로 증폭하였다(Fig.1). Shin[2001]은 xylA 유전자의 개시코돈으로부터 시작하여 60 bp는 XylR 조절단백질이 결합하여 조절작용을 하는 주요한 부위라는 것을 확인하였으며 XylR dimer에 의한 looping repression 현상이 일어나는 주요 부위로 추정하였다.
- xylA 프로모터에 의한 유전자 발현 수준을 측정하기 위하여 리포터 유전자로서 β-galactosidase 유전자인 lacZ를 선택하였다.
- 정제한 증폭산물과 pXA600을 제한효소 NdeI과 HindIII으로 절단하여 pXA600의 xylA 프로모터 하류에 연결하고, 이 플라스미드를 pXA600-xynA 로 명명하였다. xylR 유전자를 함유한 벡터 pXAR600에 외래 유전자인 xynA 유전자를 삽입하여 유전자 발현 수준을 조사하기 위하여 xynA 유전자를 NheI과 HindIII 제한효소 인식 서열이 각각 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하여 pXAR600의 xylA 프로모터 하류에 연결하여 플라스미드 pXAR600-xynA를 제작하였다(data not shown).
- 플라스미드 pXA600과 pXAR600에서 β-galactosidase 발현 양상. 구축한 pXA600와 pXAR600의 NheI와 XbaI 사이에 lacZ를 연결하여 pXA600-lacZ와 pXAR600-lacZ를 각각 제작하여 대장균 JM109에 형질전환 하였다. 형질전환된 균주 pXA600-lacZ/JM109와 pXAR600-lacZ/JM109를 ampicillin이 포함된(100 µg/mL) LB배지에 3시간동안 전배양한 후 xylose가 0.
- 대장균의 배양 및 보존을 위한 배지로는 Luria-Bertani 배지[LB배지; Bertani와 Weigle, 1953]를 사용하였고 필요에 따라 ampicillin을 각각 최종농도 100 µg/mL 되게 첨가하여 사용하였다.
- 1). 따라서 60 bp의 xylA 구조유전자를 포함하지 않고 xylF 유전자의 개시코돈으로부터 235 bp 지점까지의 부위를 포함한 총 600 bp의 프로모터 영역을 AatII와 HindIII-NheI-NdeI 제한효소 인식 서열이 삽입된 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이 후 pUC18의 AatII와 HindIII 절단 부위에 600 bp의 xylA 프로모터를 삽입하여 pXA600을 구축하였다.
- 또한 DM배지(0.7% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.05% trisodium citrate·2H2O, 0.01% MgSO4·7H2O, 0.1% (NH4)2SO4, 0.5% glycerol)에서 대장균을 배양할 때는 37℃에서 6시간 동안 전배양한 후 xylose를 0.5%가 되도록 첨가하여 같은 온도에서 4시간 유도배양 하였다.
- 우선 600 bp의 xylA 프로모터를 pUC18에 삽입하여 xylose존재 하에서 xylA 프로모터에 의하여 발현되는 벡터 pXA600을 구축하고 lacZ 구조유전자를 연결하여 xylose 유도 하에서 발현되는 βgalactosidase의 활성을 측정하여 이 벡터의 발현 수준을 조사하였다. 또한 xylose 오페론의 조절유전자인 xylR 유전자를 동일 발현벡터인 pXA600에 삽입하여 xylA 프로모터의 발현수준을 조사하였다. 외래 유전자인 Streptomyces thermocyaneoviolaceus의 내열성 xylanase를 코딩하는 xynA 유전자를 실제로 구축된 벡터에 발현시켜 새로운 xylose 유도성 발현벡터로서의 가능성을 확인하였다.
- thermocyaneoviolaceus KCCM4009의 xynA 유전자를 NdeI와 HindIII 제한효소 인식 서열이 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 사용하여 증폭하여 구축된 pXA600 의 MCS에 삽입하여 발현되는 내열성 xylanase의 활성을 측정하였다. 또한 xynA 유전자를 NheI와 HindIII 제한효소 인식 서열이 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 사용하여 증폭하여 구축된 pXAR600 의 MCS에 삽입하여 발현되는 내열성 xylanase의 활성을 측정하였다. 먼저 구축된 pXA600-xynA과 pXAR600-xynA를 대장균 JM109에 형질전환 하여 xylanase 의 활성을 측정한 결과 xlyose로 유도한 경우와 유도하지 않은 경우 모두 배양 상징액에 활성이 나타나지 않았으나 균체를 파쇄한 경우에 전자에서 미미한 xylanase의 활성이 나타났다(data not shown).
- 한편 pXA600에 조절유전자인 xylR을 삽입하면 유전자 발현율을 더 높일 수 있다는 사실을 확인하였다. 또한 외래 유전자인 S. thermocyaneoviolaceus의 내열성 xylanase를 코딩하는 xynA 유전자를 실제로 구축된 pXA600 및 pXAR600에서 발현시켜 값싼 오단당인 xylose를 유도물질로 사용할 수 있는 발현 벡터를 개발 하였다.
- 2). 또한 조절인자인 XylR 단백질의 영향을 확인하기 위하여 자신의 프로모터를 함유한 1,988 bp의 xylR 유전자[Shin, 2001]를 분리하여 pXA600의 multiple cloning site(MCS) 하류의 Pvu 절단부위에 삽입하여 pXAR600를 제작하고 여기에 위와 같은 방식으로 xylA프로모터 하류에 lacZ 구조유전자를 삽입하여 pXAR600-lacZ를 제작하였다(Fig. 2). 외래 유전자의 발현을 확인하기 위하여 S.
- 이렇게 정교한 조절을 받는 arabinose 유도성 프로모터와 조절유전자로 제작된 벡터는 미국의 Invitrogen사(Carlsbad, CA)에 의하여 pBAD expression system이라는 이름으로 상품화되어 현재 전 세계에서 널리 사용되고 있다. 본 연구에서는 우선 600 bp의 xylA 프로모터를 pUC18에 삽입하여 xylose존재 하에서 xylA 프로모터에 의하여 발현되는 벡터 pXA600을 구축하고 lacZ 유전자를 연결하여 xylose 유도하에서 과발현되는 β-galactosidase의 활성을 확인하였다. 한편 pXA600에 조절유전자인 xylR을 삽입하면 유전자 발현율을 더 높일 수 있다는 사실을 확인하였다.
- 플라스미드 pXA600과 pXAR600에서 외래의 내열성 xylanase 유전자의 발현. 외래 유전자 발현의 실례로써 S. thermocyaneoviolaceus KCCM4009의 xynA 유전자를 NdeI와 HindIII 제한효소 인식 서열이 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 사용하여 증폭하여 구축된 pXA600 의 MCS에 삽입하여 발현되는 내열성 xylanase의 활성을 측정하였다. 또한 xynA 유전자를 NheI와 HindIII 제한효소 인식 서열이 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 사용하여 증폭하여 구축된 pXAR600 의 MCS에 삽입하여 발현되는 내열성 xylanase의 활성을 측정하였다.
- 2). 외래 유전자의 발현을 확인하기 위하여 S. thermocyaneoviolaceus KCCM4009의 xynA 유전자를 NdeI과 HindIII 제한효소 인식 서열이 각각 삽입된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 정제한 증폭산물과 pXA600을 제한효소 NdeI과 HindIII으로 절단하여 pXA600의 xylA 프로모터 하류에 연결하고, 이 플라스미드를 pXA600-xynA 로 명명하였다.
- 우선 600 bp의 xylA 프로모터를 pUC18에 삽입하여 xylose존재 하에서 xylA 프로모터에 의하여 발현되는 벡터 pXA600을 구축하고 lacZ 구조유전자를 연결하여 xylose 유도 하에서 발현되는 βgalactosidase의 활성을 측정하여 이 벡터의 발현 수준을 조사하였다.
- 따라서 60 bp의 xylA 구조유전자를 포함하지 않고 xylF 유전자의 개시코돈으로부터 235 bp 지점까지의 부위를 포함한 총 600 bp의 프로모터 영역을 AatII와 HindIII-NheI-NdeI 제한효소 인식 서열이 삽입된 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이 후 pUC18의 AatII와 HindIII 절단 부위에 600 bp의 xylA 프로모터를 삽입하여 pXA600을 구축하였다. 이후 XylR 단백질의 영향을 보기 위하여 구축된 pXA600에 자신의 프로모터가 함유된 1,988 bp의 xylR 유전자를 pXA600의 PvuII 절단부위에 xylA프로모터의 전사방향과 반대 방향으로 삽입하여 pXAR600을 구축하였다(Fig.
- 이렇게 증폭한 600 bp의 xylA 프로모터를 AatII, HindIII로 절단하여 같은 제한효소로 절단된 pUC18에 연결하고 E. coli DH5α에 형질전환 하였다.
- 이를 원심집균한 후 효소를 추출하여 재료 및 방법에서 기술한 방법에 따라 β-galactosidase 활성 측정을 실시하였다.
- 이 후 pUC18의 AatII와 HindIII 절단 부위에 600 bp의 xylA 프로모터를 삽입하여 pXA600을 구축하였다. 이후 XylR 단백질의 영향을 보기 위하여 구축된 pXA600에 자신의 프로모터가 함유된 1,988 bp의 xylR 유전자를 pXA600의 PvuII 절단부위에 xylA프로모터의 전사방향과 반대 방향으로 삽입하여 pXAR600을 구축하였다(Fig. 2).
- thermocyaneoviolaceus KCCM4009의 xynA 유전자를 NdeI과 HindIII 제한효소 인식 서열이 각각 삽입된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 정제한 증폭산물과 pXA600을 제한효소 NdeI과 HindIII으로 절단하여 pXA600의 xylA 프로모터 하류에 연결하고, 이 플라스미드를 pXA600-xynA 로 명명하였다. xylR 유전자를 함유한 벡터 pXAR600에 외래 유전자인 xynA 유전자를 삽입하여 유전자 발현 수준을 조사하기 위하여 xynA 유전자를 NheI과 HindIII 제한효소 인식 서열이 각각 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하여 pXAR600의 xylA 프로모터 하류에 연결하여 플라스미드 pXAR600-xynA를 제작하였다(data not shown).
- 4). 최소배지에서의 발현수준을 알아보기 위하여 DM배지에 xylose와 그 대조군으로서 glycerol을 최종 0.5%가 되도록 첨가하여 유도배양 하였다. DM 최소배지에서 pXA600-lacZ/JM109에 대한 β-galactosidase의 활성도를 측정한 결과 xylose로 유도한 경우 β-galactosidase의 활성은 6,282 unit 이었으며 유도하지 않은 경우는 1,017 unit이었다.
- 형질전환된 균주 pXA600-lacZ/JM109와 pXAR600-lacZ/JM109를 ampicillin이 포함된(100 µg/mL) LB배지에 3시간동안 전배양한 후 xylose가 0.5% 되도록 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 유도배양 하였다.
대상 데이터
- coli K802 [Wood, 1966]의 염색체 DNA를 주형으로 사용하였으며 리포터 유전자인 lacZ 구조유전자의 증폭에는 프로모터 검색 벡터인 pMC1403[Casadaban, 1980]을 사용하였다. 내열성 xylanase유전자인 xynA 유전자의 증폭을 위하여는 S. thermocyaneoviolaceus KCCM40049[Lee, 2000; Choi 등, 2006]의 염색체 DNA를 주형으로 사용하였으며, xynA의 발현을 위한 숙주세포로는 E. coli BLR(DE3)를 사용하였다(Novagen, Madison, WI).
- 플라스미드 pXA600와 pXAR600의 제작. 600 bp의 xylA프로모터 영역을 pUC18에 삽입하고자 AatII와 HindIII-NheI-NdeI 제한인식 서열이 삽입된 정방향 및 역방향 프라이머(정방향, 5'- GGCGACGTCCTCGAGCGGTTTATCATGTTTTCA-3'; 역방향, 5'-CCCAAGCTTGCTAGCCATATGATTGAACTCCATAATC AG-3')를 각각 사용하여 대장균 K802의 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭하였다.
이론/모형
- The activity of β-galactosidase was determined by Miller’s method (Miller, 1972).
- The activity of β-galactosidase was determined by Miller’s method [Miller, 1972].
- 단백질의 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE)은 Laemmli의 방법[1970]에 준하여 수행하였다.
- coli JM109[Yanisch-Perron등, 1985]를 사용하였다. 본 실험에서 구축한 플라스미드 벡터들은 고복제수 클로닝 벡터인 pUC18[Yanisch-Perron 등, 1985]을 기본골격으로 하여 제작하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 xylA 프로모터 영역의 증폭에는 E.
- 플라스미드의 추출과 형질전환은 Sambrook 등의 방법[1989]에 따라 수행하였으며 형질전환을 위한 competent cell은 Inoue 등의 방법[1991]에 따라 준비하였다. 염색체 DNA의 추출은 Ausubel등의 방법[1992]에 따라 수행하였다.
- 본 실험에서 구축한 플라스미드 벡터들은 고복제수 클로닝 벡터인 pUC18[Yanisch-Perron 등, 1985]을 기본골격으로 하여 제작하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 xylA 프로모터 영역의 증폭에는 E. coli K802 [Wood, 1966]의 염색체 DNA를 주형으로 사용하였으며 리포터 유전자인 lacZ 구조유전자의 증폭에는 프로모터 검색 벡터인 pMC1403[Casadaban, 1980]을 사용하였다. 내열성 xylanase유전자인 xynA 유전자의 증폭을 위하여는 S.
- 프로모터의 발현강도 측정을 위한 βgalactosidase의 활성은 Miller의 방법[Miller, 1972]에 준하여 다음과 같이 측정하였다.
- 플라스미드의 추출과 형질전환은 Sambrook 등의 방법[1989]에 따라 수행하였으며 형질전환을 위한 competent cell은 Inoue 등의 방법[1991]에 따라 준비하였다. 염색체 DNA의 추출은 Ausubel등의 방법[1992]에 따라 수행하였다.
- 형질전환용 대장균으로는 Escherichia coli DH5α[Hanahan, 1983]를 사용하였고, 구축된 발현 벡터를 도입할 균주로는 E. coli JM109[Yanisch-Perron등, 1985]를 사용하였다.
성능/효과
- LB 배지에서 pXA600-lacZ/JM109와 pXAR600-lacZ/JM109에 대한 β-galactosidase의 활성도를 측정한 결과 pXA600-lacZ/ JM109의 경우 xylose로 유도한 경우 β-galactosidase의 활성은 1,641 unit이었으며 유도하지 않은 경우는 264 unit이었다.
- Xylose로 유도한 pXA600-lacZ/JM109에서 β-galactosidase의 발현 증가를 SDS-PAGE를 통해서 확인한 결과 xylose로 유도한 경우 116 kDa 부근에서 β-galactosidase의 밴드를 확인하였다(Fig. 3).
- thermocyaneoviolaceus KCCM4009의 xynA유전자를 성공적으로 발현 시킨바 있으며 xylanase가 세포 외로 분비되는 것을 확인하였다. pXA600-xynA와 pXAR600-xynA를 대장균 BLR(DE3)로 형질전환한 후 xylanase의 활성을 측정한 결과 LB배지에서 xylose로 유도를 하였을 때 각각 5.4 및 8.1 unit/ mL로 나타났으며, 유도하지 않았을 때 각각 1.3 및 1.7 unit/mL로 나타났다(Fig. 6.). 이로서 외래 유전자인 xynA가 pXA600및 pXAR600 플라스미드 벡터에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
- xylR 유전자를 동일 벡터에 함유한 pXAR600-lacZ/JM109의 β-galactosidase활성이 벡터에 xylR 유전자를 함유하지 않은 pXA600-lacZ/JM109보다 LB배지와 DM배지에서 모두 더 높은 활성을 보였다.
- 또한 xynA 유전자를 NheI와 HindIII 제한효소 인식 서열이 부가된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 사용하여 증폭하여 구축된 pXAR600 의 MCS에 삽입하여 발현되는 내열성 xylanase의 활성을 측정하였다. 먼저 구축된 pXA600-xynA과 pXAR600-xynA를 대장균 JM109에 형질전환 하여 xylanase 의 활성을 측정한 결과 xlyose로 유도한 경우와 유도하지 않은 경우 모두 배양 상징액에 활성이 나타나지 않았으나 균체를 파쇄한 경우에 전자에서 미미한 xylanase의 활성이 나타났다(data not shown). 또한 congo red를 이용해 xylan 함유 LB 평판배지 상에서 xylan 분해환 시험에서 분해환을 보이지 않았다(data not shown).
- 또한 xylose 오페론의 조절유전자인 xylR 유전자를 동일 발현벡터인 pXA600에 삽입하여 xylA 프로모터의 발현수준을 조사하였다. 외래 유전자인 Streptomyces thermocyaneoviolaceus의 내열성 xylanase를 코딩하는 xynA 유전자를 실제로 구축된 벡터에 발현시켜 새로운 xylose 유도성 발현벡터로서의 가능성을 확인하였다.
- xylR 유전자를 동일 벡터에 함유한 pXAR600-lacZ/JM109의 β-galactosidase활성이 벡터에 xylR 유전자를 함유하지 않은 pXA600-lacZ/JM109보다 LB배지와 DM배지에서 모두 더 높은 활성을 보였다. 이 결과로 보아 XylR 단백질은 xylA 프로모터상에서 촉진제(activator)로서 양의 조절을 하며, 단백질의 더 많은 발현을 위해서는 xylR 유전자가 함유된 pXAR600 벡터가 더 좋은 것으로 생각된다.
- ). 이로서 외래 유전자인 xynA가 pXA600및 pXAR600 플라스미드 벡터에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다. 외래의 내열성 xylanase 유전자가 대장균 JM109에서 발현이 잘 되지 않았던 이유는 신호배열 펩티드가 정확하게 processing되지 않았거나 혹은 대장균 BLR(DE3)의 경우 외래 단백질의 발현 숙주로서 외막(outer membrane) 단백질인 ompT protease[Stumpe등, 1998]가 제거되어 있으나 대장균 JM109에서는 ompT protease가 존재하기 때문인 것으로 추측 된다.
- coli DH5α에 형질전환 하였다. 재조합된 플라스미드를 추출하여 염기서열분석을 실시하여 xylA 프로모터가 맞게 삽입되었음을 확인하고 이를 pXA600이라 명명하였다(Fig. 2). xylA 프로모터에 의한 유전자 발현 수준을 측정하기 위하여 리포터 유전자로서 β-galactosidase 유전자인 lacZ를 선택하였다.
- 본 연구에서는 우선 600 bp의 xylA 프로모터를 pUC18에 삽입하여 xylose존재 하에서 xylA 프로모터에 의하여 발현되는 벡터 pXA600을 구축하고 lacZ 유전자를 연결하여 xylose 유도하에서 과발현되는 β-galactosidase의 활성을 확인하였다. 한편 pXA600에 조절유전자인 xylR을 삽입하면 유전자 발현율을 더 높일 수 있다는 사실을 확인하였다. 또한 외래 유전자인 S.
후속연구
- 오탄당인 xylose를 대사하는 xylose 오페론의 프로모터인 xylAF 프로모터는 xylose에 의해 유도되며 XylR 단백질이 발현수준을 조절해준다. 이는 xylAF 프로모터와 XylR 단백질을 이용하여 유용한 발현 벡터의 개발에 응용될 수 있는 가능성을 암시한다. 또한 현재까지 외래 유전자의 발현을 위해 제작된 대장균 발현벡터는 대부분 유도성인 대장균 유래의 프로모터로써 lac[Gronenborn, 1976], trc 및 tac[Brosius 등, 1985], araBAD[Guzman 등, 1995] 프로모터 등을 이용한 발현벡터와 대장균에 감염하는 파아지 유래의 λPL[Elvin 등, 1990] 및 T7 RNA polymerase[Studier 와 Moffatt, 1986] 프로모터을 이용하여 개발되었다.
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